喬云飛,楊　捷,姜正華,李允模

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 呼吸內(nèi)科,江蘇 揚(yáng)州,225001)

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人轉(zhuǎn)錄激活因子5在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

喬云飛,楊捷,姜正華,李允模

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 呼吸內(nèi)科,江蘇 揚(yáng)州,225001)

摘要:目的探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)基因的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化方法檢測(cè)ATF5在57例NSCLC患者肺癌組織以及癌旁正常肺組織中的表達(dá)，并按照性別、年齡、吸煙、病理分型、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度將其分組，分析ATF5在不同組間表達(dá)的差別以及ATF5與癌胚抗原(CEA)的相關(guān)性。結(jié)果ATF5在NSCLC中的表達(dá)率顯著高于癌旁正常肺組織(P<0.01); ATF5在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙與否、病理分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05),而與肺癌的病理分型及分化程度有相關(guān)性(P<0.05):ATF5在腺癌中的表達(dá)顯著高于鱗癌，在低分化組中的表達(dá)顯著高于高-中分化組；ATF5表達(dá)與CEA異常有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論ATF5在NSCLC中的高表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:ATF5; 免疫組化; 非小細(xì)胞肺癌; 靶向治療

人轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)是ATF/CREB家族的轉(zhuǎn)錄因子，含有282個(gè)氨基酸序列,基因位于染色體19q13.3[1],在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中扮演著多樣化的角色[2-3]。近年來(lái)研究[4-7]發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌等惡性腫瘤中均有ATF5的高表達(dá)(僅在肝臟、睪丸的正常組織ATF5呈高表達(dá)，在他們的腫瘤組織中呈低表達(dá))，且與腫瘤的分期、分化等有關(guān)。本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)ATF5在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及正常肺組織中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1一般資料

本研究標(biāo)本來(lái)源于2009年1月—2013年12月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院胸外科手術(shù)的NSCLC病例57例，取其肺癌手術(shù)標(biāo)本及癌旁正常肺組織做對(duì)照。所有病例系首次發(fā)病，手術(shù)前均未接受過(guò)任何形式的放射治療、化學(xué)治療或生物治療等，術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診為肺癌，臨床資料完整。根據(jù)2014年肺癌NCCN指南對(duì)病例進(jìn)行TNM分期，并對(duì)患者的年齡、性別、吸煙與否、TNM分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、分化程度等進(jìn)行分析。

1.2試劑、儀器與設(shè)備

ATF5單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司),DAB顯色試劑盒及羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。石蠟切片機(jī)RM2145、烤片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，電熱恒溫水槽DK-8A型(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，電子分析天平[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]，磁力加熱攪拌器(上海南匯電訊器材廠)，抗原修復(fù)高壓鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3方法

將包埋好的石蠟標(biāo)本用切片機(jī)切為厚度約4 μm的蠟片，蠟片放入40 ℃左右的水浴槽溫水中使之完全鋪平，撈至防脫載玻片上。56 ℃烤片機(jī)內(nèi)放置3 h。脫蠟及水化(100%二甲苯10 min→100%二甲苯10 min→100%乙醇5 min→100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min)，蒸餾水浸洗。適量3%H2O2滴于每張載玻片上，室溫10 min后PBS洗3次，每次3 min。玻片放置于耐高溫的玻片架上，高壓鍋中加熱pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液至沸騰，將玻片架放入高壓鍋內(nèi)，關(guān)閉至高壓鍋開始噴氣，蓋上壓力閥約2 min,再將高壓鍋放入涼水中冷卻至室溫，取出玻片，放入濕盒，PBS沖洗3次，每次3 min。每張玻片上滴加適量ATF5抗體(濃度1:100)，抗體需完全覆蓋組織，濕盒中保持4 ℃過(guò)夜。次日從冰箱中取出孵育的玻片后在室溫下復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加適量即用型二抗，室溫孵育20 min,PBS沖洗3 min。滴加新配的DAB顯色劑5 min，顯微鏡下控制染色深度，充分水洗。蘇木素復(fù)染30 s，自來(lái)水沖洗，加入1%鹽酸酒精分化2 s，再次沖洗后放入氨水中返藍(lán)，再次沖洗。脫水及透明(70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→90%乙醇2 min→95%乙醇2 min→100%乙醇2 min→100%乙醇2 min→100%二甲苯5 min→100%二甲苯5 min)，最后封片。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗，重復(fù)上述的步驟，結(jié)果為陰性。

以已知的直腸癌陽(yáng)性標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本。ATF5陽(yáng)性表達(dá)免疫組化染色呈棕黃色或棕褐色。在顯微鏡下隨機(jī)觀察每個(gè)標(biāo)本10個(gè)高倍視野，記錄腫瘤細(xì)胞中染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，判斷標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%:0分; 6～25%:1分; 26～50%:2分; >50%:3分。顯色程度:無(wú)顯色:0分；淺黃色:1分；棕黃色:2分；棕褐色:3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度綜合分析:0～1分為陰性(-); 2～3分為弱陽(yáng)性(+); 4～5分為陽(yáng)性(2+); ≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ATF5在肺癌組織以及正常肺組織中的表達(dá)

ATF5在肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，呈彌漫性或局灶性黃色或棕黃色顆粒樣染色(圖1-8)。ATF5在57例癌旁正常肺組織中有5例表達(dá)(8.8%)，均為弱陽(yáng)性；在57例NSCLC中有42例表達(dá)(73.7%),其中弱陽(yáng)性占40.5%,陽(yáng)性占45.2%,強(qiáng)陽(yáng)性占14.3%,與在正常肺組織中的表達(dá)比較有顯著差異(χ2=49.56,P<0.01)。

2.2ATF5在NSCLC中的表達(dá)與相關(guān)臨床及病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

為研究的表達(dá)與相關(guān)臨床及病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，作者將57例NSCLC患者的資料按照性別、年齡、吸煙、病理分型、病理分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移及分化程度將其分組，觀察ATF5在不同組間的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，ATF5在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙與否、病理分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05),而與肺癌的病理分型及分化程度有相關(guān)性(P<0.05)。見表1。ATF5在腺癌的表達(dá)(84.4%)顯著高于鱗癌的表達(dá)(60%)；低分化組ATF5的表達(dá)(100%)也顯著高于高+中分化組的表達(dá)(65.1%)。

圖1 ATF5在正常肺組織中的陰性表達(dá)(IHC 200倍)

圖2 ATF5在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照(IHC 200倍)

圖3 ATF5在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC 200倍)

圖4 ATF5在肺鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC 200倍)

圖5 ATF5在正常肺組織中的陰性表達(dá)(IHC 400倍)

圖6 ATF5在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照(IHC 400倍)

圖7 ATF5在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá) (IHC 400倍)

圖8 ATF5在肺鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá) (IHC 400倍)

表1　ATF5在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

2.3ATF5在NSCLC中的表達(dá)與CEA的關(guān)系

本研究57例NSCLC病例中有18例癌胚抗原(CEA)異常(>5 ng/mL,參考值范圍0～ 5 ng/mL),占31.6%，而在CEA異常病例中有17例ATF5有陽(yáng)性表達(dá)(94.4%),顯著高于CEA正?；颊咧蠥TF5的表達(dá)(64.1%)，ATF5表達(dá)與CEA異常有關(guān)(P<0.05)。

3討論

肺癌已成為全世界最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中占第1位，每年大約有130萬(wàn)人死亡[8]。早期肺癌可通過(guò)手術(shù)治療達(dá)到治愈，但絕大部分患者確診肺癌時(shí)已是中晚期。肺癌中85%為NSCLC[9],其5年生存率在中國(guó)僅有15%[10]。全身治療作為中晚期患者的主要治療手段，在很長(zhǎng)一段時(shí)間是以鉑類聯(lián)合另一種化療藥物(如依托泊苷、長(zhǎng)春瑞濱或紫杉醇等)作為經(jīng)典治療方案，但全身化療目前已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期[11],患者的生存率、生存時(shí)間等很難再有更大的提高。根據(jù)中國(guó)非小細(xì)胞肺癌靶向治療10年高端峰會(huì)上提供的數(shù)據(jù)顯示，在中國(guó)靶向治療的10年來(lái)，NSCLC患者的OS顯著提升了2.4倍，從14.1個(gè)月延長(zhǎng)至33.5個(gè)月，5年生存率從8%增長(zhǎng)到18%。

目前人類研究的比較成熟的是EGFR基因突變和ALK融合基因，相應(yīng)的抑制劑已有藥物上市用于臨床。研究[12]顯示在EGFR基因突變型患者中，吉非替尼作為一線治療的治療組較采用標(biāo)準(zhǔn)化療的治療組相比，其無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和生活質(zhì)量均有明顯改善。2013年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)推薦對(duì)于EGFR基因突變陽(yáng)性的患者,EGFR TKI可作為一線治療方案。同樣，2014年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南也推薦可將ALK抑制劑?？颂婺嶙鳛锳LK陽(yáng)性的晚期NSCLC患者的一線治療。肺癌是多基因參與的、多步驟形成的一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，現(xiàn)有的靶向治療僅適用于存在基因突變的患者，如EGFR突變只在約20%的肺腺癌患者中，在非吸煙的亞裔女性人群中才有高達(dá)60%的突變率[13],對(duì)于EGFR野生型無(wú)突變的患者來(lái)說(shuō)，TKI的治療效果遠(yuǎn)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化療好。TKI在EGFR突變型患者治療9～10個(gè)月后經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥的情況，導(dǎo)致病情的反復(fù)并惡化[14],ALK融合基因同樣也存在著耐藥的問(wèn)題，這是目前靶向治療的一個(gè)瓶頸。另外，針對(duì)KRAS突變這一高比例人群，尚無(wú)有效的針對(duì)性抑制劑治療。

ATF5已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其在腫瘤中的作用機(jī)制也較為復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路，包括eIF2α～P/ATF4/CHOP通路、Wnt通路、RAS/MARK通路、PI3K通路等[15-19]。本研究中ATF5在肺癌組織中呈高表達(dá)，提示ATF5可能成為一個(gè)新的肺癌標(biāo)志物。ATF5的表達(dá)與性別、年齡、吸煙與否、病理分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，而與肺癌的病理分型及分化程度有關(guān)。ATF5在低分化組的表達(dá)高于高、中分化組，提示ATF5可能與肺癌的惡性程度、疾病進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)。ATF5在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌，本身靶向突變基因就被證實(shí)在腺癌中較鱗癌更為普遍，ATF5有可能成為一個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的，特別是在肺腺癌中。另外,ATF5與CEA有關(guān)，也提示ATF5在評(píng)估肺癌預(yù)后方面有一定的價(jià)值。最近的研究[20]還發(fā)現(xiàn)，治療前CEA升高的EGFR陽(yáng)性的腺癌患者有著更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期，對(duì)TKI的療效評(píng)估有一定的預(yù)測(cè)作用，從側(cè)面也反映了ATF5在靶向治療中的可能價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]Ching A K K,Wong N.ATF5 (activating transcription factor 5)[J].Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol,2011,15(3):252-254.

[2]Umemura M,Tsunematsu K,Shimizu Y I,et al.Activating transcription factor 5 is required for mouse olfactory bulb development via interneuron[J].Biosci Biotechnol Biochem,2015,79(7):1082-1089.

[3]Torres-Peraza J F,Engel T,Martin-Ibanez R,et al.Protective neuronal induction of ATF5 in endoplasmic reticulum stress induced by status epilepticus[J].Brain,2013,136(2):1161-1176.

[4]Wu Y,Wu B,Chen R,et al.High ATF5 expression is a favorable prognostic indicator in patients with hepatocellular carcinoma after hepatectomy[J].Med Oncol,2014,31(11):1-6.

[5]孫曉偉,孫振青,江秀麗,等.ATF5、Bcl-2mRNA在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(13):2539-2541.

[6]Wang T,Qian D,Hu M,et al.Human cytomegalovirus inhibits apoptosis by regulating the activating transcription factor 5 signaling pathway in human malignant glioma cells[J].Oncol Lett,2014,8(3):1051-1057.

[7]Monaco S E,Angelastro J M,Szabolcs M,et al.The transcription factor ATF5 is widely expressed in carcinomas,and interference with its function selectively kills neoplastic,but not nontransformed,breast cell lines[J].International Journal of Cancer,2007,120(9):1883-1890.

[8]Nguyen K S,Neal J W,Wakelee H.Review of the current targeted therapies for non-small-cell lung cancer[J].World J Clin Oncol,2014,5(4):576-587.

[9]Sandler A,Gray R,Perry M C,et al.Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med,2006,355(24):2542-2550.

[10]CAO Oncologists.The diagnosis and treatment guideline of Chinese patients with EGFR gene active mutation and ALK fusion gene-positive non-small cell lung cancer (2014 version)[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2014,36(7):555-557.

[11]Forde P M,Ettinger D S.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer:past,present and future[J].Expert Rev Anticancer Ther,2013,13(6):745-758.

[12]Mok T S,Wu Y L,Thongprasert S,et al.Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J].N Engl J Med,2009,361(10):947-957.

[13]Moreira A L,Eng J.Personalized therapy for lung cancer[J].Chest,2014,146(6):1649-1657.

[14]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)肺癌學(xué)組,中國(guó)肺癌防治聯(lián)盟.晚期非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療專家共識(shí)(2013版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2014,37(3):177-183.

[15]Teske B F,Fusakio M E,Zhou D,et al.CHOP induces activating transcription factor 5 (ATF5) to trigger apoptosis in response to perturbations in protein homeostasis[J].Mol Biol Cell,2013,24(15):2477-2490.

[16]Gao F,Xia Y,Wang J,et al.Integrated analyses of DNA methylation and hydroxymethylation reveal tumor suppressive roles of ECM1,ATF5,and EOMES in human hepatocellular carcinoma[J].Genome Biol,2014,15(12):1-13.

[17]Ye X J,Zhang Z W,Zhang X J,et al.Functional interaction of TCF4 with ATF5 to regulate the Wnt signaling pathway[J].Chinese Science Bulletin,2003,48(7):668-672.

[18]Sheng Z,Evans S K,Green M R.An activating transcription factor 5-mediated survival pathway as a target for cancer therapy[J].Oncotarget,2010,1(6):457-460.

[19]Sheng Z,Ma L,Sun JE,et al.BCR-ABL suppresses autophagy through ATF5-mediated regulation of mTOR transcription[J].Blood,2011,118(10):2840-2848.

[20]Jung M,Kim S H,Hong S,et al.Prognostic and predictive value of carcinoembryonic antigen and cytokeratin-19 fragments levels in advanced non-small cell lung cancer patients treated with gefitinib or erlotinib[J].Yonsei Med J,2012,53(5):931-939.

收稿日期:2016-04-13

中圖分類號(hào):R 734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)15-009-05

DOI:10.7619/jcmp.201615003

Expression and clinical significance of activating transcription factor 5 in non-small cell lung cancer

QIAO Yunfei,YANG Jie,JIANG Zhenghua,LI Yunmu

(Department of Respiratory Medicine,Clinical Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of activating transcription factor 5(ATF5) in non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsATF5 expression in 57 NSCLC tissues and normal lung tissues near tumors were detected with immunohistochemical method.These patients were divided into groups according to sex,age,smoking,pathological type,pathological stage,lymphatic metastasis and differentiated degree.ATF5 expression was observed in different groups,and the correlation between its expression and carcino-embryonic antigen (CEA) was analyzed.ResultsATF5 expression was significantly higher in NSCLC tissues than in normal lung tissues near tumors (P<0.01).ATF5 expression in NSCLC had no correlation with sex,age,smoking,pathological stage and lymphatic metastasis (P>0.05),but was correlated with pathological type and differentiated degree (P<0.05).ATF5 expression in adenocarcinoma was significantly higher than that in squamous carcinoma.ATF5 expression in the poor differentiated group was significantly higher than that in the moderate or high differentiated group.ATF5 expression was also correlated with abnormality of CEA (P<0.05).ConclusionThe high expression of ATF5 in NSCLC may be associated with the occurrence and development of tumors.

KEYWORDS:activating transcription factor 5; immunohistochemistry; non-small cell lung cancer; targeted therapy