周穎儀，劉瀟瀟

(廣東省藥品檢驗(yàn)所中成藥室，廣東 廣州　510180)

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反相高效液相色譜法測(cè)定消渴平片中黃芪甲苷的含量Δ

周穎儀*，劉瀟瀟#

(廣東省藥品檢驗(yàn)所中成藥室，廣東 廣州510180)

目的：建立消渴平片中黃芪甲苷含量的測(cè)定方法。方法：采用薄層色譜法對(duì)制劑中黃連、葛根進(jìn)行定性鑒別。采用反相高效液相色譜法測(cè)定制劑中黃芪甲苷的含量：色譜柱為T(mén)hermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(V∶V=32 ∶68)，流速為1 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。結(jié)果：定性鑒別專(zhuān)屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾；黃芪甲苷質(zhì)量范圍在0.196 2～10.172 0 μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 8，平均回收率為100.7%，RSD為2.1%(n=9)。結(jié)論：本研究結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能有效控制該制劑的質(zhì)量。

消渴平片； 反相高效液相色譜法； 黃芪甲苷

消渴平片由黃芪、黃連、葛根等12味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱瀉火之效，臨床用于陰虛燥熱、氣陰兩虛所致的消渴病，癥見(jiàn)口渴喜飲、多食、多尿、消瘦、氣短、乏力、手足心熱，以及2型糖尿病見(jiàn)上述癥候者。消渴平片為《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)任務(wù)品種，該品種原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2010年版)第1 042頁(yè)。本研究根據(jù)《2015年版藥典科研立任務(wù)單》的要求，采用薄層色譜法對(duì)消渴平片中黃連、葛根進(jìn)行定性鑒別，使用反相高效液相色譜法對(duì)制劑中黃芪的黃芪甲苷進(jìn)行定量測(cè)定，綜合評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，為該制劑提供簡(jiǎn)便、可靠的質(zhì)量控制方法。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀；Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光檢測(cè)器；Sartorius-CP225D、Sartorius-CP224S電子天平；色譜柱：Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Merck Purospher?STAR RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，資生堂C18 ACR C18(6 mm×250 mm，5 μm)。預(yù)制硅膠G薄層板，購(gòu)于Merck公司、青島海洋化工廠分廠及煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所。

1.2藥品與試劑

消渴平片(廣州中一藥業(yè)有限公司，批號(hào)：R00001、R00002、R00003；康普藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20121109、20110809、20110523；吉林萬(wàn)通藥業(yè)集團(tuán)梅河藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20110901、20111201；長(zhǎng)春英平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20120901)；黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-200613)、黃連對(duì)照藥材(批號(hào)：913-200910)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-200910)、葛根(甘葛藤)對(duì)照藥材(批號(hào)： 1175-200001)、葛根素(批號(hào)：110752-200912)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，陰性樣品為本實(shí)驗(yàn)室自制。乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑級(jí)別均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1黃連的薄層鑒別：取本品2片，研細(xì)，加氨水2 ml潤(rùn)濕，再用三氯甲烷液20 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，蒸干濾液，殘?jiān)?.5 ml甲醇使之溶解，作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.25 g，加25 ml甲醇，超聲處理(350 W，35 Hz)30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材溶液[1]。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解使成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺黃連的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法同法制成缺黃連陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、缺黃連陰性樣品溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水 (V∶V∶V∶V∶V=6.0 ∶3.0 ∶2.0 ∶1.5 ∶0.3)為展開(kāi)劑，置于用濃氨溶液預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸里，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

1～6.供試品； 7.黃連對(duì)照藥材； 8.對(duì)照品； 9.陰性樣品1-6.Test sample; 7.Coptidis Rhizoma reference herb; 8.Reference substance; 9.Negative sample圖1　黃連薄層色譜圖Fig 1　TLC chromatogram of Coptidis Rhizoma

2.1.2葛根的薄層鑒別：取本品20片，研細(xì)，加熱水適量使其溶解，放冷，加硅藻土適量，加乙酸乙酯100 ml，超聲30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? ml甲醇使其溶解，作為供試品溶液[2]。另取葛根對(duì)照藥材0.5 g，加20 ml甲醇，放置2 h，濾過(guò)，蒸干濾液，殘?jiān)蛹状?.5 ml使其溶解，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材溶液。再取葛根素對(duì)照品，加甲醇溶解，制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺葛根的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法同法制成缺葛根陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、缺葛根陰性樣品溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(V∶V∶V=7.00 ∶2.50 ∶0.25)為展開(kāi)劑[3]，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

1～6.供試品； 7.葛根對(duì)照藥材； 8.對(duì)照品； 9.陰性樣品1-6.Test sample； 7.Puerariae lobatae radix reference herb；8.Reference substance； 9.Negative sample圖2　葛根薄層色譜圖Fig 2　TLC chromatogram of Puerariae Lobatae Radix

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件：色譜柱為T(mén)hermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(V∶V=32 ∶68)[3]為流動(dòng)相；流速為1 ml/min；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；氮?dú)饬髁繛?.5 L/min；漂移管溫度為105 ℃時(shí)的色譜條件對(duì)黃芪甲苷的分離較好，靈敏度高，分析時(shí)間短。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)，取約6 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加50 ml甲醇，加熱回流45 min，放冷，過(guò)濾，用少量甲醇分次洗滌錐形瓶及濾紙，濾液和洗液合并，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇提取液液，用氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4缺黃芪陰性樣品溶液的制備：按供試品溶液的制備方法制成缺黃芪陰性樣品溶液。

2.2.5專(zhuān)屬性考察：吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與缺黃芪陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，結(jié)果顯示，缺黃芪陰性樣品無(wú)干擾，表明專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖3。

2.2.6線性關(guān)系考察：分別配制0.019 62、0.058 86、0.196 20、0.392 40、0.508 60、1.017 20 mg/ml黃芪甲苷系列對(duì)照品溶液，設(shè)定進(jìn)樣體積為10 μl，以峰面積的對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量的對(duì)數(shù)(X) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷的回歸方程為：Y=1.543 7X+7.223 5，r=0.999 8。結(jié)果表明，黃芪甲苷質(zhì)量范圍在0.196 2～10.172 0 μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7精密度(重復(fù)性試驗(yàn))：取本品(批號(hào)為R0001)，研細(xì)，取約6 g，共取6份，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，6次操作之間的RSD為4.5%(n=6)，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性良好。

A.對(duì)照品； B.供試品； C.缺黃芪陰性樣品A.Reference substance; B.Test sample; C.Negative sample without Astragali Radix圖3　高效液相色譜圖Fig 3　HPLC chromatogram

2.2.8準(zhǔn)確度(加樣回收率試驗(yàn))：取本品(批號(hào)為R0001，含黃 芪甲苷0.436 7 mg/g)9份，每份3 g(含黃芪甲苷1.310 10 mg)，分別按相當(dāng)于該批號(hào)消渴平片中黃芪甲苷含量約80%(1.048 08 mg)、100%(1.310 10 mg)、120%(1.572 12 mg)各3份加入黃芪甲苷對(duì)照品，按含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為100.7%，RSD為2.1%(n=9)，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度較好。

2.2.9樣品含量測(cè)定：取來(lái)自4個(gè)企業(yè)的9批消渴平片，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

3　討論

3.1黃連薄層鑒別

以黃連對(duì)照藥材和鹽酸小檗堿為對(duì)照，制訂黃連的薄層鑒別方法。分別考察了4種展開(kāi)劑：(1)環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(V∶V∶V∶V∶V∶V=3.0 ∶3.5 ∶1.0 ∶1.5 ∶0.5 ∶1.0)[1]；(2)乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水 (V∶V∶V∶V=10 ∶7 ∶7 ∶1)[4]；(3)正丁醇-冰醋酸-水 (V∶V∶V=7 ∶1 ∶2)[5]；(4)甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水 (V∶V∶V∶V∶V=6.0 ∶3.0 ∶2.0 ∶1.5 ∶0.3)[6]。結(jié)果表明，展開(kāi)劑(1)斑點(diǎn)不清晰，Rf值偏低；展開(kāi)劑(2)斑點(diǎn)Rf值偏高；展開(kāi)劑(3)斑點(diǎn)清晰，Rf值偏適中；展開(kāi)劑(4)斑點(diǎn)清晰， Rf值偏適中，且信息量?jī)?yōu)于展開(kāi)劑(3)，因此，選擇展開(kāi)劑(4)作為該薄層色譜的展開(kāi)劑。

表1　樣品測(cè)定結(jié)果(n=9)Tab 1　Determination results of samples (n=9)

3.2黃芪甲苷的含量測(cè)定

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法，進(jìn)一步優(yōu)化，采用反相高效液相色譜法測(cè)定制劑中黃芪甲苷的含量。對(duì)于提取方法，考察了索氏提取(4 h)、超聲處理(1 h)、加熱回流提取(1 h)3種方法[7-9]，結(jié)果表明，加熱回流提取1 h所得的黃芪甲苷含量較高，確定提取方法為加熱回流。對(duì)于提取時(shí)間，考察了加熱回流15、30、45、60 min，結(jié)果表明，加熱回流45 min所提取的黃芪甲苷含量較高，確定加熱回流提取時(shí)間為45 min。還考察了是否通過(guò)預(yù)處理好的D101大孔樹(shù)脂[10-12]，結(jié)果表明，通過(guò)D101大孔樹(shù)脂與不通過(guò)D101大孔樹(shù)脂的供試品溶液測(cè)得的黃芪甲苷含量相近，從簡(jiǎn)便操作考慮，選擇不通過(guò)D101大孔樹(shù)脂的提取方法。本品為薄膜衣片，考慮到除去包衣會(huì)增加檢驗(yàn)步驟，并會(huì)造成誤差，故對(duì)是否除去包衣進(jìn)行考察，結(jié)果表明，樣品除去與不除去包衣所測(cè)得黃芪甲苷的含量差異不大，為方便操作，采用不去包衣取樣。

3.3不同來(lái)源樣品的差異

觀察不同來(lái)源樣品所測(cè)得結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)部分供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，雖然顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，但其斑點(diǎn)較為模糊，說(shuō)明含量較低。另外在黃芪甲苷的含量測(cè)定中，不同來(lái)源的黃芪甲苷含量存在一定的差異，其中長(zhǎng)春英平藥業(yè)有限公司的消渴平片含量最低，與其他來(lái)源的差別較大。

綜上所述，本研究在《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)消渴平片標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，加以改進(jìn)[13-15]。其中，薄層色譜法鑒別黃連、葛根操作方便、專(zhuān)屬性強(qiáng)，反相高效液相色譜法測(cè)定黃芪甲苷的含量結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可以用于消渴平片的質(zhì)量控制。

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Content Determination of Astragaloside in Xiaokeping Tablets by RP-HPLCΔ

ZHOU Yingyi, LIU Xiaoxiao

(Dept.of Chinese Patent Medicine, Guangdong Institute for Drug Control, Guangdong Guangzhou 510180, China)

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of astragaloside in Xiaokeping tablets by RP-HPLC. METHODS: TLC method was used for the qualitative identification of coptidis rhizoma and puerariae lobatae radix. RP-HPLC was used to simultaneously determine the content of astragaloside in Xiaokeping tablets. The chromatographic column was Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm), the mobile phase was acetonitrile-water(V∶V=32 ∶68), with flow rate of 1 ml/min and column temperature of 30 ℃, and the detectors were evaporative light-scattering detector (ELSD). RESULTS: The qualitative identification was specific without interference in the negative reference. The linear range was 0.196 2-10.172 0 μg,r=0.999 8 for astragaloside. The average recovery rate was 100.7%,RSDwas 2.1% (n=9). CONCLUSIONS: The result of this study is accurate and reproducible, which can be used for quality control of Xiaokeping tablets.

Xiaokeping tablets; RP-HPLC; Astragaloside

2016-02-19)

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.201313040200029)

副主任藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高。E-mail：cpulxx@126.com

R927.2

A

1672-2124(2016)07-0886-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.008

*藥師。研究方向：藥品質(zhì)量控制。E-mail：wingwa.2008@163.com