MUHAMMAD Jawed，王　俊，徐　莉，閆云君

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

小球藻抽脂殘留物培養(yǎng)產(chǎn)氣腸桿菌的制氫研究

MUHAMMAD Jawed?，王俊?，徐莉*，閆云君*

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

為使高效產(chǎn)氫產(chǎn)氣腸桿菌能夠運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，探索并且優(yōu)化以小球藻抽脂殘留物的水解產(chǎn)物為底物的厭氧批次產(chǎn)氫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)參數(shù).采用中心組合設(shè)計(jì)，通過三次平行實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)值，擬合得到反映溫度、接種量和pH值與產(chǎn)氫量之間關(guān)系的多元二次回歸模型，以產(chǎn)氫率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析.方差分析結(jié)果顯示，該模型的顯著性和可靠性較高，擬合效果良好.該模型預(yù)測出最佳產(chǎn)氫結(jié)果為54.22 mL/g小球藻抽脂殘留物，產(chǎn)氫條件為溫度37.55℃，接種量12.25%，pH值5.95.進(jìn)行了厭氧批次發(fā)酵產(chǎn)氫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際結(jié)果為小球藻抽脂殘留物的產(chǎn)氫量為54.61 mL/g，與預(yù)測值十分接近，說明該模型能較好反應(yīng)三因素對產(chǎn)氫量的影響.優(yōu)化了高效產(chǎn)氫菌利用廉價底物發(fā)酵產(chǎn)氫的運(yùn)行條件，為實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)氫氣的過程與有機(jī)廢棄物無害化處理相耦合提供了新思路.

產(chǎn)氣腸桿菌；生物制氫；小球藻提脂殘留物；響應(yīng)面法

1　引言

隨著能源危機(jī)的加劇，人們環(huán)保意識越發(fā)增強(qiáng)，氫氣作為可再生的清潔能源載體受到越來越多的重視［1-3］.其中，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)反應(yīng)條件溫和、能耗低、效率高，能同時解決化石燃料能源消耗所帶來的資源匱乏、環(huán)境污染等問題，因此成為目前制氫方法的研究熱點(diǎn)［4-8］.

但是，微生物厭氧發(fā)酵制氫成本高制約著微生物發(fā)酵制氫的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化.利用富含碳水化合物的廢棄物代替葡萄糖、蔗糖這類昂貴的原料作為底物，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)氫氣的過程與有機(jī)廢棄物無害化處理相耦合是生物制氫最有應(yīng)用前景的方向之一，吸引了政府和科研人員的大力關(guān)注［9-11］.作為制備新能源的重要原料微藻具有光合效率高和資源豐富等特點(diǎn)，其油脂抽提后剩余的廢棄物藻渣（lipid extracted microalgal biomass residues，LMBRs）是一種營養(yǎng)豐富的有機(jī)質(zhì)，若處理不當(dāng)排放到環(huán)境當(dāng)中將造成環(huán)境的污染和資源浪費(fèi)［12］.厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌對底物適應(yīng)性較廣，如果利用來源豐富的藻渣作為產(chǎn)氫微生物的發(fā)酵底物來制備氫氣，變廢為寶，在降解有機(jī)廢棄物解決環(huán)境問題的同時，可以降低氫氣生產(chǎn)成本.該方法將為最終實(shí)現(xiàn)原位處理類似有機(jī)廢棄物低成本獲得氫氣提供新的思路.

發(fā)酵培養(yǎng)條件及其工藝優(yōu)化可以得到最佳的產(chǎn)氫效率.產(chǎn)氫發(fā)酵的培養(yǎng)條件主要包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速、pH值的大小和初始接種量等因素.在這些因素中，有一些因素微小的變化會導(dǎo)致目的產(chǎn)物產(chǎn)量發(fā)生大幅度改變，一般認(rèn)為這樣的因素對于目的變量具有顯著性影響.通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)（plackett-burman，PB試驗(yàn)）可以確定一個因素是否具有顯著性和該因素最優(yōu)值的范圍.為了確定培養(yǎng)參數(shù)之間的關(guān)系和最優(yōu)值，各種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和工具被開發(fā)和應(yīng)用［13］.其中“響應(yīng)面優(yōu)化法”（response surface methodology，RSM）因其方便準(zhǔn)確擬合度好而運(yùn)用廣泛［14-15］.

在此背景下，本研究針對厭氧發(fā)酵制氫成本較高的問題，擬開展利用油脂抽提后剩余的小球藻藻渣LMBRs水解產(chǎn)物作為發(fā)酵底物，利用響應(yīng)面優(yōu)化法研究利用該底物發(fā)酵產(chǎn)氫量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值大小以及接種量之間的關(guān)系，預(yù)測這三個因素在進(jìn)行產(chǎn)氫發(fā)酵時的最優(yōu)數(shù)值，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).以此模擬工業(yè)化生產(chǎn)生物柴油的微藻藻渣原位水解產(chǎn)氫的過程，探索類似有機(jī)廢棄物工業(yè)應(yīng)用的潛在價值.

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1材料

2.1.1菌株產(chǎn)氫發(fā)酵菌株使用產(chǎn)氣腸桿菌工程菌 Enterobacter aerogenes AB91102-OP/N（Δppc，Δldh，nadE），該菌為本實(shí)驗(yàn)利用基因敲除的方法構(gòu)建獲得的產(chǎn)氣腸桿菌工程菌，該菌具有能夠利用五碳糖和六碳糖生長并產(chǎn)氫的特點(diǎn)，能夠較好地利用成分復(fù)雜的小球藻提脂殘留物水解產(chǎn)物［16］. 2.1.2培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基小球藻提脂殘留物L(fēng)MBRs的水解產(chǎn)物水解液調(diào)節(jié)pH至中性后干燥.成分為31.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的還原糖和6.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的總氮.每升培養(yǎng)基中加入30.0 g小球藻提脂殘留物L(fēng)MBRs的水解產(chǎn)物.

2.1.3儀器和試劑常規(guī)生化試劑均購自國藥公司.pH-stat計(jì)（德國 Schott），電轉(zhuǎn)化儀（美國Bio-RAD），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海蘇進(jìn)），紫外檢測儀（上海金達(dá)生化儀器），恒流泵（上海金達(dá)生化儀器），臺式離心機(jī)（德國Eppendorf），恒溫?fù)u床（上海智城），紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)），3 L自控發(fā)酵罐（上海保興）.

2.2方法

2.2.1小球藻提脂殘留物的水解策略取10 L發(fā)酵罐發(fā)酵的畢赤酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，4 000 r/min離心20 min取沉淀，無菌水重懸細(xì)胞，離心取沉淀重懸制備成質(zhì)量濃度為10%的懸濁液，調(diào)節(jié)pH值至5.2；再向該溶液中加入NaCl和無水乙醇使其終質(zhì)量濃度均為5%，混勻.50℃，150 r/min震蕩孵育24 h.4 000 r/min離心20 min取上清獲得酵母自溶物.取該新鮮酵母自溶物100 mL與5 g干燥后的小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs分別在37、43℃和50℃下，150 r/min震蕩孵育.再分別在80、100℃和121℃，用NaOH溶液堿解孵育上述預(yù)處理的小球藻提脂殘留物8 h.處理后將降解液冷卻，12 000 r/min離心5 min，分離上清液和固體物質(zhì)，上清液檢測其還原糖和氨基酸含量，固體不溶物質(zhì)檢測總氮含量.

2.2.2厭氧批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將裝有培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器在滅菌鍋中滅菌后，立即放在磁力攪拌座上，迅速接入通過濾膜Midisart 2000過濾后的99.9%（體積分?jǐn)?shù)）的高壓氮?dú)?0 min使培養(yǎng)環(huán)境處于無氧狀態(tài)，將排氣管連接到氣體收集瓶中.將pH電極與控制器連接，通過無菌操作將裝有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%氨水和1 mol/L稀鹽酸的補(bǔ)料瓶連接到發(fā)酵罐，開啟攪拌至450 r/min，在控制器上設(shè)定pH值為預(yù)定值，打開自動調(diào)節(jié).

種子培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同接種量確定體積，每次發(fā)酵接種兩瓶，一瓶作為檢測OD值變化樣品，一瓶作為接種液.37°C下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，待檢測瓶的OD值達(dá)到0.6時，迅速將另一瓶菌液接種到反應(yīng)器中.發(fā)酵培養(yǎng)12 h，測定收集氣體中氫氣的含量. 2.2.3優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用三因素三水平中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），利用統(tǒng)計(jì)分析軟件“Design Expert”將獲得的厭氧批次發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究產(chǎn)氫量與有效獨(dú)立變量：初始接種量、pH和溫度之間的關(guān)系.將每克小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs能夠產(chǎn)生的氫氣的量作為響應(yīng)參數(shù)，各優(yōu)化參數(shù)采用的考察水平如表1所示：

表1　優(yōu)化小球藻提脂殘留物產(chǎn)氫的因素及其水平Tab.1　Levels and factors used for optimization of hydrogen production from LMBRs

由于需要優(yōu)化的因素數(shù)量為3個，根據(jù)析因部分實(shí)驗(yàn)的次數(shù)F=2k（k為因素的數(shù)量）得出，析因?qū)嶒?yàn)的次數(shù)為 F=2k=23=8次.極值α=F1/4=81/4≈1.682，星點(diǎn)數(shù)為2k=2×3=6，為保證實(shí)驗(yàn)的精密性，中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次.所以需要進(jìn)行的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)次數(shù)總共為20次.

實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)參數(shù)變量和相應(yīng)值之間的關(guān)系可以用如公式（1）所示的二次模型表示：

其中，Y表示相應(yīng)結(jié)果的預(yù)測值，xi表示輸入變量的值，i=1-k，j=1-k，A0表示線性系數(shù)，Aii表示二次項(xiàng)系數(shù)，Aij表示相互作用系數(shù).

通過方差分析對該二次模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.通過該模型構(gòu)建的等高線圖和三維曲面圖可以進(jìn)一步預(yù)測最大產(chǎn)氫量及產(chǎn)生該產(chǎn)氫量時初始接種量、pH和溫度的大小.

2.2.4氫氣濃度的測定氫氣的濃度使用氣象色譜儀進(jìn)行測定，采用的是FULI GC-9750型氣相色譜，裝配有一個填充柱（2.0 mmL.D.200 mmL，carboxen-1004，80～100 mesh），和一個TCD熱導(dǎo)檢測器.檢測器和柱子的工作溫度分別為60℃和110℃.

3　結(jié)果與討論

3.1模型的建立及擬合檢驗(yàn)

如表2所示，按照中心組合設(shè)計(jì)CCD設(shè)計(jì)的各參數(shù)變量的值進(jìn)行一組20次的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每組進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到在所設(shè)計(jì)的初始接種量、pH和溫度下的產(chǎn)氫效率.該產(chǎn)氫效率設(shè)定為每克小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs為底物被菌株AB91102-OP/N利用產(chǎn)生的氫氣的量.

通過表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，獲得多元回歸方程如公式（2）所示.

其中，Y表示產(chǎn)氫量，X1、X2和X3分別表示如表1中所示變量.對該回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果依次如表3中所示.

3.2產(chǎn)氫條件的優(yōu)化

通過對二次模型的擬合檢驗(yàn)，證明該模型具有較高的顯著性和可靠性，能夠較好的擬合產(chǎn)氫效率與初始接種量、培養(yǎng)溫度和pH值之間的關(guān)系，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件“Design Expert”將該模型生成能夠反應(yīng)接種量、溫度和pH與產(chǎn)氫量之間關(guān)系的3D響應(yīng)面圖，以及這三個參數(shù)兩兩之間相互作用的等高線圖，如圖1所示.

3.3最優(yōu)發(fā)酵條件的預(yù)測

對二次回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)合響應(yīng)面3D立體圖中的極值點(diǎn)，預(yù)測得出產(chǎn)氫氣效率最大值為54.22 mL/g小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs，在條件為溫度37.55℃，接種量12.25%，pH值為5.95時產(chǎn)生.

3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)際預(yù)測效果，在上述預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行厭氧批次發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該理想條件下利用小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs產(chǎn)氫效率為 54.61 mL/g，與預(yù)測結(jié)果54.22 mL/g小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs十分相近，證明該模型能夠很好地體現(xiàn)三個因素與產(chǎn)氫量之間的關(guān)系，具有良好的預(yù)測能力.

表2　利用小球藻提脂殘留物在不同溫度、接種量、pH值下氫氣的產(chǎn)量Tab.2　Hydrogen production from LMBRs at different temperatures，ratios of inoculum and pH values

表3　響應(yīng)面二次模型的方差分析Tab.3　ANOVA for response surface quadratic model

圖1　溫度、pH值和接種量影響產(chǎn)氫量的響應(yīng)面和等高線圖（a）溫度和接種量對產(chǎn)氫量的影響；（b）溫度和pH值對產(chǎn)氫量的影響；（c）接種量和pH值對產(chǎn)氫量的影響Fig.1　Response surface plot and the corresponding contour lines showing the effects of temperature，pH and ratios of inoculum on hydrogen yield （a）Effects of temperature and ratios of inoculum on hydrogen yield；（b）Effects of temperature and pH on hydrogen yield；（c）Effects of ratios of inoculum and pH on hydrogen yield

3.5討論

響應(yīng)面法是常用的優(yōu)化產(chǎn)氫發(fā)酵重要參數(shù)的方法，在很多研究中被證明能夠有效地提高產(chǎn)氫量［14-19］.Chong等運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化酪酸梭菌利用棕櫚油流出物生產(chǎn)氫氣的條件，使產(chǎn)氫速率提高到了849.5 mL/h，培養(yǎng)條件的變化使收集氣體中氫氣的濃度從60%提高到了75%［14］.Hay等運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化厭氧活性污泥生物反應(yīng)器的運(yùn)行條件，建成了預(yù)測產(chǎn)氫準(zhǔn)確的模型［18］.

本研究為考察已構(gòu)建的高效產(chǎn)氫腸桿菌工程菌AB91102-OP/N的實(shí)際應(yīng)用能力，通過響應(yīng)面法優(yōu)化可再生廢棄物小球藻抽脂殘余物為底物的厭氧批次產(chǎn)氫發(fā)酵參數(shù).該厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫采用純培養(yǎng)，發(fā)酵底物采用同一批次獲得的小球藻抽脂殘余物水解產(chǎn)物；接種使用的培養(yǎng)物均控制相同的OD值；反應(yīng)器中接入溶氧電極，確保每次實(shí)驗(yàn)均在嚴(yán)格厭氧的條件下進(jìn)行等系列措施，最大限度降低發(fā)酵過程的不確定因素，保證本擬合二次模型的各種擬合參數(shù)較高.研究結(jié)果表明，在通過響應(yīng)面法優(yōu)化的條件下，每克LMBRs產(chǎn)氫量將可達(dá)到54.61mL/g，相對未經(jīng)優(yōu)化的條件下45.33 mL/g的產(chǎn)氫量提升20.47%（P-value=0.016 2），效果顯著.該研究為進(jìn)一步利用類似有機(jī)廢棄物作為發(fā)酵底物制備氫氣，實(shí)現(xiàn)氫氣的制備與有機(jī)廢棄物無害化處理相耦合，一并解決環(huán)境問題和能源危機(jī)問題，最終實(shí)現(xiàn)原位處理有機(jī)廢棄物，獲得低成本的綠色能源氫氣提供了新的思路.

4　結(jié)　語

系統(tǒng)優(yōu)化了本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的產(chǎn)氣腸桿菌工程菌以小球藻抽脂殘余物水解產(chǎn)物為培養(yǎng)基的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫條件.采用三因素三水平中心組合設(shè)計(jì)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件“Design Expert”設(shè)計(jì)了一組數(shù)量為20次的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并通過3次平行實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)值，擬合得到反應(yīng)溫度、接種量和pH值與產(chǎn)氫量之間關(guān)系的多元二次回歸模型，以產(chǎn)氫率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析.方差分析結(jié)果顯示，該模型顯著性和可靠性較高，擬合效果良好.按照該模型預(yù)測出的最佳結(jié)果54.22 mL/g小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs產(chǎn)生的條件為溫度 37.55℃，接種量12.25%，pH值5.95.進(jìn)行了厭氧批次發(fā)酵產(chǎn)氫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果表明實(shí)際產(chǎn)氫量54.61 mL/g小球藻抽脂殘余物L(fēng)MBRs與預(yù)測值十分相近，證明該模型能較好地反應(yīng)三個因素對產(chǎn)氫量的影響.通過響應(yīng)面法優(yōu)化了高效產(chǎn)氫菌利用廉價底物發(fā)酵產(chǎn)氫的運(yùn)行條件，對高效產(chǎn)氫菌的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行探索，為開發(fā)有效降低厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫成本提供了新的策略.

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本文編輯：張瑞

Cultivation of Enterobacter Aerogenes for Hydrogen Production with Lipid Extracted Microalgal Biomass Residues

MUHAMMAD Jawed?，WANG Jun?，XU Li*，YAN Yunjun*

School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China

To examine the feasibility of cultivating Enterobacter aerogenes for hydrogen production with lipid extracted microalgal biomass residues，the anaerobic batch fermentations from microalgal hydrolysate were conducted and their key parameters were optimized using response surface methodology.The central composite designs were performed，and a quadratic regression model based on temperature，pH，inoculum and hydrogen yield was obtained from the triplicate experimental data.The analysis of variances indicates that the model has good fitting degree.The predicted maximum hydrogen yield of 54.22 mL/g of lipid extracted microalgal biomass residues was obtained when the temperature，pH and inoculum were respectively at 37.55℃，5.95 and 12.25%.The confirmatory experiments showed that the mutant evolved hydrogen yield of 54.61 mL/g of lipid extracted microalgal biomass residues in the optimal conditions.The coincident result verified the practicability of the model.This study indicates that a strategy of cultivating Enterobacter aerogenes for hydrogen production with lipid extracted microalgal biomass residues has great potential for the large scale of production.

Enterobacter aerogenes；biohydrogen；lipid extracted microalgal biomass residues；response surface methodology

閆云君，博士，教授，博士研究性導(dǎo)師.E-mail：yanyunjun@hust.edu.cn

Q93-335

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2016.04.001

1674-2869（2016）04-0313-06

2016-03-03

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2010MS029）

王俊，博士研究生，為并列第一作者.E-mail：651113197@qq.com

徐莉，博士，副教授.E-mail：xuli@hust.edu.cn