張　亮，夏蓉蓉，陳梅玲，夏文靜，陳俞西

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州　225300)

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鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤磷的活化

張亮，夏蓉蓉，陳梅玲，夏文靜，陳俞西

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州225300)

摘要：通過在鋁脅迫下試驗(yàn)，以馬勃(Pisolithus tinctorius，Pt)和乳菇(Lactarius delicious，Ld)為供試菌株，土壤為培養(yǎng)基的唯一磷源，采用液體培養(yǎng)的方法研究菌絲生長(zhǎng)、磷吸收、氫離子、草酸和可滴定酸的分泌，以及測(cè)定土壤有效磷含量的變化。結(jié)果表明，兩株外生菌根真菌菌絲的生物量、磷含量、磷吸收量及培養(yǎng)基中草酸分泌量均隨著鋁離子濃度的升高，表現(xiàn)出“先增高后降低”的趨勢(shì)，其中在全部鋁離子濃度條件下，菌株P(guān)t的生物量均大于Ld，說明Pt的抗鋁毒能力強(qiáng)于Ld。此外，培養(yǎng)基中pH逐漸降低，而土壤有效磷含量則逐漸升高，且Pt的活化能力強(qiáng)于Ld。相關(guān)分析表明，外生菌根真菌培養(yǎng)基中分泌的草酸與土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān)(r=0.680*，n=11)，推測(cè)外生菌根真菌分泌的草酸在活化土壤難溶性磷的過程中起到關(guān)鍵作用。因此，外生菌根真菌的抗鋁和溶磷能力與其分泌的氫離子和有機(jī)酸有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鋁；外生菌根真菌；酸性土壤；磷

0引言

土壤中鋁作為金屬含量最高的元素，但并不是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。我國(guó)南方地區(qū)長(zhǎng)期受到酸雨的影響，土壤酸化嚴(yán)重，致使鋁離子在土壤中大量溶出，誘發(fā)鋁毒對(duì)植物生長(zhǎng)的危害[1]。磷元素作為植物生長(zhǎng)所必需的三大元素之一，大部分地區(qū)的土壤磷含量普遍偏低，且有效性不高[2]。我國(guó)因酸雨危害的地區(qū)多達(dá)15個(gè)省區(qū)，總面積達(dá)2 030萬hm2，酸雨嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)。在酸性土壤中，磷、鉀和鎂等礦質(zhì)元素含量低，加上土壤鋁的毒害，導(dǎo)致森林植被嚴(yán)重退化[3]。此外，森林植被主要集中分布在南方山區(qū)，土層瘠薄，高度風(fēng)化，土壤長(zhǎng)期無法施肥，養(yǎng)分流失嚴(yán)重，加上酸雨的影響，導(dǎo)致大面積的林地凋亡[4]。

多種木本植物可以與外生菌根真菌形成菌根共生體，是森林生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分。有學(xué)者研究表明，植物在形成菌根后，吸收養(yǎng)分的能力顯著高于非菌根植物[5]。有研究表明，菌根真菌通過與根系結(jié)合形成共生體，增強(qiáng)了植物根系對(duì)難移動(dòng)性元素(如磷)和微量元素的吸收能力，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗脅迫環(huán)境的能力[6]。另外，研究發(fā)現(xiàn)重金屬存在的礦區(qū)，外生菌根真菌能夠積累重金屬，而且真菌吸收的礦物質(zhì)必須通過菌絲套才能進(jìn)入宿主植物根部，從而緩解了重金屬對(duì)植物的迫害。因此，外生菌根真菌通過菌絲富集、吸收重金屬元素，可能是植物抗金屬毒害的途徑之一，表現(xiàn)出比無菌根植物更強(qiáng)的耐受性[7]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，外生菌根真菌向根際周圍釋放多種有機(jī)酸，其中有草酸、乙酸、檸檬酸等，這些有機(jī)酸能電離出氫離子，參與難溶性的磷酸鹽活化，使磷酸根釋放到土壤中；另外，高分子有機(jī)酸通過絡(luò)合金屬離子，形成絡(luò)合物來活化鐵鋁磷酸鹽[8，9]。有研究表明，在鋁脅迫下，多數(shù)外生菌根真菌的生物量下降明顯，而相應(yīng)的草酸分泌量和氮磷鉀吸收量也受到抑制[10]。但是在鋁毒和低磷的條件下，外生菌根真菌對(duì)土壤磷的活化的研究未見報(bào)道。以南方地區(qū)森林低磷黃紅壤為供試土壤，探索在鋁脅迫下，外生菌根真菌對(duì)土壤磷的活化作用。

1材料與方法

1.1材料準(zhǔn)備

供試菌株保存于南京師范大學(xué)泰州學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，取其中2株作為供試菌株。分別是馬勃(Pisolithustinctorius，Pt)和乳菇(Lactariusdelicious，Ld)。采用Pachlewsk固體培養(yǎng)基(去除磷源)培養(yǎng)14d備用。其中培養(yǎng)基配方為：酒石酸銨0.5g、氯化鉀0.55g、硫酸鎂0.5g、葡萄糖20g、瓊脂18g、維生素B10.1g、微量元素混合液1mL(每升含8.45mg H3BO3、5mg MnSO4、6mg FeSO4、0.625mg CuSO4、2.77mg ZnCl2和0.27mg(NH4)2MoO4)、去離子水1L，pH5.5，溶解之后，然后在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30min。

供試土壤為酸性黃紅壤，采自浙江安吉藏龍百瀑景區(qū)馬尾松林下的底層土壤。蒸汽滅菌后的土壤參數(shù)為：pH4.25、有機(jī)質(zhì)20.5g/kg、全氮1.07g/kg、全磷0.55g/kg、有效磷22.9mg/kg。將土壤自然風(fēng)干，磨細(xì)過100目篩子，然后準(zhǔn)確稱取1.000g土壤裝入到PVC塑料管中，兩端用玻璃纖維和微孔濾膜(孔徑為0.22μm)封口，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。在裝入培養(yǎng)瓶中，無機(jī)離子和水分子可以自由進(jìn)出，而土壤不會(huì)穿過濾膜。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)配置鋁離子濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L的無磷Pachlewsk液體培養(yǎng)基，pH4.25；然后在150mL三角瓶中裝入20mL培養(yǎng)液，再加入一個(gè)裝有土壤的PVC塑料管，封口，高壓滅菌30min。冷卻之后，在每瓶培養(yǎng)液中接種直徑為6mm的固體菌種，同時(shí)以不接種外生菌根真菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照處理。每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，25℃暗箱培養(yǎng)14d備測(cè)有關(guān)項(xiàng)目。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

培養(yǎng)結(jié)束后，將菌絲和培養(yǎng)液分離，收集濾液，用精密數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定濾液中pH變化，然后采用KMnO4滴定法測(cè)定濾液中的草酸含量[11]。用NaOH滴定法測(cè)定培養(yǎng)液的總酸度(總酸度指每毫升培養(yǎng)液中全部氫離子的物質(zhì)量)。用鉬藍(lán)比色法測(cè)定濾液中磷含量[12]；另外，將菌絲在105℃條件下烘干稱重即為每瓶生物量，然后用濃H2SO4和H2O2來消煮菌絲制備消煮液。同時(shí)將PVC管中的土壤取出風(fēng)干，用Olsen法提取，用鉬藍(lán)比色法分別測(cè)定消煮液磷及土壤中的有效磷含量[13]。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算，SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間的差異顯著性用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1鋁對(duì)外生菌根真菌生物量、磷含量和磷吸收的影響

2.1.1生物量

外生菌根真菌在不同濃度的鋁離子脅迫下，以酸性黃紅壤作為Pachlewsk培養(yǎng)基的唯一磷源中生長(zhǎng)狀況見表1。隨著鋁離子濃度的升高，兩株外生菌根真菌的生物量均表現(xiàn)出先升高，后降低的趨勢(shì)。其中，兩株菌的生物量均在鋁離子濃度1mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，然后隨著鋁離子濃度的升高，生物量降低；且全部鋁離子濃度條件下，Pt的生物量均大于Ld。說明Pt對(duì)鋁離子的敏感度小于Ld。

2.1.2磷含量及磷吸收量

由表1可知，鋁濃度在1.5mmol/L時(shí)，Pt和Ld兩株菌均出最強(qiáng)的吸磷能力，每瓶的吸收量分別為2.23mg(Pt)、3.06mg(Ld)，同時(shí)，磷含量也是最高。說明，在培養(yǎng)基無磷源時(shí)，外生菌根真菌能從土壤中吸收磷元素，且兩株菌的吸收磷的能力存在差異。

表1　鋁對(duì)外生菌根真菌的生物量、磷含量和吸收量的影響

注：表中每一列的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.2鋁脅迫下外生菌根真菌培養(yǎng)基中pH的變化

由圖1可知，培養(yǎng)14d之后，兩株外生菌根真菌均顯著降低培養(yǎng)基中的pH，并且隨著鋁濃度的增加，降低效果越顯著。其中Ld菌株在鋁離子濃度為2.0mmol/L時(shí)，降幅最大，與對(duì)照(CK)相比，降低1.02個(gè)單位。同時(shí)，在全部鋁離子濃度條件下，菌株Ld的降幅均大于菌株P(guān)t。

圖1　培養(yǎng)基中pH的變化(CK表示為不接種，鋁濃度為0 mmol/L)Fig.1　The changes in pH in liquid culture mediums. Different letters indicate significant differences at P=0.05

2.3鋁脅迫下外生菌根分泌草酸及培養(yǎng)基中可滴定總酸度的影響

由表2可知，培養(yǎng)14d之后，Pt和Ld兩株外生菌根真菌的草酸分泌量均隨著鋁濃度的升高而增加(Pt在鋁濃度2.0mmol/L除外)，且由草酸電離出的氫離子表現(xiàn)出相同的規(guī)律。其中，Pt所分泌的總氫離子濃度在鋁離子為2.0mmol/L時(shí)最高，而Ld所分泌的總氫離子濃度在鋁離子為1.0mmol/L時(shí)最高。與此同時(shí)，草酸電離出的氫離子僅占培養(yǎng)基中總氫離子量的2.06%～5.35%(Pt)、1.71%～3.06%(Ld)。

表2　液體培養(yǎng)基中草酸、草酸電離的H+及總H+濃度

2.4鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤有效磷含量的影響

由圖2可知，土壤有效磷的含量因培養(yǎng)基中鋁離子濃度和菌株不同而異。與對(duì)照組相比，除菌株Ld在鋁濃度為0mmol/L外，其余處理均顯著提高土壤中有效磷含量。其中，當(dāng)鋁離子濃度為1.5mmol/L時(shí)，菌株P(guān)t和Ld使土壤有效磷含量增加最為顯著，比對(duì)照(不接種)分別增加了36.16%和12.96%。

圖2　土壤中有效磷含量變化Fig.2　The changes in available phosphorus in soils

2.5各因素的相關(guān)分析

表3可見，培養(yǎng)液中草酸含量與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.849**，n=11)，與土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān)(r=0.680*，n=11)；說明培養(yǎng)基中草酸的分泌促進(jìn)土壤中難溶性磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化，提高土壤磷的有效性。

表3　試驗(yàn)各因素的相關(guān)系數(shù)

注：*，**分別表示在0.05和0.01水平上相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

3結(jié)果與討論

1)研究以酸性土壤為培養(yǎng)基唯一磷源，在鋁脅迫下，兩株外生菌根真菌(Pt和Ld)均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)狀況存在差異。其中Pt在全部鋁濃度下生物量均高于Ld，說明外生菌根真菌因菌株不同對(duì)鋁的耐受性存在差異，菌株P(guān)t的抗鋁能力明顯高菌株Ld。有研究表明，外生菌根真菌能與2/3以上的樹木形成菌根共生體，促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分，提高植物的抗鋁能力[14，15]。因此，將外生菌根真菌接種到苗木根際周圍，形成菌根共生體之后，有利于樹木抵抗脅迫環(huán)境，緩解森林退化。

2)兩株外生菌根真菌隨著鋁離子濃度的升高，菌絲的磷吸收量表現(xiàn)出“先升高，后降低”的趨勢(shì)，這說明低濃度的鋁離子對(duì)菌絲生長(zhǎng)可能是有益的，可以促進(jìn)菌絲從低磷的環(huán)境下吸收養(yǎng)分。

3)當(dāng)鋁離子濃度到達(dá)2.0mmol/L時(shí)，兩株外生菌根真菌的生物量、磷吸收量均出現(xiàn)降低。這說明當(dāng)環(huán)境中的鋁濃度超過菌絲的耐受性之后，將不利于外生菌根真菌的生長(zhǎng)。有研究者發(fā)現(xiàn)，外生菌根真菌與根系形成菌根之后，通過外部菌絲的擴(kuò)展增大吸收面積，進(jìn)而增強(qiáng)了植物對(duì)難溶性元素(如磷、鉀)的吸收，緩解重金屬的毒害，提高植物抗環(huán)境脅迫的能力[16]。

4)培養(yǎng)基中的pH在鋁離子的脅迫下顯著下降，其中Ld菌株在鋁離子濃度為2.0mmol/L時(shí)，降幅最大，與對(duì)照(CK)相比，降低1.02個(gè)單位，與此同時(shí)，培養(yǎng)基中的總氫離子濃度也隨著鋁離子濃度升高而增加。這說明兩株外生菌根真菌通過向環(huán)境中釋放氫離子，活化難溶性磷酸鹽。有研究表明，微生物的溶磷作用可能與氫離子分泌有關(guān)，當(dāng)介質(zhì)pH的降低后，能夠溶解羥磷灰石和氯磷灰石等無機(jī)磷酸鹽[17，18]。

5)當(dāng)鋁離子濃度為1.5mmol/L時(shí)，釋放到培養(yǎng)液中的草酸濃度最高，Pt為0.38mmol/L，Ld為0.33mmol/L。另外，草酸鈣和草酸鐵絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)分別為16.3和20.8，草酸絡(luò)合金屬離子的能力非常強(qiáng)，發(fā)生反應(yīng)之后，使難溶性的磷酸鹽溶解釋放，為植物利用磷鉀營(yíng)養(yǎng)[19，20]。

6)外生菌根真菌分泌的草酸量與土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.680*，n=11)；說明在鋁脅迫下，外生菌根真菌分泌的草酸通過絡(luò)合鐵、鎂、鋁、鈣等金屬離子，使難溶性磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高土壤有效磷含量。

在我國(guó)南方大部分地區(qū)由于受到環(huán)境的污染，土壤酸化嚴(yán)重，伴隨著鋁離子在土壤中大量溶出，加上森林土壤養(yǎng)分的貧瘠，使外生菌根真菌生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而樹木缺乏養(yǎng)分供給。本研究中，發(fā)現(xiàn)外生菌根真菌Pt具有較強(qiáng)的抗鋁和耐低磷環(huán)境的能力。因此，篩選出既有抗鋁作用，又耐低磷(活化能力強(qiáng))的優(yōu)良菌株就顯得尤為重要。研究其耐脅迫環(huán)境的機(jī)理，并將其應(yīng)用到森林退化修復(fù)中意義重大。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張薇,黃建國(guó),袁玲,等.外生菌根真菌對(duì)Al3+脅迫和低鉀土壤的響應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué),2014,35(10):3862-3868.

[2] 李華,黃建國(guó).外生菌根真菌的抗鋁作用與機(jī)理[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(6):123-127.

[3] 王月平,章藝,吳玉環(huán),等.植物鋁毒害及抗鋁毒機(jī)制[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(19):3900-3903.

[4] 丁愛芳,俞元春.酸性土壤中鋁的活化及其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報(bào),2000(4):25-28.

[5] ZHANG L,WANG M X,LI H,et al.Mobilization of inorganic phosphorus from soils by ectomycorrhizal fungi[J].Pedosphere,2014,24(5):683-689.

[6] LIANG J,YU H,YE G,et al.Influence of organophosphate on growth and phosphorus-dissolving of phosphobacteria[J].Acta Agriculturae Jiangxi,2007,19(8):89-90.

[7] 辜夕容,黃建國(guó).鋁對(duì)外生菌根真菌草酸分泌及磷、鉀、鋁吸收的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2010,20(2):357-363.

[8] 張亮,楊宇虹,李倩,等.自生固氮菌活化土壤無機(jī)磷研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(7):2157-2164.

[9] 袁玲,方德華,汪智慧,等.鉀對(duì)外生菌根真菌的分泌作用及氮、磷、鉀含量的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2001,21(2):254-258.

[10]宋金鳳,宋利臣,崔曉陽,等.低分子有機(jī)酸/鹽對(duì)森林暗棕壤鐵的釋放效應(yīng)[J].土壤通報(bào),2008,39(2):315-320.

[11]李龍泉,林長(zhǎng)山,朱玉瑞.定量化學(xué)分析[M].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1997:123,220-221.

[12]楊芳芳.蘆薈汁中總酸度的測(cè)定[J].中國(guó)農(nóng)村科技,2009(10):78-79.

[13]楊劍虹,王成秋,代亨林.土壤農(nóng)化分析與環(huán)境監(jiān)測(cè)[M].北京:中國(guó)大地出版社,2008:61-66.

[14]WANG M X,YUAN L,ZHOU Z F,et al.Efflux of oxalate and uptake of nitrogen,phosphorus and potassium by ectomycorrhizal fungal isolates in vitro in response to aluminum stress[J].Scientia Silvae Sinicae,2012,48(2):82-88.

[15]王明霞,袁玲,周志峰,等.鋁對(duì)外生菌根真菌草酸分泌及氮磷鉀吸收的影響[J].林業(yè)科學(xué),2012,48(2):82-88.

[16]張宇龍,盧小良,楊成德.東祁連山高寒草地土壤無機(jī)磷溶解菌分離及溶磷能力初探[J].草地學(xué)報(bào),2011,19(4):560-564.

[17]ILLMER P,SCHINNER F.Solubilization of inorganic calcium phosphates-solubilization mechanisms[J].Soil Biology and Biochemistry,1995,27(3):257-263.

[18]黃靜,盛下放,何琳燕.具溶磷能力的植物內(nèi)生促生細(xì)菌的分離篩選及其生物多樣性[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(6):710-716.

[19]張亮,王明霞,張薇,等.外生菌根真菌對(duì)土壤鉀的活化作用[J].微生物學(xué)報(bào)，2014,54(7):786-792.

[20]WALLANDER H,FOSSUM A,ROSENGREN U,et al.Ectomycorrhizal fungal biomass in roots and uptakeof P from apatite by Pinus sylvestris seedlings growing in forest soil with and without wood ash amendment[J].Mycorrhiza,2005,15(2):143-148.

文章編號(hào)：1004—5570(2016)03-0037-05

收稿日期：2016-03-02

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201513843015Y)；泰州市科技支撐計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(TS018)；泰州市科技支撐計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(TS201516)

作者簡(jiǎn)介：張亮(1987-)，男，碩士，講師，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物與植物營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail：liangzai0061@126.com.

中圖分類號(hào)：S153.1；S718.81

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Activation of phosphorus from soil by ectomycorrhizal fungi under aluminum stress

ZHANG Liang,XIA Rongrong,CHEN Meiling,XIA Wenjing,CHEN Yuxi

(School of Chemistry and Bioengineering, Taizhou College, Nanjing Normal University, Taizhou，Jiangsu 225300, China)

Abstract:Pisolithus tinctorius (Pt) and Lactarius delicious (Ld) were cultured in liquid Pachlewsk medium with soil as the phosphorus (P) source under aluminum stress to study the fungal growth, P uptake, efflux of protons, oxalic acid and titratable acid, and changes of soil available P were measured to study P mobilization from soil by ECMFs. The result indicated that the fungal growth, oxalicacid efflux, P concentration and uptake, first increased and then decreased with the increase of the concentration of aluminum. The biomass of Pt was higher than Ld in all aluminum concentration, showed that the resistance to aluminum toxicity of Pt was stronger than Ld. In addition, the pH of culture mediums was decreased gradually with the soil available P increased gradually and the mobilization ability of Pt was stronger than Ld. Correlation analysis shows that oxalic acid exuded by ECMFs was significant positively related to soil available P (r = 0.680*, n = 11), indicated that oxalic acid exuded by ECMFs is primary importance during the process of mobilizing insoluble P in soil. Therefore, the ability to resist aluminum and mobilize P was related to protons and organic acids by ECMFs efflux.

Key words:aluminum; ectomycorrhizal fungi; acid soil; phosphorus