張雅為，劉耀川，魏　澍，朱江巍，趙曉彤，曹　東

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧沈陽(yáng) 110164；3.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽(yáng) 110161)

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沈陽(yáng)某雞場(chǎng)大腸埃希菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張雅為1,2，劉耀川3，魏澍1,2，朱江巍3，趙曉彤1,2，曹東1,2

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧沈陽(yáng) 110164；3.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽(yáng) 110161)

摘要：對(duì)沈陽(yáng)市某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的85例病死雞進(jìn)行大腸埃希菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果分離到大腸埃希菌62株，分離率為72.9%，分離菌株對(duì)頭孢氨芐全部耐藥，對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率在0～88.7%之間，多重耐藥情況普遍。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；分離；鑒定；藥物敏感性；多重耐藥

大腸埃希菌為養(yǎng)禽業(yè)主要致病細(xì)菌之一，其致病性菌株能夠引起多種疾病，主要能夠引起雞的腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎、心包炎、肉芽腫、肝周炎及敗血癥等[1]。由于禽大腸埃希菌血清型多樣，臨床癥狀復(fù)雜，并常見其他細(xì)菌性疾病協(xié)同感染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大威脅。臨床上常用抗菌藥物對(duì)禽大腸埃希菌引起的疾病進(jìn)行治療[2]。但隨著抗菌藥物的不斷使用，耐藥菌株逐漸增多，給疾病治療與防控帶來新的挑戰(zhàn)[3]。本試驗(yàn)通過對(duì)沈陽(yáng)某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)病、死雞進(jìn)行大腸埃希菌分離和鑒定，并對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，為該場(chǎng)雞大腸埃希菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料在沈陽(yáng)某大型肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，選取臨床癥狀及病理變化為疑似大腸埃希菌病的雞85只，主要癥狀為氣囊炎、敗血癥、腹膜炎等。無菌采集瀕死或病死不超過24 h雞的心臟、肝臟、氣囊、脾臟及血液等作為病料。

1.1.2培養(yǎng)基及生化反應(yīng)鑒定管營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、麥康凱瓊脂,北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MH(B)培養(yǎng)基,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管,杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器設(shè)備酒精燈，離心管，接種環(huán)，恒溫培養(yǎng)箱，潔凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，平皿和錐形瓶等。

1.1.4藥物標(biāo)準(zhǔn)品氧氟沙星(97.8%)、頭孢唑啉(99.1%)、慶大霉素(62.0%)、恩諾沙星(99.9%)、氟苯尼考(99.2%)、甲砜霉素(99.7%)、土霉素(88.2%)、環(huán)丙沙星(98.3%)、頭孢噻呋(88.2%)、頭孢氨芐(95.3%)、阿莫西林(79.9%)、多西環(huán)素(82.2%)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，大腸埃希菌ATCC25922，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2方法

1.2.1大腸埃希菌初步分離無菌操作采集病、死雞的相應(yīng)組織，直接劃線接種于經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平皿中，于37 ℃培養(yǎng)18 h。挑取典型紅色金屬光澤的光滑、圓形菌落，于無菌檢驗(yàn)合格的營(yíng)養(yǎng)肉湯中擴(kuò)增，保存于含300 mL/L的甘油中，置-20 ℃保存待用。

1.2.2大腸埃希菌生化鑒定按照購(gòu)買的腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管說明書要求，對(duì)初步分離的大腸埃希菌進(jìn)行葡萄糖、乳糖、鳥氨酸、苯丙氨酸、硫化氫、蛋白胨、賴氨酸、衛(wèi)矛醇、尿素、氨基酸對(duì)照及枸櫞酸鈉等11項(xiàng)生化反應(yīng)。根據(jù)37 ℃培養(yǎng)18 h結(jié)果對(duì)其進(jìn)行編碼，最后根據(jù)編碼手冊(cè)判定細(xì)菌類型。并將最終經(jīng)生化反應(yīng)確定的大腸埃希菌保存待用，其余非埃希菌經(jīng)滅菌后丟棄。

1.2.3大腸埃希菌分離株藥敏試驗(yàn)

1.2.3.1菌液制備將保存的大腸埃希菌接種于麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中典型單菌落接種于無菌檢驗(yàn)合格的MH肉湯中，在37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液濃度約為1×108CFU/mL備用。使用時(shí)，用無菌MH肉湯將其稀釋成濃度為1×105CFU/mL的應(yīng)用菌液。

1.2.3.2抗菌藥液制備準(zhǔn)確稱量各抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，并按照說明使用適當(dāng)溶劑溶解，配制為1 280 μg/mL濃度的原藥液，于4 ℃保存、備用。使用時(shí)對(duì)其進(jìn)行2次稀釋，使用藥液的濃度約在0.125 μg/mL～128 μg/mL之間。

1.2.3.3抗菌藥物最小抑菌濃度測(cè)定根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，采用肉湯微量稀釋法測(cè)定12種抗菌藥物對(duì)大腸埃希菌分離株的MIC，每種抗菌藥物重復(fù)3個(gè)平行。同時(shí)用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC25922作為質(zhì)控菌。

2　結(jié)果

2.1雞大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

對(duì)85例病、死樣品進(jìn)行初篩，得到疑似大腸埃希菌77株，大腸埃希菌初篩分離率為90.6%；77株初篩菌株經(jīng)腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管鑒定后，最終確定62株為大腸埃希菌，鑒定陽(yáng)性率為80.5%。該養(yǎng)殖場(chǎng)大腸埃希菌分離率為72.9%。生化鑒定結(jié)果見表1。

2.2大腸埃希菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的62株大腸埃希菌對(duì)頭孢氨芐高度耐藥，耐藥率為100%；對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率分別為：甲砜霉素88.7%、氟苯尼考69.4%、土霉素66.1%、頭孢唑林53.3%、恩諾沙星41.9%、阿莫西林35.5%、慶大霉素30.6%、多西環(huán)素19.4%、氧氟沙星14.5%、環(huán)丙沙星12.9%；62株分離株對(duì)頭孢噻呋敏感，無耐藥分離株。12種抗菌藥物對(duì)62株大腸埃希菌分離株MIC測(cè)定結(jié)果見表2。

表1　77株疑似大腸埃希菌生化鑒定結(jié)果

表2　12種抗菌藥物對(duì)62株大腸埃希菌分離株的MIC

2.3大腸埃希菌多藥耐藥情況分析

本試驗(yàn)受試抗菌藥物屬于6類，3種為頭孢菌素類，3種為氟喹諾酮類，2種氯霉素類，2種四環(huán)素類，1種氨基糖苷類，1種β內(nèi)酰胺類。62株大腸埃希菌分離株中5株(8.1%)耐2類藥，31株(50.0%)耐3類藥，22株(35.5%)耐4類藥，13株(21.0%)耐5類藥。多藥耐藥情況見圖1。

3　討論

禽源大腸埃希菌分離率高、危害大，且對(duì)臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥情況。有報(bào)道稱，山東地區(qū)肉雞大腸埃希菌對(duì)土霉素、酒石酸泰樂菌素、對(duì)磺胺-6-甲氧嘧啶、氨芐西林鈉及阿莫西林的耐藥率分別為96.0%、99.0%、99.5%、100%及100%[4-5]。河北地區(qū)大腸埃希菌分離株對(duì)上述藥物的耐藥率均為100%。遼寧地區(qū)肉雞大腸埃希菌對(duì)上述藥物的耐藥率分別為100%、100%、97.1%、94.3%及94.3%[6]。遼西地區(qū)禽源大腸埃希菌藥物敏感性試驗(yàn)表明，分離株對(duì)氟苯尼考、頭孢噻呋、左旋氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星比較敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、黏桿菌素、阿米卡星、利福平等耐藥[7-13]。

圖1　大腸埃希菌分離株多藥耐藥情況

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)大腸埃希菌分離率為72.9%，共分離得到大腸埃希菌分離株62株。對(duì)分離株進(jìn)行臨床常用藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)頭孢氨芐全部耐藥，對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率在0～88.7%之間。對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考、土霉素及頭孢唑林耐藥率較高；對(duì)頭孢噻呋敏感，無耐藥菌株。多藥耐藥分析發(fā)現(xiàn)，分離株3重耐藥菌株最多，為50%，其他依次為4重、5重及2重多藥耐藥。說明分離株已對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥。與報(bào)道的其他地區(qū)的禽源大腸埃希菌耐藥情況比較，該場(chǎng)分離株為中等耐藥水平，可能與該場(chǎng)的用藥、治療習(xí)慣有關(guān)。并推薦該場(chǎng)使用敏感性高的藥物(如頭孢噻呋)對(duì)大腸埃希菌病雞進(jìn)行治療。

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收稿日期：2015-12-16

基金項(xiàng)目：遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2015015)

作者簡(jiǎn)介：張雅為(1981-)，女，遼寧丹東人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

中圖分類號(hào):S852.612;S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0120-03

Isolation,Identification and Drug Susceptibility Tests ofEscherichiacoliIsolates Obtained from a Chicken Farm in Shenyang

ZHANG Ya-wei1,2,LIU Yao-chuan3,WEI Shu1,2,ZHU Jiang-wei3,ZHAO Xiao-tong1,2,CAO Dong1,2

(1.AnimalEpidemicPreventionandControlCenterofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning，110164,China;2.VeterinaryMedicineResearchInstituteofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning， 110164,China;3.TheEmergencyCenterforSignificantAnimalepidemicDiseaseofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning，110161,China)

Abstract:In this study,Escherichia coli strains were isolated from 85 sick or dead chickens in Shenyang.Isolates were identified,and drug susceptibility tests were carried out.The results showed that,62 isolates were obtained with the 72.9% isolation rate.All isolates were resistant to cefalexin and 0-88.7% to other antibacterial agents.The multi-drug resistance was widespread.

Key words:Escherichia coli; isolation; identification; drug susceptibility test; multi-drug resistance