趙維芯，胡茂志，李紅英，嚴(yán)秋香，崔桂友

(1.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院(食品科學(xué)與工程學(xué)院)，江蘇揚(yáng)州 225009;3.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

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沙門(mén)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展

趙維芯1,2，胡茂志1,3*，李紅英1，嚴(yán)秋香1，崔桂友2

(1.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院(食品科學(xué)與工程學(xué)院)，江蘇揚(yáng)州 225009;3.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

摘要：沙門(mén)菌是一種重要的人獸共患腸道病原菌，在引起人類(lèi)食物中毒的微生物中常列榜首。沙門(mén)菌的致病性與其Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)密切相關(guān)。沙門(mén)菌能夠利用T3SS選擇性分泌效應(yīng)蛋白至感染細(xì)胞的胞質(zhì)中，在較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的功能，完成細(xì)菌的感染和胞內(nèi)定殖過(guò)程，從而逃避機(jī)體的清除作用。沙門(mén)菌T3SS的作用機(jī)制研究對(duì)于沙門(mén)菌病的防治具有重要意義，論文主要對(duì)沙門(mén)菌T3SS的結(jié)構(gòu)、組裝及作用機(jī)理做一綜述，以期為沙門(mén)菌病的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：沙門(mén)菌；Ⅲ型分泌系統(tǒng)；結(jié)構(gòu)；組裝；機(jī)理

Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是沙門(mén)菌(Salmonella)入侵機(jī)體并引起致病的主要機(jī)制，在沙門(mén)菌入侵腸道上皮細(xì)胞的感染過(guò)程中起重要作用[1]。其可以直接將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞來(lái)調(diào)控宿主細(xì)胞功能，使細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存并增殖[2]。沙門(mén)菌毒力島(Salmonellapathogenicity island，SPI)是染色體或質(zhì)粒上成簇分布的編碼毒力相關(guān)基因的特定區(qū)域，在沙門(mén)菌已知的23個(gè)毒力島(SPI-1～23)[3]中，與T3SS密切相關(guān)的主要是SPI-1和SPI-2，分別編碼T3SS-1和T3SS-2。腸道沙門(mén)菌(S.enterica)中存在兩套T3SS，而邦戈?duì)柹抽T(mén)菌(S.bongori)只有T3SS-1[4]。沙門(mén)菌T3SS的結(jié)構(gòu)組件都具有高度保守性。T3SS-1中有調(diào)節(jié)子和分泌性效應(yīng)蛋白，分泌性效應(yīng)蛋白不僅與沙門(mén)菌和宿主細(xì)胞表面的黏附有關(guān)，而且也可引起腸黏膜細(xì)胞上肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)骨架的重排，重排后的蛋白結(jié)構(gòu)有利于沙門(mén)菌的內(nèi)化作用[5]。SPI-2編碼的T3SS在結(jié)構(gòu)和功能上與T3SS-1不同，T3SS-2可使沙門(mén)菌在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，特別是在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中形成適合沙門(mén)菌生長(zhǎng)的空泡(Salmonella-contaimng vacuole，SCV)，使沙門(mén)菌逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用，抵御免疫系統(tǒng)的清除。SPI-2還編碼一個(gè)雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)SsrA/SsrB，調(diào)控T3SS-2組件蛋白及其效應(yīng)蛋白的表達(dá)[6]。

近年來(lái)，關(guān)于沙門(mén)菌T3SS的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，本文主要對(duì)沙門(mén)菌T3SS的結(jié)構(gòu)、組裝及作用機(jī)理等方面的研究進(jìn)展做一綜述。

1　沙門(mén)菌T3SS的結(jié)構(gòu)

T3SS裝置是由多種蛋白組成的類(lèi)似針狀結(jié)構(gòu)的超分子結(jié)構(gòu)(即注射裝置)。一般需要20多種蛋白完成組裝，至少有15種是功能性蛋白質(zhì)[7]。從結(jié)構(gòu)上大致可以分為細(xì)菌胞外成分、橫跨細(xì)胞膜的基座、胞內(nèi)成分和分子伴侶等四大類(lèi)[8-10]。表1中列出了一些T3SS相關(guān)蛋白的統(tǒng)一名稱(chēng)(secretion and cellular translocation,Sct)、功能和保守性組件[2]。

1.1沙門(mén)菌T3SS的胞外組件

1.1.1針(needle)T3SS的針是連接宿主與細(xì)菌的橋梁，是從基座一直延伸到宿主細(xì)胞表面的鋼性針結(jié)構(gòu)[10]。它通過(guò)內(nèi)桿(inner-rod)與細(xì)菌表面的基座相連，內(nèi)桿對(duì)針的長(zhǎng)度起著決定性的作用[11]。不同細(xì)菌的針長(zhǎng)度不同，如耶爾森鼠疫菌一般為58 nm±10 nm[10]，沙門(mén)菌約為80 nm[12]。沙門(mén)菌T3SS的針是由大約120拷貝的PrgI蛋白螺旋聚合形成的1個(gè)直的中空管狀結(jié)構(gòu)[13]，內(nèi)有專(zhuān)門(mén)輸送效應(yīng)蛋白的狹窄孔道(直徑約2 nm～3 nm)，折疊的效應(yīng)蛋白一般不能直接通過(guò)，必須經(jīng)過(guò)伸展以后才能穿過(guò)針孔。沙門(mén)菌的內(nèi)桿是由PrgJ蛋白形成。PrgJ的分子結(jié)構(gòu)與針的組成蛋白PrgI相似，其C-末端具有高度保守性并且呈α-螺旋結(jié)構(gòu)，另有部分區(qū)域?yàn)檎郫B結(jié)構(gòu)[14]。

1.1.2針尖(needle tip)沙門(mén)菌T3SS的針尖是由針尖蛋白SipD構(gòu)成，并套在針的頂部。SipD蛋白在錨定于針蛋白PrgI時(shí)，SipD的結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生變化，但如何變化尚不清楚。SipD蛋白的N末端呈α螺旋的發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)域的缺失不影響與PrgI的結(jié)合。SipD蛋白含有8個(gè)螺旋和5個(gè)折疊結(jié)構(gòu)，形成了3個(gè)不同的啞鈴形結(jié)構(gòu)域。SipD及其同系物的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)表明，它們的N末端都有α螺旋的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、一個(gè)長(zhǎng)的中央卷曲(coiled-coil)和一個(gè)末端區(qū)域[13]。PrgI可以和SipD的中央卷曲區(qū)域相互作用[15]。針尖作為轉(zhuǎn)位子的組裝支架，可使轉(zhuǎn)位子套于其上，并插入宿主細(xì)胞膜[16]。晶體學(xué)結(jié)構(gòu)顯示，SipD的N-端螺旋結(jié)構(gòu)可以通過(guò)自我組裝來(lái)阻止自身的聚合[17]。

1.1.3轉(zhuǎn)位子(translocon)轉(zhuǎn)位子是細(xì)菌將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞必不可少的組件。它能敏銳的識(shí)別宿主細(xì)胞，并嵌入宿主細(xì)胞膜內(nèi)，形成一個(gè)小孔[18]。沙門(mén)菌T3SS-1的轉(zhuǎn)位子由蛋白SipC和SipB構(gòu)成[19]。SipC和SipB是沙門(mén)菌入侵宿主細(xì)胞所必需的組件，如果缺失，則效應(yīng)蛋白將無(wú)法注入宿主細(xì)胞[20]。SipC的C端氨基酸(321-409)嵌入宿主細(xì)胞膜中，SipC和SipB相互作用的區(qū)域在C端340-409位氨基酸[19]。沙門(mén)菌T3SS-2的轉(zhuǎn)位子由蛋白SseB、SseC和 SseD構(gòu)成，SseB和SseD一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異影響T3SS-2功能，因此，T3SS-2的轉(zhuǎn)位蛋白對(duì)在宿主細(xì)胞膜中可以形成多亞基的復(fù)合物至關(guān)重要[21]。

目前，盡管有關(guān)轉(zhuǎn)位子的研究較多，但轉(zhuǎn)位子怎樣嵌插在宿主細(xì)胞膜中以及怎樣形成運(yùn)輸通道，尚不清楚。

表1　沙門(mén)菌T3SS組分及功能[2]

1.2基座

沙門(mén)菌T3SS的基座包括內(nèi)膜環(huán)(inner membrane ring)、輸出裝置(export apparatus)、外膜環(huán)(outer membrane ring)等結(jié)構(gòu)。PrgK和PrgH是沙門(mén)菌T3SS-1基座的內(nèi)膜環(huán)主要組件，PrgK的N-末端有半胱氨酸殘基形成的脂蛋白信號(hào)序列，C-末端位于細(xì)菌胞質(zhì)中，PrgH/PrgK組成基座的內(nèi)環(huán)(即一個(gè)同心環(huán))，其中PrgK形成小環(huán)，PrgH形成大環(huán)[22]。InvG的N-端與內(nèi)膜環(huán)結(jié)合，C-端構(gòu)成外膜環(huán)。脂蛋白InvH協(xié)助InvG在外膜環(huán)上形成一個(gè)小孔，使效應(yīng)蛋白通過(guò)基座。在細(xì)胞質(zhì)中，內(nèi)膜環(huán)和外膜環(huán)的組件相互作用，形成復(fù)雜的分泌組件[23]?；羞€包含一些復(fù)雜的輸出組件(SpaP、SpaQ、SpaR、SpaS和InvA)，其中最大的是InvA，其在基座底部形成環(huán)。InvA含有4個(gè)亞基結(jié)構(gòu)組成的折疊，這些結(jié)構(gòu)對(duì)于底物的分泌至關(guān)重要。

1.3胞質(zhì)組件

沙門(mén)菌T3SS的胞質(zhì)組件比較復(fù)雜，主要包含ATPase復(fù)合物(InvC)、胞質(zhì)環(huán)(cytoplasmic ring，C-環(huán))、固定子(OrgB)、分子尺(InvJ)及一些附屬蛋白(分子伴侶)等，是蛋白質(zhì)分泌和篩選所必需的組件[2]。ATPase是一種能量轉(zhuǎn)化器，為T(mén)3SS輸出提供能量。ATPase的受體是C-環(huán)。InvC能形成1個(gè)直徑為2.5 nm～3 nm的同源六聚體環(huán)[24]，并通過(guò)延長(zhǎng)固定子的α螺旋結(jié)構(gòu)和柄(InvI)錨定于細(xì)菌細(xì)胞膜上。OrgB和InvI連接輸出組件SctV[25]。OrgB還可以在胞漿中協(xié)助調(diào)節(jié)ATPase活性，防止InvC發(fā)生多聚化，并將InvC運(yùn)送到細(xì)胞膜上[26]。已發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌T3SS分子伴侶主要有SicA、InvH和OrgA[5]。SicA是T3SS-1轉(zhuǎn)位蛋白SipB和SipC的分子伴侶，對(duì)蛋白與蛋白之間的相互作用起重要作用，并且可作為復(fù)合蛋白的調(diào)節(jié)器[27]。InvH和OrgA的主要作用是促進(jìn)T3SS針突復(fù)合物的有效粘附，并侵入腸道上皮細(xì)胞[28]。

2　沙門(mén)菌T3SS的組裝

沙門(mén)菌T3SS的組裝是按一定的步驟精確進(jìn)行的，開(kāi)始于基座的組裝，然后分泌一些與針及內(nèi)桿組裝相關(guān)的蛋白，終止于針組裝的完成[29]。整個(gè)組裝過(guò)程大致分為兩個(gè)階段：①Sec依賴(lài)性階段：首先，輸出裝置定位于內(nèi)膜，然后被MS環(huán)(membrane and supramembrane ring)包裹，此時(shí)，OM環(huán)定位于外膜。②T3SS依賴(lài)性階段：ATPase復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，并與C環(huán)和輸出裝置互作，錨定于內(nèi)膜上，啟動(dòng)組成針狀裝置的早期成分(如針SctF和內(nèi)桿蛋白SctI)的分泌。針穿過(guò)內(nèi)膜環(huán)，通過(guò)內(nèi)桿蛋白SctI錨定于基座上。針長(zhǎng)度約80 nm～2 μm，受分子尺SctP的調(diào)節(jié)。然后，針尖蛋白SctA附著在針的末端形成針尖。此后，轉(zhuǎn)位子(SctB和SctE)開(kāi)始分泌并錨定于針尖上。一旦針通過(guò)轉(zhuǎn)位子與宿主細(xì)胞膜結(jié)合，便開(kāi)始分泌晚期底物(如效應(yīng)蛋白)直接進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)中。蛋白的分泌需要分子伴侶的參與，分子伴侶與分泌蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而防止分泌蛋白的折疊和凝聚。在分泌時(shí)，ATPase催化裂解該復(fù)合物，使分泌蛋白伸展，從而通過(guò)輸出裝置2 nm～3 nm的孔。雖然T3SS可以分為不同的結(jié)構(gòu)單元，但其組裝和蛋白質(zhì)的分泌是連續(xù)、多步進(jìn)行的復(fù)雜過(guò)程。Sec依賴(lài)性階段結(jié)束后，T3SS依賴(lài)性階段的組裝受到多種因素(如蛋白成分和環(huán)境等)的精確調(diào)節(jié)[2]。

2.1基座的組裝

T3SS基座組裝的研究起始于對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌T3SS-1的研究，膜蛋白SpaP、SpaQ、SpaR和SpaS在內(nèi)膜上形成一個(gè)蛋白通道，內(nèi)環(huán)的組裝圍繞著這些膜蛋白進(jìn)行，而外環(huán)獨(dú)立進(jìn)行組裝，最先組裝形成早期T3SS的基座。早期基座特異性識(shí)別范圍較窄，只能識(shí)別內(nèi)桿蛋白PrgJ、針蛋白亞基PrgI及調(diào)節(jié)蛋白InvJ。因此，早期基座只能分泌一些用來(lái)裝配內(nèi)桿和針的蛋白及一些伴侶蛋白[30]。早期基座結(jié)構(gòu)的特異性改變(switch)發(fā)生于針組裝結(jié)束之后。這種改變和SpaS的自我催化裂解有緊密關(guān)系[31]，裂解是為了形成合適的構(gòu)象來(lái)完成基座的輸出功能。輸出裝置蛋白SpaS的自我裂解貫穿于基座從早期到中期再到后期的整個(gè)過(guò)程[32]。

2.2針及針頂部結(jié)構(gòu)的組裝

針的組裝是沙門(mén)菌T3SS裝配的最后階段。T3SS不能直接形成一根長(zhǎng)度合適的針絲，需要早期基座分泌蛋白的不斷沉積，如內(nèi)桿蛋白PrgI及調(diào)節(jié)針長(zhǎng)度的蛋白InvJ等的富集。Marlovits T C等[33]認(rèn)為，沙門(mén)菌T3SS的針和內(nèi)桿的裝配幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。針的長(zhǎng)度受InvJ的調(diào)節(jié)，InvJ還可促進(jìn)內(nèi)桿的組裝，當(dāng)內(nèi)桿組裝完成后，基座的結(jié)構(gòu)就會(huì)改變，內(nèi)桿及針蛋白的分泌將會(huì)停止，因此，針的長(zhǎng)度不再變化。Poyraz O等[34]研究表明，針的延長(zhǎng)是由于針末端亞基的聚合而成，部分PrgI會(huì)從α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊。Blocker A J等[35]推測(cè)，一些針的亞基可能會(huì)形成一個(gè)密閉區(qū)域并進(jìn)行獨(dú)立組裝。針的長(zhǎng)度具有可變性，當(dāng)PrgI過(guò)度表達(dá)時(shí)，就會(huì)形成1 μm的針；另外，InvJ的缺失也會(huì)導(dǎo)致微米針的出現(xiàn)[36]。針組裝完成后，轉(zhuǎn)位子就會(huì)作為帽子結(jié)構(gòu)套在針尖上，嵌入宿主細(xì)胞膜內(nèi)，而針則留在細(xì)菌細(xì)胞外[37]。由此可見(jiàn)，一旦組裝形成一套完整的T3SS裝置后，細(xì)菌便可持續(xù)將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞。但轉(zhuǎn)位子是如何與針尖準(zhǔn)確對(duì)接及如何精確調(diào)控分泌蛋白的大小，均有待于進(jìn)一步研究。

3　沙門(mén)菌T3SS的作用機(jī)理

T3SS具有接觸依賴(lài)性，只有當(dāng)沙門(mén)菌與宿主細(xì)胞接觸后，這一系統(tǒng)才能啟動(dòng)。啟動(dòng)后，細(xì)菌就會(huì)分泌與毒力有關(guān)的多種效應(yīng)蛋白，并在相應(yīng)的伴侶蛋白協(xié)助下，從細(xì)菌的胞質(zhì)中直接注入宿主細(xì)胞胞質(zhì)中產(chǎn)生毒性。沙門(mén)菌T3SS注射裝置可幫助沙門(mén)菌定殖于宿主細(xì)胞的胞膜上，并將沙門(mén)菌分泌的效應(yīng)蛋白直接注入宿主細(xì)胞，該過(guò)程需要跨過(guò)3層膜[38]：圓柱形基座將T3SS裝置固定于沙門(mén)菌表面，幫助分泌蛋白穿過(guò)沙門(mén)菌的內(nèi)膜和外膜[39]，針狀突起延伸至細(xì)菌外，穿過(guò)宿主細(xì)胞膜，將伸展的效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞。沙門(mén)菌的致病性與其T3SS分泌的效應(yīng)蛋白密切相關(guān)。在已知對(duì)動(dòng)物致病的21種效應(yīng)蛋白中，由沙門(mén)菌T3SS分泌的占到12種。其中，T3SS-1分泌8種(AvrA、SipA、SipC、SopB、SopD、SopE、SspH1、SotP)；T3SS-2分泌4種(ExoS、ExoT、ExoV、ExoY)，編碼這些蛋白的基因并非位于沙門(mén)菌基因組的同一位置，有的位于質(zhì)粒，有些由噬菌體編碼[40]。T3SS-1效應(yīng)蛋白主要參與早期SCV的形成，T3SS-2效應(yīng)蛋白主要參與形成中期和后期的SCV以及維持SCV的穩(wěn)定。早期SCV形成于感染后10 min～60 min，1 h～4 h為中期，4 h以后則為后期。SCV的形成是沙門(mén)菌入侵后在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和增殖的必需環(huán)境。SipC是第1個(gè)被鑒定的T3SS-2效應(yīng)蛋白，它可以抑制SCV與溶酶體的融合，缺失后，會(huì)導(dǎo)致沙門(mén)菌的毒力明顯減弱[41]。

4　小結(jié)

沙門(mén)菌是常見(jiàn)的人類(lèi)食源性致病菌之一，為了適應(yīng)新環(huán)境的變化，形成了一些復(fù)雜的抵御機(jī)制。研究沙門(mén)菌的T3SS對(duì)于了解其致病機(jī)制具有重要意義，并且在與宿主的互作和作用機(jī)理方面上取得了較大進(jìn)展。T3SS的組裝是高度精確且有序的過(guò)程，組裝一旦完成，就會(huì)在各種伴侶蛋白的協(xié)助下分泌效應(yīng)蛋白來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。但在沙門(mén)菌T3SS的各個(gè)蛋白組件如何發(fā)揮作用、基座的輸出如何精密調(diào)節(jié)以及底物蛋白怎樣穿過(guò)針突復(fù)合物實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的致病性等方面，還有待于進(jìn)一步研究。

研究T3SS的調(diào)節(jié)及結(jié)構(gòu)不僅有助于我們了解這些復(fù)雜的機(jī)制和功能，而且可以幫助我們?nèi)タ刂坪透蓴_其分泌以防止病原體對(duì)人體的危害。另外，還可以將其轉(zhuǎn)運(yùn)作用應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，有利于開(kāi)發(fā)新的疫苗和抗菌劑。目前，對(duì)于沙門(mén)菌T3SS在抗腫瘤方面的研究也取得了一定進(jìn)展?？梢?jiàn)，沙門(mén)菌T3SS的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究前景廣闊。

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收稿日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372414);江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(K13040)

作者簡(jiǎn)介：趙維芯(1991-)，女，甘肅白銀人，碩士研究生，主要從事食品衛(wèi)生學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0084-06

Progress onSalmonellaType Ⅲ Secretion System

ZHAO Wei-xin1,2,HU Mao-zhi1,3,LI Hong-ying1,YAN Qiu-xiang1,CUI Gui-you2

(1.TestingCenterofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China;2.CollegeofTourism&Cuisine(CollegeofFoodScienceandEngineering),YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China;3.KeyLaboratoryofJiangsuPreventiveVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225009,China)

Abstract:Salmonella is a main pathogenic intestinal bacteria which can cause zoonosis.Among different food microbes,Salmonella is one of the most popular bacteria to cause food poison.The pathogenicity of Salmonella is closely associated with its type Ⅲ secretion system (T3SS).After infection,Salmonella can regulate the function of host cells through selective secretion of effector proteins into cytoplasm of cells by T3SS and then complete the process of infection and intracellular colonization in a short time.Using this mechanism,Salmonella can escape the killing of hosts.Therefore,the study of Salmonella T3SS will benefit for the defense against salmonellosis.This paper focused on the review of the structure,assembly and action mechanism of T3SS.The understanding of them will provide references for research in controlling salmonellosis.

Key words:Salmonella;type Ⅲ secretion system;structure;assembly;mechanism