張 江譯自Asian Australas. J. Anim. Sci.， Vol.28（2015），№9：1362～1370

日糧蛋白水平對(duì)豬糞惡臭化合物及細(xì)菌生態(tài)的影響（續(xù)完）

張 江*譯自Asian Australas. J. Anim. Sci.， Vol.28（2015），№9：1362～1370

3 結(jié)果

3.1 日糧粗蛋白水平對(duì)糞便中惡臭化合物濃度的影響

在粗蛋白水平為20 %、17、5 %和15 %的處理組中，酚含量分別為24.03 mg/L、28.84 mg/L和15.58 mg/L（P＜0.05），吲哚含量為3.67 mg/L、3.04 mg/L 和2.12 mg/L（P＜0.05）。15 %粗蛋白組具有最低的酚和吲哚濃度，與粗蛋白20 %的試驗(yàn)組相比，酚濃度降低35 %，吲哚濃度降低42 %。乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸等揮發(fā)性脂肪酸的濃度隨日糧粗蛋白含量增大而提高，15 %粗蛋白組的SCFA 和BCFA含量最低（表2）。

3.2 日糧粗蛋白水平對(duì)糞便中菌落組成變化的影響

焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)：20 %粗蛋白組和15 %粗蛋白組的所有測(cè)序reads分別有9 858和13 167個(gè)序列。在去除低質(zhì)量reads后，有7 824（20 %粗蛋白組）和11 156（15 %粗蛋白組）個(gè)細(xì)菌reads用于后續(xù)分析（表3）。在剪去PCR引物后，20 %粗蛋白組和15 %粗蛋白組的平均reads長(zhǎng)度分別為505和500。

雖然15 %粗蛋白組中細(xì)菌reads數(shù)高于20 %粗蛋白組，但OTUs數(shù)量、多樣性（香農(nóng)指數(shù)）和豐度（Chao1）卻低于20 %粗蛋白組。這一結(jié)果表明，15 %粗蛋白組的菌落比20 %粗蛋白組簡(jiǎn)單。

細(xì)菌分類學(xué)組成：在門這個(gè)分類層面，主要是厚壁菌門，相對(duì)豐度比例超過(guò)70 %，其次是擬桿菌和變形菌門。厚壁菌門的相對(duì)豐度不受日糧處理影響。15 %粗蛋白組的擬桿菌相對(duì)豐度（3.3 %）低于20 %粗蛋白組（12.1 %，P＜0.05），而20 %粗蛋白組的變形菌豐度（6.8 %）低于15 %粗蛋白組（12.1 %，P＜0.05）。在屬這個(gè)分類層面可看出更細(xì)微的差異。其中15 %粗蛋白組中（厚壁菌門）芽孢桿菌綱的鏈球菌屬、芽孢桿菌屬和肉桿菌屬，（厚壁菌門）梭菌綱的嗜胨菌屬和瘤胃菌屬，（擬桿菌門）擬桿菌綱的擬桿菌屬，（變形菌門）變形菌綱的假單胞菌均低于20 %粗蛋白組，而（厚壁菌門）芽孢桿菌綱的腸球菌屬、（厚壁菌門）梭菌綱的梭狀芽孢桿菌屬和（變形菌門）變形菌綱的叢毛單胞菌屬高于20 %粗蛋白組。

3.4 細(xì)菌屬的相對(duì)豐度與糞便惡臭化合物的相關(guān)性

酚、吲哚、異丁酸和異戊酸與肉桿菌屬、對(duì)甲酚和糞臭素與擬桿菌屬、乙酸和丁酸與紫單胞菌科AM982595屬以及丙酸與組織菌屬之間存在顯著的相關(guān)性。

4 討論

由于微生物厭氧分解營(yíng)養(yǎng)素生成惡臭化合物，因此減少營(yíng)養(yǎng)素的排出對(duì)減少惡臭至關(guān)重要。尤其是氮的排出是生成惡臭化合物的主要原因。

日糧粗蛋白水平從18 %降低至12 %，生長(zhǎng)豬和肥育豬糞便中酚、吲哚、SCFA和BCFA等惡臭化合物生成減少40 %。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與20 %粗蛋白試驗(yàn)組相比，15 %粗蛋白組中酚、吲哚、SCFA和BCFA的含量降低35～40 %。酚、吲哚和BCFA比其他化合物具有更高的臭氣強(qiáng)度及更低的氣味檢測(cè)閾值。從豬舍、糞便存放地以及施肥土壤中散發(fā)出來(lái)的吲哚、對(duì)甲酚和糞臭素占所有揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）氣味活性值的90 %以上，尤其是對(duì)甲酚，是VOC排放惡臭的最重要因素。

未消化的日糧蛋白和內(nèi)源性蛋白通過(guò)胃腸道，加速可發(fā)酵蛋白質(zhì)的細(xì)菌增殖，生成潛在的惡臭化合物如酚、吲哚和BCFA。在大腸吸收的酚和吲哚隨后與肝臟中的葡糖醛酸結(jié)合，并通過(guò)尿液以葡糖苷酸形式排出。在糞便中，尿葡糖苷酸通過(guò)糞便β-葡萄糖醛酸酶催化水解，釋放出酚和吲哚。有報(bào)道指出，日糧蛋白質(zhì)攝入量和尿液酚排出之間存在正相關(guān)。降低日糧粗蛋白水平，使得氮排放減少，從而降低豬糞便中細(xì)菌的發(fā)酵。因此，日糧粗蛋白水平從20 %降低到15 %，可能減少蛋白質(zhì)發(fā)酵期間代謝的酚、吲哚和BCFA。

與細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)計(jì)數(shù)相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)無(wú)需培養(yǎng)，可提供更為準(zhǔn)確的菌落信息?；?6s rRNA基因序列的多重bar-coded焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠識(shí)別低至1 %的菌落。因此，這種技術(shù)已被用于分析大腸和糞便中的多種細(xì)菌，并用于解釋與惡臭化合物生成有關(guān)的新菌落。

來(lái)源于蛋白質(zhì)的氮和氨基酸為分解糖和不分解糖的細(xì)菌生長(zhǎng)提供能量來(lái)源。提供過(guò)量日糧蛋白可導(dǎo)致多種腸道細(xì)菌大量增殖，因?yàn)檫^(guò)量或未消化的蛋白質(zhì)被用作細(xì)菌發(fā)酵的底物。我們發(fā)現(xiàn)，15 %粗蛋白組中菌群多樣性低于20 %粗蛋白組，這表明這些菌群對(duì)豬日糧蛋白水平的細(xì)微變化非常敏感。

與以前的研究相似，本研究中細(xì)菌分類情況表明，厚壁菌、擬桿菌以及變形菌是主要的細(xì)菌類別。構(gòu)成大多數(shù)腸道細(xì)菌的厚壁菌和擬桿菌數(shù)與碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。這兩個(gè)門的細(xì)菌被用作進(jìn)化標(biāo)記物，因?yàn)槠湄S度容易受胃腸道中發(fā)酵條件的影響。在我們的研究中，與15 %粗蛋白組相比，20 %粗蛋白組的擬桿菌相對(duì)豐度較高，但變形菌豐度較低。

細(xì)菌豐度的改變與豬糞中生成的惡臭化合物組成有關(guān)。擬桿菌在進(jìn)行脫氨基和脫羧基過(guò)程中，可生成最為惡臭的化合物之一糞臭素。與此相反，糞臭素含量較高的樣品中，變形菌相對(duì)豐度較低。大多數(shù)細(xì)菌在代謝氨基酸時(shí)會(huì)生成VFA、酚和吲哚。擬桿菌、丙酸桿菌、梭狀芽孢桿菌、真桿菌和鏈球菌將甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸代謝為乙酸。氨基酸的微生物代謝也會(huì)生成其他揮發(fā)性脂肪酸，比如谷氨酸和賴氨酸會(huì)生成丁酸，丙氨酸和蘇氨酸生成丙酸，纈氨酸生成異丁酸，亮氨酸和異亮氨酸生成異戊酸。此外，擬桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、梭菌以及消化鏈球菌通過(guò)代謝芳香化合物如酪氨酸和色氨酸生成酚和吲哚。念球菌、芽孢桿菌、肉桿菌、擬桿菌及假單胞菌將色氨酸代謝為吲哚-3-乳酸，并在糞便中分解為吲哚和糞臭素。我們的研究發(fā)現(xiàn)，15 %粗蛋白組中，生成吲哚和糞臭素的成分含量低于20 %粗蛋白組。此外，芽孢桿菌、擬桿菌和假單胞菌通過(guò)支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的脫氨基作用生成BCFA。擬桿菌類分泌各種大量的蛋白酶，分解內(nèi)源性和外源性蛋白。細(xì)菌蛋白酶的行為類似于彈性蛋白酶，會(huì)破壞刷狀緣的麥芽糖酶和蔗糖酶。嗜胨菌作為不分解糖的細(xì)菌可利用蛋白質(zhì)作為能量來(lái)源，并生成BCFA和吲哚。與擬桿菌相比，在15 %粗蛋白組中含量更高的梭菌生成的SCFA、BCFA和吲哚的量少于高蛋白組（20 %）。這些結(jié)果表明，改變?nèi)占Z蛋白水平可調(diào)節(jié)菌落組成和相對(duì)菌群豐度。

酚、吲哚、異丁酸和異戊酸與肉桿菌存在強(qiáng)烈的正相關(guān)。肉桿菌可將纈氨酸和色氨酸代謝為BCFA和吲哚，并與雞糞中VOC中酚類存在強(qiáng)烈的正相關(guān)。擬桿菌是革蘭氏陰性和專性厭氧菌屬，提供了對(duì)疏水性分子有效的屏障，因此可將疏水性氨基酸，包括色氨酸和酪氨酸以及芳香氨基酸代謝為酚、吲哚及其前體。對(duì)甲酚和糞臭素的生成也與擬桿菌呈現(xiàn)正相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)乙酸和丁酸與紫單胞菌科、丙酸與組織菌之間也存在強(qiáng)烈的正相關(guān)。紫單胞菌科細(xì)菌生成多種揮發(fā)性有機(jī)物，如該科的蛋白水解菌從多種氨基酸產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸。組織菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，最初從人糞便中分離，可產(chǎn)生乙酸，是分解肌酸酐的中間物質(zhì)。這些結(jié)果表明，肉桿菌及擬桿菌與酚、吲哚和BCFA等惡臭化合物之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)。

5 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，調(diào)整日糧粗蛋白水平會(huì)影響惡臭化合物及微生物菌群的組成。添加15 %的粗蛋白而不是20 %的粗蛋白可顯著降低豬糞中惡臭化合物。焦磷酸測(cè)序分類分析表明，惡臭化合物和菌群之間存在強(qiáng)相關(guān)。更進(jìn)一步的研究將側(cè)重查明細(xì)菌代謝的確切機(jī)制，并在豬舍中應(yīng)用惡臭生成的預(yù)測(cè)模型。

原題名：Effect of Dietary Protein Levels on Composition of Odorous Compounds and Bacterial Ecology in Pig Manure （英文）

原作者： Sungback Cho（韓國(guó)農(nóng)村發(fā)展局國(guó)家動(dòng)物科學(xué)研究所）

S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C

1001-0769（2016）07-0075-03

張江，男，上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授。