夏天一，張　鳳，李志文，龐　濤，李靜嫻，樸淑娟，陳萬生，鄔　蓉

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥材科，上海200003)

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·論著·

知百安神口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)研究Δ

夏天一*，張鳳，李志文，龐濤，李靜嫻，樸淑娟，陳萬生，鄔蓉#

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥材科，上海200003)

目的：提升知百安神口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法分別對知母和百合進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對知母新芒果苷、芒果苷進(jìn)行定量檢測。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，采用梯度洗脫，流速為1 ml/min，檢測波長為246 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：薄層鑒別色譜中斑點特征明顯、專屬性好。新芒果苷、芒果苷的質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.5～210.0、10.4～208.0 μg/ml(r2均≥0.999 9)，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的RSD均<2.00%。平均加樣回收率分別為103.49% (RSD=0.86%)、98.81% (RSD=1.26%)(n=6)。結(jié)論：該方法簡便可靠，可用于提升知百安神口服液的質(zhì)量控制。

薄層色譜法； 高效液相色譜法； 知百安神口服液； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

知百安神口服液為第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院(以下簡稱“我院”)自主研發(fā)的醫(yī)院制劑，為中藥知母與百合經(jīng)加工炮制而得。原方始見于漢代張仲景的《金匱要略》，由百合7枚、知母3兩組成，具有清熱養(yǎng)陰、除煩潤燥的功效[1]，臨床上可用于以抑郁、煩躁不安、失眠、疲乏、烘熱等為主癥的圍絕經(jīng)期綜合征的治療[2-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，知母中黃酮類活性成分能抑制Na+-K+-ATP酶的活性，減少組織耗氧量，并具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等藥理活性[5-7]。目前主要通過對知母中黃酮類主要成分新芒果苷與芒果苷進(jìn)行含量測定以及對知母進(jìn)行薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)鑒別，實現(xiàn)知母百合藥的質(zhì)量控制，但鮮有文獻(xiàn)提及百合的特異性TLC鑒別[8-10]。因此，為提升知百安神口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保用藥安全、有效，本研究同時對知母與百合進(jìn)行了TLC鑒別，并采用高效液相色譜法(high performance liquid chroma-tography，HPLC)測定了口服液中新芒果苷與芒果苷的含量。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1200系列HPLC儀(美國Agilent公司)；CPA225D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；SK7200H型超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；功率：350 W，頻率：53 kHz)。

1.2藥品與試劑

知百安神口服液(我院自制，批號：120208、130323、140327)；新芒果苷對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB6977，純度>98%)、芒果苷對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB6776，純度>98%)；甲醇、乙腈、二氯甲烷(德國默克公司，色譜純)；甲酸(美國天地公司，色譜純)；乙醚、丙酮、正丁醇、冰醋酸、硫酸、乙酸乙酯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)；香草醛(廣東光華科技股份有限公司，純度>98%)；百合藥材(產(chǎn)自湖南)，知母藥材(產(chǎn)自河北)；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1知母：取本品10 ml，加熱回流1 h，濃縮至約2 ml，加30%丙酮3 ml，混勻，作為供試品溶液。另取知母藥材1 g，加入30%丙酮30 ml超聲30 min，濾過，將濾液濃縮至1 ml，制成對照藥材溶液。另取缺知母的陰性樣品，按供試品溶液制備方法操作，制得陰性對照溶液。按照《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)TLC試驗[11]，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=4 ∶1 ∶5)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃顯色至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照藥材色譜無相應(yīng)斑點，見圖1。

1～3.供試品溶液(1.批號：120208；2.批號：130123；3.批號：140327)；4.知母對照藥材溶液；5.缺知母陰性對照溶液1-3.Test sample solution (1.Batch: 120208 2.Batch: 130123; 3.Batch: 140327); 4.Solution of anemarrhenae rhizome;5.Negative control without anemarrhenae rhizoma圖1　知母的薄層色譜圖Fig 1　TLC chromatogram of anemarrhenae rhizoma

2.1.2百合：取本品10 ml，用15 ml水飽和的正丁醇萃取，將上層萃取液揮干，用2 ml丙酮超聲溶解，濾過，作為供試品溶液。另取百合藥材1 g，加入30 ml甲醇超聲30 min，濾過，將濾液濃縮至1 ml，制成對照藥材溶液。另取缺百合的陰性樣品，按供試品溶液制備方法操作，制得陰性對照溶液。按照TLC試驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一TLC Silica gel 60 RP-18 反向鍵合薄層層析板上，以丙酮-水(V∶V=1 ∶1，每10 ml展開劑中加入2滴甲酸)為展開劑，展開，取出，晾干，在254 nm紫外光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照藥材色譜無相應(yīng)斑點，見圖2。

1～3.供試品溶液(1.批號：120208；2.批號：130123；3.批號：140327)；4.百合對照藥材溶液；5.缺百合陰性對照溶液1-3. Test sample solution (1.Batch: 120208 2.Batch: 130123; 3.Batch: 140327); 4. Solution of lilii bulbus; 5.Negative control without lilii bulbus圖2　百合的薄層色譜圖Fig 2　TLC chromatogram of Lilii bulbus

2.2含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸酸水溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序詳見表1；流速為1 ml/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為246 nm；進(jìn)樣量為20 μl。按上述條件進(jìn)樣測定，理論塔板數(shù)以新芒果苷計算均>20 000，以芒果苷計算均>30 000，待測化合物分離度均>1.5。陰性對照溶液在待測化合物出峰位置處無干擾峰，供試品溶液中待測化合物與其他組分色譜峰能夠?qū)崿F(xiàn)良好分離，見圖3。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.新芒果苷；2.芒果苷A.Mixed reference solution; B.Test sample solution; C.Negative control solution; 1.Neomangiferin; 2.Mangiferin圖3　高效液相色譜圖Fig 3　HPLC chromatogram

2.2.2混合對照品溶液：精密稱取新芒果苷、芒果苷對照品各10.50、10.40 mg，分別置于同一10 ml容量瓶中，加10%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液：精密量取知百安神口服液(批號：120208)1 ml，用1 ml二氯甲烷萃取，靜置分層，吸取上層水相200 μl，加入10%甲醇200 μl，13 400 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，即得。

2.2.4陰性對照溶液：按處方工藝制備除知母外的全部藥材，按成品工藝及“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5線性關(guān)系考察：分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液200、150、100、75、50、20、10 μl，置于1 ml容量瓶中，用10%甲醇定容至刻度，搖勻，制得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。再按“2.2.1”項下色譜條件依次連續(xù)進(jìn)樣測定，平行進(jìn)樣3次，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/ml)進(jìn)行線性回歸，得新芒果苷、芒果苷線性方程分別為Y=53.92X-26.88(r2=0.999 9)、Y=66.38X-21.67(r2=0.999 9)。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷的質(zhì)量濃度分別在10.5～210.0、10.4～208.0 μg/ml范圍內(nèi)與各自的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6精密度試驗：精密量取吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件平行進(jìn)樣6次測定。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷峰面積的RSD分別為0.23%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗：精密量取知百安神口服液(批號：120208)適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷峰面積的RSD分別為0.75%、0.72%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性試驗：精密量取知百安神口服液(批號：120208)適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，6份供試品溶液中新芒果苷、芒果苷的平均含量分別為190.74、128.58 μg/ml，峰面積的RSD分別為0.89%、1.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9加樣回收率試驗：精密量取知百安神口服液(批號：120208)6份，每份1 ml，按各成分含量的100%加入新芒果苷、芒果苷，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.2.10樣品含量測定：精密量取3批知百安神口服液適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行進(jìn)樣3次，按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表3。

表2　加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab 2　Results of recovery test (n=6)

表3　樣品含量測定結(jié)果Tab 3　Content determination results of samples ±s, μg/ml)

3　討論

3.1TCL鑒別

知百安神口服液中知母與百合的化學(xué)成分相似度較高，現(xiàn)有文獻(xiàn)中未見百合的特異性TLC鑒別的相關(guān)報道[1,12-13]。為完善知百安神口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究增加了百合的TLC鑒別項。對百合進(jìn)行TLC條件摸索時，參照《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)[11,14]，采用正向薄層層析板，嘗試不同展開劑，供試品溶液均未顯示與陰性對照品溶液的特異性差別。最終，通過對百合、知母化學(xué)成分進(jìn)行辨析，選擇TLC Silica gel 60 RP-18 反向鍵合薄層層析板，以丙酮-水(V∶V=1 ∶1，每10 ml展開劑中加入2滴甲酸)為展開劑，實現(xiàn)了百合的TLC鑒別。

3.2提取方法的考察

知百安神口服液系復(fù)方知母與百合的水煎液，極性雜質(zhì)含量較高，增加了待測化合物的分離難度。為降低雜質(zhì)含量、簡化提取條件，本研究選取不同溶劑對口服液進(jìn)行萃取。在對水飽和正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯進(jìn)行萃取效率考察后發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷的除雜質(zhì)效果較好，萃取效率較高。最終，本研究選用二氯甲烷作為萃取溶劑。

3.3色譜柱的考察

本研究選用不同廠家的色譜柱，對待測化合物的分離條件進(jìn)行優(yōu)化。分別使用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HP-SCX(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，按上述“2.2.1”項色譜條件下分析同一批樣品(批號：120208)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HP-SCX(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱均不能實現(xiàn)待測化合物(新芒果苷、芒果苷)與鄰近雜質(zhì)色譜峰良好的基線分離，僅Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱可以在控制分析時間的基礎(chǔ)上實現(xiàn)待測化合物與雜質(zhì)的有效色譜分離(R>1.5)。最終，本研究選用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

綜上所述，本方法簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可對醫(yī)院制劑知百安神口服液進(jìn)行全面、有效的質(zhì)量控制。

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Study on Quality Improvement of Zhibaianshen Oral LiquidΔ

XIA Tianyi, ZHANG Feng, LI Zhiwen, PANG Tao, LI Jingxian, PIAO Shujuan, CHEN Wansheng, WU Rong

(Dept.of Pharmacy, Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

OBJECTIVE：To improve the quality standard of Zhibaianshen oral lquid. METHODS: Anemarrhenae rhizoma and lilii bulbus were identified by TLC method, and the concentration of neomangiferin and mangiferin were determined by HPLC method. Separation was carried out on a Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) column with the mobile phase of acetonitrile and 0.2% formic acid in gradient elution at a flow rate of 1 ml/min. The detection wavelength was set at 246 nm, the column temperature was 30 ℃, and the injection volume was 20 μl. RESULTS: The characteristics of spots in TLC were quite clear with strong specificity. As for neomangiferin and mangiferin, the linear range of the calibration curve was 10.5-210.0 and 10.4-208.0 μg/ml, respectively (r2≥0.999 9), and the results of precision, accuracy and stability were satisfactory withRSDless than 2.00%. The average recovery rate turned out to be 103.49% (RSD=0.86%) and 98.81% (RSD=1.26%) (n=6). CONCLUSIONS: The established method is simple and reliable, which can be used for the quality control of Zhibaianshen oral liquid.

TLC; HPLC; Zhibaianshen oral liquid; Quality standard

2016-03-29)

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2013ZX09507005)

主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：wrkgyl@126.com

R927.11

A

1672-2124(2016)07-0880-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.006

*藥師，在讀博士研究生。研究方向：藥物分析與臨床藥學(xué)。E-mail：yoyosummer31823@126.com