吳　偉,黃美健

(安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院/杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，杭州 310009)

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谷氨酰胺對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者PBMC中p38MAPK及IL-8的影響*

吳偉,黃美健△

(安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院/杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，杭州 310009)

目的探討谷氨酰胺(Gln)對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性和白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)的影響。方法選擇32例COPD急性加重期(AECOPD)患者為研究對(duì)象，設(shè)為AECOPD組，將治療后轉(zhuǎn)為COPD穩(wěn)定期(SCOPD)的上述患者設(shè)為SCOPD組，收集各組PBMC，分別以Gln進(jìn)行干預(yù)，另選擇同期16例健康者為健康對(duì)照組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)5組PBMC中p38MAPK、IL-8的表達(dá)水平。結(jié)果(1)AECOPD和SCOPD的空白對(duì)照組中p38MAPK、IL-8的表達(dá)均高于健康對(duì)照組(分別P<0.01，P<0.05),且急性期高于穩(wěn)定期(P<0.05)。(2)AECOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達(dá)低于AECOPD空白對(duì)照組(P<0.01)；SCOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達(dá)低于SCOPD空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論Gln可抑制COPD患者炎性細(xì)胞中p38MAPK通路的活化，并下調(diào)IL-8的表達(dá)。

肺疾病，慢性阻塞性；谷氨酰胺；p38絲裂原活化蛋白激酶；白細(xì)胞介素-8

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率都很高，據(jù)世界衛(wèi)生組織公布，2020年COPD將位居全球死亡原因的第3位[1]。COPD急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)和并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者整體疾病的嚴(yán)重程度，給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。越來(lái)越多的研究表明，肺部炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與炎性細(xì)胞活性密切相關(guān)[2]，因此有效抑制或阻斷炎性細(xì)胞及促炎因子的活化環(huán)節(jié)以防治COPD，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是人體應(yīng)激狀態(tài)下的一種條件必需氨基酸，既往大多研究集中在其對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良患者的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用，關(guān)于其對(duì)COPD患者抗炎作用的研究很少，特別是其能否通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)通路的活化，降低白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-8水平，筆者尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)應(yīng)用Gln干預(yù)AECOPD和COPD穩(wěn)定期(stable chronic obstructive pulmonary disease，SCOPD)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，觀察其對(duì)PBMC中p38MAPK、IL-8基因表達(dá)水平的影響，探討Gln在COPD治療中的抗炎作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用Gln治療COPD提供新的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料2014年5月至2015年4月本院呼吸內(nèi)科確診為AECOPD的住院患者32例，其中男17例，女15例；年齡56～78歲，平均(73.2±6.7)歲；所有COPD患者平均病程(28±8)年。上述32例患者經(jīng)常規(guī)治療10～20 d,病情穩(wěn)定進(jìn)入緩解期后設(shè)為SCOPD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)制訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013修訂版)》[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)近半個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)糖皮質(zhì)激素治療(包括口服、靜脈或吸入劑等)；(3)未高流量吸氧(吸氧濃度≤35%)及未行機(jī)械通氣；(4)不吸煙或已戒煙5年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、內(nèi)分泌血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤或經(jīng)歷重大手術(shù)等；(2)合并可致咳嗽、咳痰、氣短等癥狀的其他疾病，如肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、彌漫性泛細(xì)支氣管炎、閉塞性細(xì)支氣管炎等。另選本院同期體檢健康者16例為健康對(duì)照組，其中男9例，女7例；年齡53～77歲，平均(67.4±7.3)歲。入選的COPD患者和健康對(duì)照組比較，性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入的所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑Gln(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1353655)；人淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：108K2031)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司，批號(hào)：D2640A-CK101D]；定量試劑盒Power SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司，批號(hào)：4367659)；CFX384多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳系統(tǒng)Mini-Proten Tetra System、凝膠成像儀ChemiDoc XRS+ System(美國(guó)Bio-RAD公司)；Du-640紫外分光光度儀(美國(guó)Beckman公司)。

1.3方法

1.3.1PBMC的提取及分組所有研究對(duì)象取清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)將靜脈血充分稀釋。然后將稀釋后的10 mL靜脈血緩慢地加入裝有4 mL淋巴細(xì)胞分離液的15 mL離心管中，2 000 r/min離心20 min，離心后管內(nèi)液體分為4層，緩慢地吸取位于第2層的PBMC，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，加入5倍體積PBS液洗滌、1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌1次，底層沉淀為PBMC，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，排除無(wú)活性的細(xì)胞，活細(xì)胞所占百分比大于90%可采用。用培養(yǎng)液將上述提取的PBMC濃度調(diào)節(jié)至2.0×106/mL，并接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入細(xì)胞混勻液1 mL，其中AECOPD組患者平均分成兩組：(1)Gln組：PBMC中加入終濃度為8 mmol/L的Gln；(2)空白對(duì)照組：僅用無(wú)Gln RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。SCOPD組患者也平均分成兩組：(1)Gln組：PBMC中加入終濃度為8 mmol/L的Gln；(2)空白對(duì)照組：僅用無(wú)Gln RPMI-1640培養(yǎng)液。健康對(duì)照組僅用無(wú)Gln RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37 ℃ 25% CO2溫箱里培養(yǎng)24 h。

1.3.2p38MAPK及IL-8基因表達(dá)的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)。用Trizol法提取上述培養(yǎng)后細(xì)胞的總RNA，并測(cè)定RNA的濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR引物由上海生物工程有限公司按照引物設(shè)計(jì)原則采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成。其中IL-8引物序列：上游5′-CCA AAC CTT TCC ACC CCA AAT-3′，下游5′-CAC AAC CCT CTG CAC CCA GTT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度146 bp；p38MAPK引物序列：上游5′-GAC TTG CTG GAG AAG ATG CTT GT-3′，下游5′-GTC CCT GCT TTC AAA GGA CTG AT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度147 bp；18sRNA內(nèi)參序列：上游5′-GAC TCA ACA CGG GAA ACC TCA C-3′，下游5′-CCA GAC AAA TCG CTC CAC CAA C-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度122 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃，15 s；63 ℃，25 s；熔點(diǎn)曲線分析55～95 ℃。反應(yīng)體系(20 μL)如下：上游和下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL，雙蒸水8.0 μL。試驗(yàn)樣品經(jīng)定量PCR得到各反應(yīng)孔循環(huán)閾值(Ct值)后運(yùn)用相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。其中△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，△Ct值越大說(shuō)明表達(dá)越低。

2　結(jié)　果

2.1目的基因及內(nèi)參電泳圖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電泳條帶和設(shè)計(jì)的擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度全部符合，擴(kuò)增條帶為目的條帶，表明擴(kuò)增的特異性較高，見(jiàn)圖1；具有單一主峰的各個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物熔點(diǎn)曲線圖表明引物RT-PCR擴(kuò)增是特異性的擴(kuò)增，見(jiàn)圖2。

A：p38MAPK；B：IL-8；C：18s rRNA；M：內(nèi)標(biāo)；1～6：各目的基因擴(kuò)增條帶。

圖1目的基因及內(nèi)參電泳圖

A：p38MAPK；B：IL-8；C：18s rRNA。

圖2目的基因及內(nèi)參擴(kuò)增曲線圖

2.2各組PBMC中p38MAPK及IL-8的△Ct值變化(1)AECOPD和SCOPD的空白對(duì)照組中p38MAPK、IL-8的表達(dá)均高于健康對(duì)照組(分別P<0.01，P<0.05),且急性期高于穩(wěn)定期(P<0.05)。(2)AECOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達(dá)低于AECOPD空白對(duì)照組(P<0.01)；SCOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達(dá)低于SCOPD空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組PBMC中p38MAPK及IL-8的△Ct值比較

*：P<0.01，與健康對(duì)照組比較；#：P<0.05，與健康對(duì)照組比較；△：P<0.01，與AECOPD Gln組比較；▲：P<0.05，與SCOPD Gln組比較。

3　討　論

在COPD的整個(gè)病程中，炎癥一直被認(rèn)為是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[3]。p38MAPK作為一種MAPK家族中的重要成員，是啟動(dòng)炎性細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，觸發(fā)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵，前者可被多種應(yīng)激刺激、炎性因子等激活，從而影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和細(xì)胞表面受體表達(dá)等，與細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)[4]。Marumo等[5]報(bào)道香煙暴露小鼠肺氣腫的形成與p38MAPK通路的激活有密切關(guān)系。Gaffey等[6]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者的肺巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞中p38MAPK的表達(dá)明顯高于健康者，同時(shí)應(yīng)用其抑制劑可以明顯降低IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性介質(zhì)的釋放。IL-8作為趨化因子的一種，參與了中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集與活化，并且誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞IL-8基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致IL-8的進(jìn)一步釋放，由此形成氣道內(nèi)的炎性循環(huán)。Liu等[7]的研究表明，AECOPD患者血清和呼出氣冷凝液中IL-8表達(dá)明顯增加。王彥霞等[8]發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者PBMC中的IL-8和TNF-α水平高于治療后和對(duì)照組，且與第1秒最大呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1/Pre%)呈明顯負(fù)相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在香煙誘導(dǎo)的COPD小鼠的PBMC中，IL-6和IL-8的表達(dá)是明顯增加的，并且抑制p38MAPK通路可以減少二者的表達(dá)[9]。也有研究表明，COPD患者誘導(dǎo)痰中p38MAPK和IL-8表達(dá)明顯，p38MAPK的活化與IL-8和中性粒細(xì)胞的水平，以及患者肺功能的降低有明顯相關(guān)性[10]。由此可見(jiàn)， p38MAPK在COPD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色。因此，以p38MAPK通路為靶點(diǎn)，降低促炎因子的表達(dá)，是臨床治療COPD的新途徑。

Gln是體內(nèi)含量最多的條件必需氨基酸之一，作為免疫系統(tǒng)的主要能源，具有促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、保護(hù)胃腸黏膜、參與免疫細(xì)胞的能量代謝等作用。正常情況下人體中Gln含量較豐富，但在高代謝條件下機(jī)體對(duì)其需要量遠(yuǎn)大于自身合成能力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，Gln對(duì)COPD合并營(yíng)養(yǎng)不良患者免疫功能有顯著改善作用[11]。研究人員發(fā)現(xiàn)，Gln能抑制敗血癥小鼠p38MAPK通路、核因子κB(NF-κB)通路的激活，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Gln的治療能明顯降低TNF-α和IL-18等炎性因子的表達(dá)水平[12]。Lee等[13 ]發(fā)現(xiàn)小鼠模型氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集與p38MAPK及其下游通路絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)通路介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2(CPA2)的活化有關(guān)，Gln可通過(guò)阻斷該通路來(lái)減少炎性細(xì)胞的聚集?；诩韧芯抗P者發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)有關(guān)Gln的研究?jī)H局限于Gln的抗氧化功能及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能，且Gln與p38MAPK通路的激活及細(xì)胞因子表達(dá)的抗炎機(jī)制研究也僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。因此，筆者前期研究通過(guò)應(yīng)用Gln干預(yù)COPD患者的PBMC，觀察其對(duì)NF-κB通路和TNF-α的影響，結(jié)果表明Gln可抑制NF-κB通路的活化，降低TNF-α的表達(dá)[14]。那么Gln是否同樣可抑制COPD患者p38MAPK通路并降低IL-8的表達(dá)，進(jìn)一步起到對(duì)COPD的抗炎作用，需要進(jìn)一步探討。 目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)關(guān)于Gln對(duì)COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8表達(dá)影響的研究報(bào)道。因此，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步研究，探討Gln對(duì)COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8表達(dá)的影響。

本研究以AECOPD患者PBMC為研究靶點(diǎn)，運(yùn)用Gln干預(yù)其治療前后的PBMC，檢測(cè)PBMC中p38MAPK、IL-8的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，p38MAPK、IL-8在COPD患者炎性細(xì)胞中表達(dá)。AECOPD治療前、后空白對(duì)照組較健康對(duì)照組表達(dá)水平高，且急性加重期高于穩(wěn)定期，這也揭示了p38MAPK、IL-8在COPD整個(gè)病程中長(zhǎng)期持續(xù)地存在，表明了p38MAPK、IL-8與COPD的發(fā)生、發(fā)展有著極為密切的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Gln干預(yù)后的AECOPD組和SCOPD組其p38MAPK、IL-8表達(dá)明顯低于未予Gln干預(yù)的空白對(duì)照組。提示了Gln可抑制COPD患者PBMC中p38MAPK通路的活化，抑制炎性介質(zhì)IL-8的表達(dá)，證實(shí)了Gln對(duì)COPD有一定的抗炎作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明COPD患者PBMC中的p38MAPK、IL-8與COPD炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展明顯相關(guān)；Gln能抑制COPD患者PBMC中p38MAPK通路的活化并降低炎性介質(zhì)IL-8的表達(dá)，從而起到對(duì)COPD患者的抗炎作用，為今后臨床應(yīng)用Gln治療COPD提供新的試驗(yàn)和理論依據(jù)。然而，由于本試驗(yàn)樣本量的局限，且僅限于離體細(xì)胞水平，在一定程度上影響了研究結(jié)果及其精確性。因此，有關(guān)Gln抗炎作用更深入的分子機(jī)制仍有待今后更大規(guī)模的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effect of glutamine on p38MAPK and IL-8 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease*

WuWei，HuangMeijian△

(DepartmentofRespiraion,HangzhouClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity/HangzhouMunicipalThirdPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310009,China)

ObjectiveTo investigate the effects of glutamine (Gln) on the p38MAPK activity and IL-8 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).MethodsThirty-two patients with acute exacerbation of COPD (AECOPD ) were chosen as the research subjects(AECOPD group).Then the patients converting to the stable stage of COPD after treatment were set as the SCOPD group.PBMC of each group were extracted and conducted the Gln intervention.At the same time 16 healthy people were selected as the healthy control group.The real-time PCR(RT-PCR) was used to detect the levels of p38MAPK and IL-8 expression in PBMC among the five groups.Results(1)The expressions of p38MAPK and IL-8 in the AECOPD blank control group and the SCOPD blank control group were both higher than those in the healthy control group (P<0.01 orP<0.05),while the expression levels of p38MAPK and IL-8 in patients with AECOPD was higher than those of patients with SCOPD,the difference was statistically significant(P<0.05).(2)The expression levels of p38MAPK and IL-8 in the AECOPD Gln group were lower than those in the AECOPD blank control group (P<0.01);the expression levels of p38MAPK and IL-8 in the SCOPD Gln group were lower than those in the SCOPD blank control group (P<0.05).ConclusionGln could inhibit the p38MAPK pathway activation in inflammatory cells of COPD patients and reduce the expression level of IL-8.

pulmonary disease,chronic obstructive;glutamine;p38 mitogen-activated protein kinase;interleukin-8

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.001

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B009);杭州市醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(20120633B05)。

吳偉(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究?！?/p>

，E-mail：hmeijian@163.com。

R563.9

A

1671-8348(2016)19-2593-03

2016-01-14

2016-03-27)