劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 魯開化

作者單位：710003 陜西 西安,西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院(李 菲);昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 整形外科(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科(魯開化);

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超聲空化法制備脫細(xì)胞血管支架生物學(xué)相容性的實(shí)驗(yàn)研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 魯開化

作者單位：710003 陜西 西安,西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院(李 菲);昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 整形外科(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科(魯開化);

目的 檢測經(jīng)強(qiáng)度為300 W超聲處理后的脫細(xì)胞血管支架的生物相容性。方法 無菌條件下，采取新鮮兔股動(dòng)脈反復(fù)凍溶+超高壓處理后，利用核酸酶進(jìn)行消化，脫去殘留細(xì)胞碎片形成脫細(xì)胞血管支架。將強(qiáng)度為300 W的超聲作用于脫細(xì)胞血管支架，并對處理后支架材料的生物學(xué)相容性進(jìn)行檢測和觀察。結(jié)果 經(jīng)強(qiáng)度為300 W超聲處理后的支架材料，其疏松化程度在明顯提高的同時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，且種子細(xì)胞可以長入材料內(nèi)部。結(jié)論 超聲空化法處理后的脫細(xì)胞血管支架材料具有較好的組織相容性，可以為組織工程血管支架的研究提供新的思路和方法。

組織工程血管; 脫細(xì)胞血管支架; 超聲; 生物相容性

對血管支架的研究一直是血管組織工程研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和重點(diǎn)。脫細(xì)胞血管基質(zhì)在血管組織工程中得到越來越多的重視和應(yīng)用[1-2]。目前，組織工程學(xué)種子細(xì)胞種植于材料的通行做法是：靜態(tài)培養(yǎng)復(fù)合[3]、生物發(fā)生器內(nèi)復(fù)合[4]、旋轉(zhuǎn)攪動(dòng)[5]以及離心培養(yǎng)[6]等。這些細(xì)胞種植方法需要高密度的種子細(xì)胞，但仍無足夠的證據(jù)表明細(xì)胞能夠長入支架材料內(nèi)部[7]。因此，如何在保留脫細(xì)胞血管支架機(jī)械強(qiáng)度的前提下，提高脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的疏松性和孔隙率，仍是目前組織工程脫細(xì)胞血管支架研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。在前期的試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)[8]，通過超聲波在液體內(nèi)的空化效應(yīng)，并使用300 W強(qiáng)度的超聲波，可以在不顯著改變材料本身生物化學(xué)成分及生物力學(xué)特性的前提下，達(dá)到使脫細(xì)胞血管支架致密的膠原纖維疏松化的目的。2014-2015年，西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科對超聲處理后支架材料的生物學(xué)相容性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑來源

選擇2.0～2.5 kg的大耳白兔10只(由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)。核糖核酸酶(R- Nase A)、脫氧核糖核酸酶(D-Nase I，美國SIGMA公司)、超聲生物處理器(VIRSONIC 100，美國)。

1.2 方法

1.2.1 脫細(xì)胞血管支架的制備 在麻醉、無菌條件下取出兔股動(dòng)脈(20根)，具體制備方法同文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 超聲處理脫細(xì)胞血管支架 超聲探頭經(jīng)高壓滅菌處理后，將脫細(xì)胞兔血管修剪為5 mm×25 mm的片狀,分別置入0℃的PBS溶液中。將超聲探頭垂直浸入PBS液中約2 cm。使用處理間隔為1 s，對每個(gè)材料總計(jì)超聲處理時(shí)間為60 s，每個(gè)材料所接受的累積超聲強(qiáng)度為300 W。

1.2.3 兔血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取兔股靜脈>50 cm，6 h內(nèi)進(jìn)行分離、培養(yǎng)；5號(hào)帶柄一次性靜脈輸液針吸取37℃ 預(yù)熱雙抗PBS，插入靜脈沖洗，洗除殘血，注入口處用線繩結(jié)扎，以防液體返流；分別注入0.125%、0.25% 胰酶和0.1% 膠原酶消化液，使管腔充盈，37℃ ，于12、15、17 min，松開一端，收集消化液； 注入含10%胎牛血清M199培養(yǎng)液再次沖洗管腔；將消化液和沖洗液離心800 r/min，5 min，棄上清；加M199培養(yǎng)液，吹打均勻制成細(xì)胞懸液，以每瓶濃度2×105傳入25 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每24 h半定量換液，當(dāng)細(xì)胞生長至完全融合，按1∶2的比例傳代并接種細(xì)胞，建立二倍體細(xì)胞系。取5、6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：⑴細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)過程直接在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況并記錄典型表現(xiàn)。⑵免疫組化檢測vWF的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞黏附及接觸細(xì)胞毒性測定 將約3 mm2的無菌醫(yī)用粘合膜貼于一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，無菌條件下取5 mm×5 mm大小超聲處理后的脫細(xì)胞血管基質(zhì)并黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。作為陽性對照組，將1滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養(yǎng)皿中央的醫(yī)用粘合膜上；陰性對照組培養(yǎng)皿中央僅粘貼醫(yī)用粘合膜。將準(zhǔn)備的成內(nèi)皮細(xì)胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)孵育48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞與培養(yǎng)皿中央材料毗鄰部位的形態(tài)。

1.2.5 材料提取物細(xì)胞毒性測定 ⑴取超聲處理過的脫細(xì)胞血管支架100 mg,用無菌剪刀盡可能地剪碎，組織碎片放入可密封消毒試管中，稱質(zhì)量，加入DMEM培養(yǎng)液200 ml(2 ml/mg組織)。密封試管后于37℃孵育96 h，離心(1400 r/min,20 min)、取上清液、0.2 μm濾器過濾后測定體積。⑵MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。選取培養(yǎng)的3～5代的兔血管內(nèi)皮細(xì)胞，常規(guī)傳代以細(xì)胞密度約5×106/孔，分別接種于6塊96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl,移入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng) 24 h；生長至鋪滿80%孔底后，取3塊96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組加入含材料提取液的培養(yǎng)液100 μl；試驗(yàn)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對照孔(DMEM培養(yǎng)液100 μl)和空白孔(無細(xì)胞)，3塊板繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(12、24、36 h)后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。先吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液 20 μl(5 mg/ml用PBS稀釋pH=17.4)，37℃、5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加二甲基亞砜(杭州四季青生物有限公司)150 μl，在酶標(biāo)儀內(nèi)振蕩10 min，于 492 nm波長處測定各孔吸光度(A值)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均A值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 脫細(xì)胞血管基質(zhì)對于內(nèi)皮細(xì)胞親和力的研究 將脫細(xì)胞血管基質(zhì)和超聲處理后的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，分別修剪為5 mm×25 mm的片狀并黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將準(zhǔn)備的內(nèi)皮細(xì)胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)分別孵育24、48、72、96、120 h以及1、2、3、4、5周后，分別取支架材料，石蠟包埋,切片，光鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞在支架材料表面的黏附情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素分析法。兩樣本均數(shù)比較，采用組間或配對比較t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)學(xué)觀察 鏡下可見單層細(xì)胞呈短梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列(圖1)；免疫化學(xué)(SP)染色可見細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒，提示細(xì)胞內(nèi)存在vWF(圖2)；因此，從形態(tài)學(xué)及免疫組化學(xué)方面均證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2 材料的生物相容性測定結(jié)果

超聲處理后材料的細(xì)胞毒性：⑴接觸性細(xì)胞毒性。超聲處理前后的脫細(xì)胞血管材料，均無細(xì)胞毒性，在材料的周圍未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的接觸或生長抑制，測試樣本周圍的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常(圖3)。經(jīng)過超聲處理的脫細(xì)胞血管材料內(nèi)可見多量內(nèi)皮細(xì)胞長入(圖4)。⑵提取物細(xì)胞毒性。材料提取物的細(xì)胞毒性見表1。測定結(jié)果證明，原濃度材料提取液組對于細(xì)胞的抑制作用，與M199組無明顯差異。選取原濃度材料提取液繪制作用后的EC生長曲線。

表1 材料提取液作用后EC吸光度變化

注：*P>0.05，同一時(shí)段原濃度液與M199組間比較；◇P>0.05，原濃度液不同作用時(shí)間組間比較

2.3 脫細(xì)胞血管基質(zhì)對于內(nèi)皮細(xì)胞親和力的研究

2.3.1 脫細(xì)胞血管支架材料的細(xì)胞黏附性 組織學(xué)觀察證實(shí)，將兔血管內(nèi)皮細(xì)胞與單純的脫細(xì)胞血管支架材料共培養(yǎng)48 h后便可在支架材料內(nèi)膜面形成一單層的內(nèi)皮細(xì)胞層(圖5),但是在繼續(xù)培養(yǎng)28 d后未發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞長入材料跡象(圖6)。

2.3.2 超聲處理后的脫細(xì)胞血管支架材料的細(xì)胞黏附性 組織學(xué)觀察同樣證實(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞與超聲處理后的脫細(xì)胞血管支架材料共培養(yǎng)48 h后，便可在支架材料內(nèi)膜面形成一單層的內(nèi)皮細(xì)胞層(圖7)；繼續(xù)培養(yǎng)7 d,可在支架材料內(nèi)膜淺層發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞長入(圖8)；培養(yǎng)至14 d時(shí),支架材料內(nèi)膜下層亦出現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞(圖9)；培養(yǎng)至28 d時(shí),更多的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)在支架材料內(nèi)膜下層(圖10)。

3 討論

脫細(xì)胞血管支架因其具有低免疫源性、機(jī)械性能良好等優(yōu)良特性,因此，在組織工程血管研究領(lǐng)域有著比較廣泛的應(yīng)用。然而其卻存在材料致密性高，孔隙率小，一般條件下種子細(xì)胞很難長入支架內(nèi)部的缺點(diǎn)。因此，如何在保證支架材料機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，使材料疏松化、多孔化一直是困擾著脫細(xì)胞血管支架材料研究領(lǐng)域的一個(gè)難題。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞(×40) 圖2 血管內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)陽性(SP ×100) 圖3 脫細(xì)胞支架與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)(×40 ) 圖4 超聲處理脫細(xì)胞支架與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)(×40) 圖5 原濃度材料提取液作用后EC的生長曲線 圖6 培養(yǎng)48 h單層內(nèi)皮細(xì)胞(HE×100) 圖7 培養(yǎng)28 d無內(nèi)皮細(xì)胞長入(HE ×100) 圖8 培養(yǎng)48 h單層內(nèi)皮細(xì)胞 圖9 培養(yǎng)7 d內(nèi)膜淺層內(nèi)皮細(xì)胞長入 圖10 14 d內(nèi)膜下層出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞 圖11 28 d更多內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)在內(nèi)膜下層

Fig 1 Vascular endothelial cells(VEC) (×40). Fig 2 vWF positive expression of VEC (SP ×100). Fig 3 Co-culture of EC and decellularized vascular scaffold (×40). Fig 4 Co-culture of EC and decellularized vascular scaffold treated with sonication (×40). Fig 5 Culture of monolayer EC at 48 hours. Fig 6 Culture of monolayer EC at 48 hours. Fig 7 No EC ingrowth at 28 days after culture. Fig 8 Monolayer EC ingrowth at 48 days after culture. Fig 9 Growth of EC into the superficial intima at 7 days after culture. Fig 10 EC in the subintima at 7 days after culture. Fig 11 More EC in the subintima at 28 days after culture.

超聲生物材料處理的原動(dòng)力是超聲波引發(fā)的機(jī)械、流體力學(xué)、溫度效應(yīng)、光電效應(yīng)、聲空化等效應(yīng)的綜合作用,其中聲空化往往占據(jù)主導(dǎo)地位。但是,不同的聲處理目的對超聲場的要求不同。因此,對超聲場有關(guān)聲學(xué)參數(shù)的優(yōu)化是該領(lǐng)域應(yīng)用技術(shù)的關(guān)鍵。 近年來,聲空化作用引起的特殊物理和化學(xué)環(huán)境為科學(xué)家制備和加工各種組織工程生物材料提供了新的途徑[8,10-12],聲空化方法正成為制備具有特殊性能材料的一種新技術(shù)。

良好的生物力學(xué)特性和組織相容性是作為組織工程血管支架材料的重要因素。在我們前面的試驗(yàn)中提示：超聲處理參數(shù)為強(qiáng)度300 W，間隔1 s，時(shí)長1 min，脫細(xì)胞血管材料的疏松程度和材料的生物力學(xué)強(qiáng)度處于一個(gè)較均衡的水平，與未經(jīng)超聲處理材料相比，超聲處理可以使兔股動(dòng)脈脫細(xì)胞血管基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)明顯疏松，孔隙率增大，同時(shí)材料機(jī)械強(qiáng)度無明顯降低[8]。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過接觸性細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及提取物細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明,經(jīng)過超聲處理后脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料具有良好的體外細(xì)胞相容性。而超聲處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞的親和力進(jìn)行的研究表明，超聲處理前后的脫細(xì)胞血管基質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，都可在材料的表面觀察到單層的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋。然而在繼續(xù)培養(yǎng)2周后，未經(jīng)超聲處理的材料表面仍然只有單層的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，其淺層及深層未見長入的內(nèi)皮細(xì)胞。而與此不同的是，經(jīng)過超聲處理的材料在與內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過2周的共培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)，其淺層及中層出現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和長入。二者在細(xì)胞黏附并長入材料內(nèi)部的區(qū)別主要在于其膠原結(jié)構(gòu)的不同。由此我們可以推斷：經(jīng)過超聲處理的脫細(xì)胞血管支架其膠原結(jié)構(gòu)較未處理前明顯疏松，而這種疏松的結(jié)構(gòu)為種子細(xì)胞的長入提供了必要的先決條件。另外，我們還發(fā)現(xiàn),通過4周或者更長時(shí)間的體外培養(yǎng)，超聲處理后的血管材料中心區(qū)域仍然很難發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞的長入，這些現(xiàn)象可能是由于材料深部膠原結(jié)構(gòu)相對于外層仍然較致密，營養(yǎng)成分無法在材料中心充分滿足細(xì)胞生長需要等原因造成。

4 結(jié)論

本研究通過對強(qiáng)度為300 W超聲處理后的脫細(xì)胞血管支架材料的生物學(xué)相容性進(jìn)行檢測和觀察，發(fā)現(xiàn)處理后的支架材料，其疏松化程度在明顯提高的同時(shí)，仍具有良好的生物學(xué)相容性。通過我們的研究表明，利用超聲聲空化效應(yīng)可以達(dá)到為脫細(xì)胞基質(zhì)類生物材料致密結(jié)構(gòu)改性的目的。這一結(jié)論為今后解決脫細(xì)胞基質(zhì)材料結(jié)構(gòu)致密的問題提供了一定的思路。

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Experimental research of biocompatibility of the decellularized vascular scaffolds treated by ultrasound cavitation

LIUBin,LIFei,ZHANGMan-jing,LUKai-hua.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,Xi′anCentralHospital,Xi′an710003,China)

LUKai-hua,Email:lukaihua@fmmu.edu.cn

Objective To detect the biocompatibility of decellularized vascular scaffolds after 300 watts sonication. Methods Under sterile conditions, fresh blood from the femoral artery was isolated from rabbits and then nuclease digestion was performed after treatment with repeated freezing-thawing cycles and supertension. The decellularized vascular scaffolds were formed after removal of rudimental cell debris. Ultrasonic waves at an intensity of 300 watts were used to treat the scaffolds and then the biocompatibility of the treated scaffolds was detected and observed. Results With the 300 watts intensity ultrasonic treatment, a looser structure of the scaffolds was found without apparent cytotoxcity and seed cells could grow easily inside materials. Conclusion The decellularized vascular scaffolds treated by the ultrasound cavitation method may provide a new method to obtain the decellularized vascular scaffolds with better biocompatibility.

Tissue engineering blood vessels; Decellularized vascular scaffolds; Ultrasonic; Biocompatibility

劉 賓(1977-)，男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師.

魯開化,710032，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科,電子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.08.018

R318.11

A

1673-7040(2016)08-0499-04

2016-05-27)