姬　誠　郭萬周

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【實(shí)驗(yàn)研究】

蟾酥的高效液相指紋圖譜研究*

姬誠郭萬周

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(南陽 473061)

摘要：目的建立評(píng)價(jià)蟾酥飲片質(zhì)量優(yōu)劣的指紋圖譜分析方法。方法采用高效液相色譜法，Allitma 反相C18色譜柱(250mm×4.6mm，5.0μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，檢測波長為296nm，流速0.7ml/min，柱溫為30℃。用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度。結(jié)果該方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于5%，各產(chǎn)地樣品的相似度大于95%。結(jié)論用蟾酥高效液相指紋圖譜分析法，可較全面地反映蟾酥飲片的內(nèi)在質(zhì)量，可用于蟾酥飲片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蟾酥；高效液相色譜法；指紋圖譜

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物。性溫、味辛，有毒，歸心經(jīng)，具有解毒、消腫、止痛、開竅醒神之功效，主要用于治療癰疽疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、牙痛、痧脹腹痛和神昏吐瀉等癥[1,2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：蟾酥具有強(qiáng)心、升壓、抗腫瘤、抗心肌缺血等功效[3]。

本文采用高效液相色譜法建立了蟾酥藥材的指紋圖譜，并標(biāo)定出8個(gè)共有指紋峰，同時(shí)對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，為蟾酥藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及其質(zhì)量控制提供依據(jù)[4,5]。

1　儀器與試藥

Agilent-1200 高效液相色譜儀；1200VWD紫外檢測器;AgilentLC工作站;Milli-Q超純水機(jī)；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A,國家藥典委員會(huì))。12批蟾酥藥材(見表1)購自山東、江蘇以及四川省的不同地區(qū)，經(jīng)鑒定均為中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥分泌物。色譜純乙腈 (Fisher公司);分析純甲酸(北京第二化工廠)。

對(duì)照品華蟾酥毒基、脂蟾毒配基購自中國藥品生物制品檢定所，蟾毒靈、蟾毒它靈對(duì)照品購自上海鼎瑞化工有限公司，日蟾毒它靈對(duì)照品購自南昌貝塔生物科技有限公司，沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)照品購自江西本草科技有限責(zé)任公司。

2　方法

2.1色譜條件色譜柱：GraceAllitmaC18(4.6mm× 250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15min，A為30%～62%；15～30min，A為62%)；檢測波長：296nm；柱溫：30 ℃；流速：0.7ml/min；進(jìn)樣量：20μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、日蟾毒它靈、蟾毒它靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)照品適量，加甲醇溶解，作為對(duì)照品溶液，濃度分別為華蟾酥毒基0.952mg/mL、脂蟾毒配基0.696mg/mL、蟾毒靈0.266mg/mL、日蟾毒它靈0.224mg/mL、蟾毒它靈0.344mg/mL、沙蟾毒精0.232mg/mL、遠(yuǎn)華蟾毒精0.104mg/mL。再各精密吸取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過后作為混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取各地產(chǎn)蟾酥藥材細(xì)粉0.1g，精密稱定，加入甲醇20ml，超聲處理60min，放冷，定容至25mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)分別精密吸取同一供試品溶液。連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述方法色譜條件測定。計(jì)算各峰峰面積RSD值<1% 表明該方法精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液。分別在0、2、4、8、12、24h時(shí)進(jìn)樣，按上述方法色譜條件測定。計(jì)算各峰峰面積RSD值<1%，表明該供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批蟾酥藥材按供試品制備方法制備供試品溶液5份，測定HPLC色譜圖。計(jì)算各峰峰面積RSD值<3% 表明該方法重復(fù)性良好。

2.5蟾酥藥材指紋圖譜的建立取蟾酥藥材樣品12批，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣20ul，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果12批藥材有8個(gè)特征指紋峰，其中7號(hào)峰為華蟾酥毒基，1號(hào)峰為日蟾毒它靈，2號(hào)峰為沙蟾蜍精，3號(hào)峰為遠(yuǎn)華蟾毒精，4號(hào)峰為蟾毒它靈，6號(hào)峰為蟾毒靈，8號(hào)峰為脂蟾毒配基，以華蟾酥毒基的保留時(shí)間為參照，計(jì)算各產(chǎn)地藥材共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的差異，結(jié)果RSD均小于5%。

圖1　不同產(chǎn)地蟾酥的HPLC指紋圖譜

2.6相似度計(jì)算指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)采用國家藥典委員會(huì)開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)進(jìn)行計(jì)算。首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，以中位數(shù)法產(chǎn)生對(duì)照指紋圖譜，分別計(jì)算不同批次的樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度。12批蟾酥藥材的相似度結(jié)果見表1。

表1　蟾酥藥品來源及相似度計(jì)算結(jié)果

3　討論

在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)比了不同濃度甲醇、乙醇，超聲提取、加熱回流、冷浸提取等不同提取方法對(duì)蟾酥指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，甲醇超聲提取所得圖譜指紋峰比較豐富，并且操作簡單。另外，課題組也比較了甲醇-水、乙腈-水以及不同比例的乙腈-水-甲酸、乙腈-水-乙酸等多種流動(dòng)相的梯度洗脫效果，結(jié)果表明，選用乙腈-0.01%甲酸水溶液系統(tǒng)以合適的梯度洗脫所得指紋圖譜分離效果和峰型最好。全波長掃描發(fā)現(xiàn)在296nm處有蟾酥毒基類成分的最大吸收，綜合考慮選定296nm為檢測波長。本實(shí)驗(yàn)建立了蟾酥藥材的指紋圖譜，確立了8個(gè)共有峰，導(dǎo)入中國藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，結(jié)果12批樣品指紋圖譜的相似度均在 95.6% 以上，相似度較好，可用于蟾酥藥材的定性質(zhì)量評(píng)價(jià)，為蟾酥及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供補(bǔ)充。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：383.

[2]高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2007:512-513.

[3]鞏麗麗,李景香,張會(huì)敏.蟾酥藥理作用及制劑工藝的研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2007,9(10)：51-53.

[4]石玉娟,解軍,李桂蘭.山西省不同產(chǎn)地中藥材黃芪HPLC指紋圖譜研究[J].光明中醫(yī),2010,25(5):790-791.

[5]陳紅,程再興,肖永慶. 炮制前后梔子飲片HPLC指紋圖譜比較研究[J].光明中醫(yī),2009,24(6)：1044-1055.

*基金項(xiàng)目：河南省南陽市科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.2015KJGG08)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.12.021

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-12-1727-03

收稿日期：(本文校對(duì)：賈荷麗2015-11-27)

Study on the High Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Venenum Bufonis

JI ChengGUO Wanzhou

(Nanyang Medical College, Henan, Nanyang 473061, China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC-fingerprint method for evaluating the quality of Venenum Bufonis medicinal slices. MethodsThe separation was performed on the Allitma C18 column (250mm×4.6mm, 5.0μm) with the gradient elution of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as the mobile phase at the rate of 0.7 mL/min. The detection wavelength was 296 nm, and the column temperature was 30℃. The similarity was calculated by fingerprint similarity evaluation software. ResultsThe RSD of precision, reproducibility and stability for this method were less than 5%. The similarity of these samples was more than 95%. ConclusionThe HPLC fingerprint can comprehensively reflect the inner quality of Venenum Bufonis medicinal slices, and can be used to control its quality.

Key words：Venenum Bufonis; HPLC; Fingerprint