謝紅英，雍智全2，王夢(mèng)麗，馮亞男，孫嘉茵，李宇茜，徐小平

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.東莞達(dá)信生物科技有限公司，廣東 東莞 523808）

系統(tǒng)組織工程技術(shù)優(yōu)化的正丁胺含量離子色譜檢測(cè)

謝紅英1，雍智全2，王夢(mèng)麗1，馮亞男1，孫嘉茵1，李宇茜1，徐小平1

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.東莞達(dá)信生物科技有限公司，廣東 東莞 523808）

該文采用系統(tǒng)組織工程技術(shù)（ZTSO）快速優(yōu)化并建立正丁胺含量測(cè)定的離子色譜法。選用AcelaimTMTrinityTMP1（3.0mm×100mm，3μm）為色譜柱，18mmol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)pH 3.4）∶乙腈（56∶44，ν∶ν）為淋洗液，在柱溫37℃，流量0.15 mL/min的條件下等度洗脫，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，20min內(nèi)完成正丁胺的含量測(cè)定。結(jié)果表明：正丁胺質(zhì)量濃度在10.01～500.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.999 8），檢測(cè)限為5.05 μg/mL（S/N≥3），定量限為10.01 μg/mL （S/N≥10），日內(nèi)和日間精密度分為0.33%和0.90%，正丁胺供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定（RSD=0.54%），3批正丁胺原料的平均含量為99.79%（RSD=0.125%），3批腫瘤血管抑制劑XY03中正丁胺的平均含量為20.32%（RSD=4.09%），熱干燥時(shí)，XY03中銨鹽的下降率與其溶解度呈正相關(guān)。ZTSO技術(shù)具有較好的條件優(yōu)化功能，所建立的方法快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確，是正丁胺或含正丁銨鹽化合物含量測(cè)定的較好方法。

正丁胺；離子色譜法；含量測(cè)定；系統(tǒng)組織工程技術(shù)

0　引　言

ZTSO系統(tǒng)組織工程技術(shù)是世界首創(chuàng)的集“試驗(yàn)設(shè)計(jì)”與“數(shù)據(jù)決策”于一體的系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)，它以數(shù)學(xué)、系統(tǒng)論、控制論、協(xié)同學(xué)、開放系統(tǒng)耗散結(jié)構(gòu)理論等為基礎(chǔ)，以最少量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)快速整理出符合組織規(guī)劃的優(yōu)化系統(tǒng)，使系統(tǒng)表現(xiàn)出最大的效能［1］。正丁胺是一種常見(jiàn)的小分子有機(jī)胺，廣泛用于化工和制藥業(yè)。藥物研究中利用其毒性低、安全性較好（LD50≥500mg/kg）且具有堿性并與有機(jī)酸成鹽的性質(zhì)，可改善不溶性有機(jī)酸類藥物的水溶性，提高藥物的生物利用度。本文所涉及的創(chuàng)新腫瘤血管抑制劑XY03［2］即是利用了CA4酸與正丁胺成鹽后，水溶性改善，使不溶性的CA4酸的溶解度提高至20%，提高了抗癌藥XY03體內(nèi)吸收，擴(kuò)大了藥品制劑的給藥途徑。然而，極性較大的小分子有機(jī)胺-正丁胺是色譜分離分析的難點(diǎn)，目前檢測(cè)中主要采用氣相色譜法（GC）［3］和氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用技術(shù)［4］，色譜峰多嚴(yán)重拖尾，同時(shí)檢測(cè)靈敏度也偏低。若采用衍生化去極性，或者采用低極性柱或堿性柱來(lái)克服拖尾問(wèn)題，又將引入更多誤差。高效液相色譜法（HPLC）分離，也因有機(jī)胺的保留較差，難與溶劑峰分離且多無(wú)紫外吸收受到限制［5］。隨著離子色譜儀的普及，現(xiàn)在多采用離子色譜法對(duì)不同樣品中的小分子胺［6-10］、有機(jī)酸［11］、多糖［9］和內(nèi)源性代謝胺［12-13］等進(jìn)行分析，但針對(duì)正丁胺及含正丁銨鹽化合物中正丁胺（銨）的定量檢測(cè)方法及其評(píng)價(jià)還少有涉及。所以，本文采用離子色譜法分離，以電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)正丁胺，并采用ZTSO技術(shù)快速優(yōu)化分離條件，建立并評(píng)價(jià)快速分離測(cè)定正丁胺含量的方法并應(yīng)用于腫瘤血管抑制劑XY03的原料正丁胺和XY03的質(zhì)量研究。

表1　參數(shù)邊界分布表

表2　不同預(yù)設(shè)試驗(yàn)方案

表3　不同試驗(yàn)方案下的色譜行為結(jié)果

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、技術(shù)與試劑

儀器：CIC-D160盛瀚離子色譜儀 （山東青島離子色譜科技有限公司）；品成純水器（成都品成科技有限公司）；BT 125D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

試劑：分析純乙酸銨（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；色譜純乙腈（廣東光華科技有限公司）；正丁胺（成都市科龍化工試劑廠）；超純水（自制）；XYO3供試品（自制）。

ZTSO系統(tǒng)組織工程技術(shù)（成都萬(wàn)維優(yōu)方科技有限公司提供）。

1.2溶液的制備

1.2.1對(duì)照品溶液

精密稱取正丁胺約20mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為200μg/mL溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2供試品溶液

精密稱取正丁胺約20mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度200μg/mL的溶液，作為正丁胺供試品溶液。另取XY03供試品粉末10mg，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成500μg/mL的溶液，作為XY03的供試品溶液。

1.3色譜條件的優(yōu)化

ZTSO系統(tǒng)組化技術(shù)將以較少的探測(cè)實(shí)驗(yàn)，提供影響參數(shù)與分離和柱效的關(guān)系，再經(jīng)計(jì)算獲得最佳分離條件，每次試驗(yàn)3個(gè)方案，通過(guò)2～3輪實(shí)驗(yàn)獲得相關(guān)結(jié)果，如表1和表2所示。

1.4色譜條件

按表1設(shè)置邊界參數(shù)，利用ZTSO設(shè)計(jì)第1次優(yōu)化的3項(xiàng)試驗(yàn)，并根據(jù)其結(jié)果設(shè)計(jì)第2次優(yōu)化的3項(xiàng)試驗(yàn)，得到如表3所示第2次結(jié)果。綜合表中參數(shù)，確定第6項(xiàng)試驗(yàn)中色譜條件為最終條件。色譜柱：AcelaimTMTrinityTMP1（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相：18mmol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)pH 3.4）∶乙腈（56∶44，ν∶ν）；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；柱溫：37℃；流量：0.15mL/ min；進(jìn)樣量：25μL；進(jìn)樣濃度：200μg/mL。對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，正丁胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得大于2.0，保留時(shí)間是14.14min。

圖1　ZTSO技術(shù)優(yōu)化正丁胺離子色譜前后的色譜圖

1.5方法學(xué)考察

1.5.1專屬性

分別將XYO3供試品溶液于高溫120℃破壞1 h、加1mol/L鹽酸破壞2h，加10%H2O2氧化2h進(jìn)行破壞，破壞后的供試品溶液經(jīng)1.4項(xiàng)色譜條件分離，破壞出的雜質(zhì)均不影響正丁胺主成分峰的分離，說(shuō)明所建立的色譜條件具有良好的專屬性。

1.5.2線性、檢出限和定量限

精密量取正丁胺對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋制成7個(gè)不同質(zhì)量濃度（10.01，20.02，50.5，100.1，200.2，400.4，500.5 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度與峰面積回歸計(jì)算正丁胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，得到線性回歸方程式為y=1 142x+634.4，相關(guān)系數(shù)為0.9998，見(jiàn)圖2，表明正丁胺在10.01～500.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢測(cè)限為5.05 μg/mL（S/N≥3），定量限10.01 μg/mL （S/N≥10）。

圖2　正丁胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.3精密度

取正丁胺對(duì)照品溶液，按1.4下條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，按峰面積計(jì)算進(jìn)樣精密度為0.33%；取同一批XY03樣品6份，按照1.2.2制成供試品溶液，按外標(biāo)法測(cè)定被測(cè)組分含量，按含量計(jì)算重復(fù)性精密度為1.21%；分別于6d內(nèi)，按照外標(biāo)法每天測(cè)定XY03樣品中正丁胺的含量，其含量日間精密度為0.90%。

1.5.4溶液穩(wěn)定性

精密稱取一份XY03樣品，按照1.2.2配制XY03供試品溶液，放置24 h，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣，按照外標(biāo)法計(jì)算含量，得樣品在24 h內(nèi)正丁胺的含量RSD為0.54%，表明該樣品溶液在室溫條件下穩(wěn)定。

1.5.53批正丁胺和XY03小試的正丁胺含量

分別取3批正丁胺及XY03樣品，按照1.2.2配制供試品溶液，進(jìn)樣，按照外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　3批正丁胺原料和XY03中正丁胺的含量（x±RSD，n=6）

1.5.6XY03干燥時(shí)間對(duì)正丁胺含量的影響

取XY03供試品粉末適量，置于培養(yǎng)皿中，40℃的烘箱加熱干燥，分別于0.5，1，2，4，8，12h取樣適量，按照1.2.2項(xiàng)下制備XY03供試品溶液，照1.4項(xiàng)下色譜條件分離測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算正丁胺的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　XY03在不同干燥時(shí)間正丁胺含量的下降率和XY03溶解度下降率

2討　論

2.1ZTSO系統(tǒng)組織工程技術(shù)的特點(diǎn)

若本文采用單因素實(shí)驗(yàn)，則按照每一個(gè)因素最少3次試驗(yàn)，5個(gè)因素至少要做15個(gè)試驗(yàn)，如果因素再多或者水平再增加，那么試驗(yàn)的次數(shù)還會(huì)幾何增長(zhǎng)，且不一定獲得最佳條件；但是，采用ZTSO技術(shù)，只需6次，最多不超過(guò)10次試驗(yàn)，即能優(yōu)化出最佳條件，使柱效從最初的理論搭板數(shù)（1396）上升至3638，大大縮短色譜條件的篩選時(shí)間。

2.2正丁胺分離中淋洗液的影響特點(diǎn)

正丁胺的離子色譜法分離具有一定難度，由于分子量相對(duì)于甲胺、乙胺等較大，同時(shí)極性均較強(qiáng)，當(dāng)采用陽(yáng)離子交換柱時(shí)，所用的強(qiáng)酸淋洗液對(duì)陽(yáng)離子銨鹽的洗脫也有所不同。實(shí)驗(yàn)表明，不同強(qiáng)酸淋洗液對(duì)柱效的貢獻(xiàn)順序分別為5.5mmol/L苯磺酸（n=589；T=1.21）+5.5mmol/L硝酸（n=693，T=3.23）＜5.5mmol/L苯磺酸+10%乙腈（n=935，T=2.84）＜10 mmol/L鹽酸 （n=1 084，T=1.39）＜5.5 mmol/L苯磺酸+20%乙腈（n=1 346，T=1.98）＜5.5mmol/L鄰苯二甲酸（n=1488，T=1.87）。即便如此，采用陽(yáng)離子柱分離小分子胺時(shí)，淋洗液的酸度有助于有機(jī)胺的柱效升高和拖尾改善，但柱效的升高遠(yuǎn)未達(dá)到要求，其原因還是銨離子的極性太強(qiáng)，與固定相陰陽(yáng)離子結(jié)合過(guò)于牢固。當(dāng)適當(dāng)添加一定量的乙腈改性時(shí)，有利于正丁胺的柱效改善，推測(cè)與作用有機(jī)胺的有機(jī)部分關(guān)聯(lián)。此外，需考察不同色譜柱對(duì)分離效果的影響 （如圖3所示），單純采用C18柱，極性較高的正丁胺幾乎無(wú)保留，與溶劑峰難以分離；當(dāng)采用陽(yáng)離子柱分離時(shí)，正丁胺表現(xiàn)出較嚴(yán)重的拖尾，且峰寬較大，淋洗液洗脫較困難，柱效難以突破2 000，分析原因?yàn)楣潭ㄏ嘀谢撬峄年庪x子與銨陽(yáng)離子的結(jié)合較強(qiáng)。當(dāng)采用兩性離子色譜柱AcelaimTMTrinityTMP1柱時(shí)，由于固定相為硅膠基質(zhì)，并采用了納米聚合物硅膠混合技術(shù)（NSH），柱填料表面提供多種保留機(jī)制，同時(shí)具有反相（RP）、陰離子交換、陽(yáng)離子交換能力，從而減輕了對(duì)銨離子的保留能力；所以，柱效有明顯改善。加之通過(guò)ZTSO優(yōu)化，最終獲得3 600以上的柱效，滿足試驗(yàn)要求。

圖3　不同色譜柱的分離組合圖

3　結(jié)束語(yǔ)

本文采用ZTSO優(yōu)化的離子色譜檢測(cè)XY03及正丁胺原料中正丁胺含量，并考察了XY03中銨鹽含量與其溶解度的關(guān)系，結(jié)果表明XY03的銨鹽基的下降與XY03的溶解度下降呈正相關(guān)，并且隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)，銨鹽分解加重，XY03的溶解度下降加重，證明了XY03中銨鹽的熱不穩(wěn)定性。

綜上，ZTSO系統(tǒng)組織工程技術(shù)具有較好的色譜條件快速優(yōu)化作用；本法快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和準(zhǔn)確，可用于XY03及其原料正丁胺的定量分析。

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（編輯：莫婕）

Ion chromatography determination of n-butylamine content based on ZTSO optimization

XIE Hongying1，YONG Zhiquan2，WANG Mengli1，F(xiàn)ENG Ya'nan1，SUN Jiayin1，LI Yuqian1，XU Xiaoping1
（1.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Dongguan Daxin Biotech Co.，Ltd.，Dongguan 523808，China）

Zhang's technique system organization（ZTSO）has been rapidly optimized and ion chromatography determination of n-butylamine content has been established.AcelaimTMTrinityTMP1 （3.0 mm×100 mm，3 μm）was adopted as chromatographic column.The leacheate was 18 mmol/L ammonium acetate（adjust pH 3.4 by using acetic acid）-acetonitrile（56∶44，ν∶ν），and the detector was conductivity detector.Under the condition of 37℃ column temperature and isocratic elution at a flow rate of 0.15 mL/min，the measurement of n-butylamine content could be done in 20 minutes. Show that there was a good linear relationship（r2=0.9998）at range of the concentration of 10.01-500.5μg/mL，the limit of detection is 5.05μg/mL（S/N≥3），the limit of quantization is 10.01μg/mL （S/N≥10），the intra-day and the inter-day precision were at 0.33%and 0.90%respectively，nbutylamine solution was stable（RSD=0.54%）in 24 hours.The average content of n-butylamine raw materials in three batches are 99.79%（RSD=0.125%），the average n-butylamine content is 20.32%（RSD=4.09%）in three batches of tumor angiogenesis inhibitors XY03.When heat drying，the decrease rate of ammonium salt in XY03 was positively related to its solubility.ZTSO technology has good conditions for optimizing function.The method is rapid，simple and accurate，which is a better method for the assay of n-butylamine or containing the butyl ammonium of compounds.

n-butylamine；ion chromatography；content assay；ZTSO

A

1674-5124（2016）07-0035-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.07.007

2015-12-27；

2016-01-15

謝紅英（1991-），女，四川成都市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。

徐小平（1962-），男，四川成都市人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥品質(zhì)量控制和藥物代謝分析研究。