劉小云，李　路，李庚儒，舒　琦，豐麗媛，林先剛，徐亞靜，劉自兵,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥　230038)

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·針灸經(jīng)絡(luò)·

電針“肺俞”穴對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠迷走神經(jīng)放電的影響

劉小云1，李路1，李庚儒2，舒琦1，豐麗媛1，林先剛1，徐亞靜1，劉自兵1,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀(guān)察電針“肺俞”穴對(duì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)大鼠迷走神經(jīng)放電的影響，初步探討針刺治療COPD的作用機(jī)制。方法隨機(jī)將40只SD大鼠分為正常組、正常電針組、模型組、模型電針組，后兩組以香煙煙熏結(jié)合脂多糖氣管滴注法復(fù)制COPD模型。觀(guān)察各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和血漿中乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)的含量，并取正常電針組、模型電針組大鼠的“肺俞”穴進(jìn)行即刻電針治療，觀(guān)察電針前后大鼠迷走神經(jīng)放電情況。結(jié)果與電針前比較，正常電針組和模型電針組大鼠電針后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度均顯著增加(P<0.05)，模型電針組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度差值顯著大于正常電針組(P<0.05)。ACh在外周血漿中含量變化為：模型組顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組顯著高于正常電針組但顯著低于模型組(P<0.05)。ACh在BALF中含量變化為：正常電針組顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組顯著高于正常電針組和模型組(P<0.05)。結(jié)論電針“肺俞”穴可使COPD大鼠迷走神經(jīng)放電增強(qiáng)，并促進(jìn)肺局部ACh遞質(zhì)的釋放。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾病；電針；肺俞；迷走神經(jīng)；乙酰膽堿

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特點(diǎn)，氣流受限呈進(jìn)行性加重，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。其因患病率高、漸進(jìn)性發(fā)展、病死率高、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等特點(diǎn)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]。作為當(dāng)今臨床中較為難治的一種呼吸系統(tǒng)疾病，亟需尋找出可行有效的治療方法。針刺療法是中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)和特色，在對(duì)COPD的治療中早有應(yīng)用，其中“肺俞”穴為臨床治療COPD使用頻次最高的穴位[3]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)針刺的抗炎作用與膽堿能抗炎通路存在密切聯(lián)系[4]，這條抗炎途徑以迷走神經(jīng)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)及其特異性受體為基礎(chǔ)，在調(diào)控炎癥方面具有迅速、直接、高效的特點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)以迷走神經(jīng)為切入點(diǎn)，觀(guān)察電針“肺俞”穴對(duì)COPD大鼠迷走神經(jīng)放電的影響及其神經(jīng)遞質(zhì)ACh含量的變化，旨在闡釋針刺干預(yù)COPD的作用機(jī)制，為針刺防治COPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為250～300 g，由江蘇省常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇)2011-0003。動(dòng)物于室溫環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，被隨機(jī)分為正常組(未經(jīng)處理的空白大鼠)、正常電針組(空白大鼠+電針“肺俞”穴)、模型組(COPD模型大鼠)、模型電針組(COPD模型大鼠+電針“肺俞”穴)，每組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及儀器紅三環(huán)香煙(安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；焦油含量8 mg，煙氣煙堿含量0.4 mg，二氧化碳含量13 mg)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)：Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào) 20150305；大鼠ACh酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)試劑盒：R&D公司，批號(hào) E-30165；混合麻醉藥：由α-氯醛糖(德國(guó)默克公司生產(chǎn)，批號(hào) 52408)、烏拉坦(上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) 20090406)和硼砂(江蘇省揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) 20090103)組成；RT-6000型酶標(biāo)儀：雷杜生命科學(xué)股份有限公司。BL-420S型生物機(jī)能采集系統(tǒng)：四川省成都泰盟科技公司；華佗牌SDZ-Ⅴ型多功能電針治療儀：江蘇省蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)。

2　方法

2.1COPD動(dòng)物模型復(fù)制利用香煙熏吸加氣管滴注LPS復(fù)制COPD大鼠模型[6]。大鼠于第1天、第14天向氣管內(nèi)注入LPS 1 mg/kg。第2天將大鼠置入1 m3自制煙熏箱內(nèi)，以紅三環(huán)香煙每日煙熏1 h，持續(xù)1個(gè)月。

2.2迷走神經(jīng)放電記錄以7 mL/kg劑量的混合麻醉藥對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，鈍性分離大鼠頸部左側(cè)迷走神經(jīng)，用周邊肌肉和皮膚做好皮兜，充以預(yù)熱37 ℃的石蠟油，給予迷走神經(jīng)保護(hù)，將迷走神經(jīng)勾掛于氯化銀電極(直徑0.7 mm，電阻小于1 Ω，四川省成都泰盟科技公司)上，連接導(dǎo)線(xiàn)至生物功能采集系統(tǒng)，打開(kāi)軟件，進(jìn)行迷走神經(jīng)放電原始信號(hào)記錄，采集指標(biāo)為放電頻率、面積和幅度。

2.3穴位即刻電針刺激大鼠仰臥位于自制的鏤空網(wǎng)格的鼠板上，取大鼠背部雙側(cè)“肺俞”穴(第2胸椎棘突最高點(diǎn)作為標(biāo)志，向下順摸第3胸椎棘突下旁開(kāi)7 mm[7])，將直徑0.25 mm、長(zhǎng)13 mm的一次性無(wú)菌針灸針刺入穴位，針柄以導(dǎo)線(xiàn)連接多功能電針治療儀，參數(shù)采用4/20 Hz頻率，電流2 mA，以引起大鼠背部皮膚輕微抖動(dòng)為宜，針刺持續(xù)30 min，電針后記錄大鼠迷走神經(jīng)放電情況。

2.4取材血漿采集：電生理記錄完成后，采集大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的抽?。翰裳?，開(kāi)胸，充分暴露肺臟，用注射器插入氣管插管上端，取6 mL生理鹽水反復(fù)3次灌洗支氣管及肺泡，回抽灌洗液置于離心管，按上述方法離心。所得血漿及BALF于-20 ℃存放。

2.5ACh含量檢測(cè)參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，主要包含以下步驟：①包被抗原；②加封閉液；③加被檢血漿；④加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG；⑤加底物；⑥加終止液；⑦用酶標(biāo)儀記錄490 nm讀數(shù)。

3　結(jié)果

3.1電針“肺俞”穴對(duì)各組大鼠頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積、幅度的影響與電針前比較，正常電針組和模型電針組大鼠電針后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度均顯著增加(P<0.05)，模型電針組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度差值顯著大于正常電針組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠電針前后頸部左側(cè)迷走神經(jīng)放電頻率、面積和幅度比較±s)

注：與同組電針前比較，*P<0.05；與正常電針組比較，#P<0.05。

3.2各組大鼠ACh含量的變化含有一個(gè)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的三因素方差分析結(jié)果顯示，檢測(cè)部位因素、模型因素和電針因素對(duì)ACh水平的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，檢測(cè)部位、模型因素和電針因素的交互作用也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2和表3，故以簡(jiǎn)單效應(yīng)分析為主。模型組血漿ACh水平和正常電針組BALF中ACh水平顯著高于正常組(P<0.05)，模型電針組BALF中ACh水平顯著高于模型組和正常電針組(P<0.05)，模型電針組血漿ACh水平顯著高于正常電針組(P<0.05)，但顯著低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，電針“肺俞”穴可增加BALF中ACh含量而降低血漿ACh含量；電針“肺俞”穴對(duì)COPD病理狀態(tài)下大鼠ACh合成、釋放的調(diào)節(jié)作用更明顯。

表2　模型因素和電針因素對(duì)血漿和BALF中ACh水平影響的方差分析結(jié)果(被試內(nèi)因素分析)

表3　模型因素和電針因素對(duì)血漿和BALF中ACh水平影響的方差分析結(jié)果(被試間因素分析)

表4　各組大鼠血漿和BALF中ACh水平比較

注：與正常組比較，△P<0.05；與正常電針組比較，*P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

4　討論

迷走神經(jīng)是混合型腦神經(jīng)(第Ⅹ對(duì)腦神經(jīng))，行程長(zhǎng)，分布范圍廣。在生理狀態(tài)下，迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)氣道張力、血液供應(yīng)、黏液分泌及呼吸形式等。迷走神經(jīng)興奮時(shí)，可導(dǎo)致氣管平滑肌收縮[8]。但近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)傳出纖維具有抗炎作用，可以降低局部炎性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥的調(diào)控[9]。

近年來(lái)，針刺和迷走神經(jīng)的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)。葉小豐等[10]通過(guò)電針“足三里”穴發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)傳出纖維放電增加。但若雙側(cè)腹腔迷走神經(jīng)預(yù)先被切斷，電針足三里對(duì)迷走神經(jīng)的干預(yù)作用將明顯減弱或消失[11]。劉麗芝等[12]發(fā)現(xiàn)針刺“神門(mén)”穴可使迷走神經(jīng)興奮，增強(qiáng)自主神經(jīng)的整合功能，減緩心率。而在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)電針的即刻效應(yīng)的觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)電針“肺俞”穴也可使大鼠迷走神經(jīng)放電增強(qiáng)。電針“肺俞”穴后正常組和模型組大鼠迷走神經(jīng)放電的頻率、面積、幅度均有增長(zhǎng)，且模型組更甚。表明電針“肺俞”穴可激活迷走神經(jīng)，且在COPD狀態(tài)下其效應(yīng)更明顯。羅麗平等[13]觀(guān)察電針對(duì)心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)的即刻效應(yīng)和后效應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)即刻調(diào)節(jié)作用是以迷走神經(jīng)興奮為主，但取針后心迷走和心交感神經(jīng)張力變化不顯著。而電針則引起交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)興奮，取針后心交感神經(jīng)興奮占主導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)已觀(guān)察到電針有興奮迷走神經(jīng)的即刻效應(yīng)，但電針是否也興奮交感神經(jīng)，使兩者在對(duì)支氣管平滑肌的調(diào)節(jié)上達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡，尚需進(jìn)一步研究。

課題組前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，針刺治療可以減輕COPD模型大鼠病理特征和改善肺通氣功能[14]，針刺“足三里”穴可以下調(diào)肺組織白細(xì)胞介素-1β及血漿白細(xì)胞介素-6的含量，抑制肺組織炎性反應(yīng)[15]。推測(cè)電針“肺俞”穴興奮迷走神經(jīng)，促進(jìn)ACh合成、釋放，與電針抗炎反應(yīng)有關(guān)。2000年，Borovikova提出“膽堿能抗炎通路”的概念[16]，即迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)可抑制巨噬細(xì)胞的活化，在抗炎反應(yīng)過(guò)程中有重要作用。關(guān)于激活迷走神經(jīng)，促進(jìn)遞質(zhì)合成、釋放并參與抗炎治療疾病的研究被人們廣泛關(guān)注。2015年有研究發(fā)現(xiàn)，在刺激犬右側(cè)迷走神經(jīng)干后，其心肌缺血再灌注損傷降低，機(jī)制為通過(guò)激活迷走神經(jīng)的膽堿能抗炎通路，抑制全身和局部的炎性反應(yīng)[17]。已有實(shí)驗(yàn)證明，電刺激迷走神經(jīng)可明顯改善肺組織的通氣功能，減輕感染性休克時(shí)肺組織的損傷，具有潛在的保護(hù)肺臟的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)正常和模型大鼠經(jīng)電針后BALF中ACh含量均明顯升高，與迷走神經(jīng)放電增強(qiáng)的結(jié)果一致。但電針興奮迷走神經(jīng)活動(dòng)、增加ACh釋放的作用是否在短時(shí)間能改善肺局部應(yīng)激或炎癥環(huán)境尚缺乏直接證據(jù)。另外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在外周血漿中，模型大鼠比正常大鼠ACh含量增高，而正常大鼠和模型大鼠電針后ACh含量均有降低。已有研究發(fā)現(xiàn)，ACh能在人全血中抑制LPS所誘導(dǎo)的炎性遞質(zhì)的釋放[19]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫驛Ch含量增高，推測(cè)可能與其在病理狀態(tài)下的代償性增高并參與抑制炎癥有關(guān)，鑒于A(yíng)Ch在全身及局部的復(fù)雜功能，對(duì)即刻針刺可下調(diào)血漿中ACh含量的原因尚需作更深入的研究。

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作者簡(jiǎn)介：劉小云(1993-)，女，本科生

通信作者：劉自兵，zibingliu@163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R563.3；R224[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.015

(收稿日期：2015-12-04；編輯：姚實(shí)林)

Effect of Electroacupuncture at Feishu Point on Vagus Nerve Discharge in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

LIUXiao-yun1,LILu1,LIGeng-ru2,SHUQi1,FENGLi-yuan1,LINXian-gang1,XUYa-jing1,LIUZi-bing1,3

(1.ClinicalCollegeofAcupunctureandOrthopedics,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 3.InstituteofAcupunctureandMeridian,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture (EA) at Feishu point on vagus nerve discharge in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the mechanism of action of acupuncture in the treatment of COPD. MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, EA normal group, model group, and EA model group. The rats in the latter two groups were treated with cigarette smoke combined with intratracheal instillation of lipopolysaccharide to establish the rat model of COPD. The content of acetylcholine (ACh) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and plasma was determined. The rats in the EA normal group and the EA model group were treated with EA at Feishu point, and vagus nerve discharge was observed before and after EA. ResultsThe EA normal group and the EA model group showed significant increases in discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck after EA (P<0.05), and the EA model group showed significantly higher discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck than the EA normal group (P<0.05). The model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the normal group (P<0.05); the EA model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the EA normal group but a significantly lower level of ACh than the model group (P<0.05). The EA normal group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the normal group (P<0.05), and the EA model group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the EA normal group and the model group (P<0.05). ConclusionEA at Feishu point can enhance vagus nerve discharge and promote the release of ACh in the lungs in rats with COPD.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease; Electroacupuncture; Feishu point; Vagus nerve; Acetylcholine