孫海瓊，汪春蕾

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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耐銅菌株4bs的鑒定及其對染料脫色的效果

孫海瓊，汪春蕾*

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

從土壤中篩選出1株具有較高漆酶活性的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌，將其命名為Bacillus sp. 4bs。菌株4bs的最適生長溫度和pH分別為37 ℃和7.0，其在6%（w/v）NaCl溶液中能夠正常生長，在含有2.0 mmol/L Cu2+的培養(yǎng)基中仍生長旺盛。以丁香醛連氮為底物，菌株4bs的芽孢漆酶活性為35.66 U/g（干重），其芽孢漆酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃，最適反應(yīng)pH值為6.8；0.1 mmol/L的半胱氨酸、二硫蘇糖醇和疊氮化鈉抑制其活性，10 mmol/L的Na+、K+、Cu2+和Li+能夠增強其活性。在pH 6.8的體系中，菌株4bs芽孢漆酶對結(jié)晶紫和茜素紅在6 h內(nèi)的脫色率分別為83.57%和77.16%；加入乙酰丁香酮（Ace）作介體時，對靛紅的脫色率由52.73%提高到94.98%，對活性黑5的脫色率由19.01%提高到90.10%。

細(xì)菌漆酶；芽孢桿菌；染料脫色；銅抗性

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漆酶（EC1.10.3.2，laccase）是自然界廣泛分布的多銅氧化酶家族中的一員［1］，它能利用分子氧作為電子受體氧化多種酚類及非酚類的化合物，同時將分子氧還原為水［2］。近年來，漆酶在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域已成為一大研究熱點。真菌漆酶分泌于胞外，分析研究方便，所以，關(guān)于真菌漆酶的研究較多。Alexandre等［3］在原核生物中也發(fā)現(xiàn)了漆酶。細(xì)菌漆酶大部分為單體酶，其熱穩(wěn)定性好，結(jié)構(gòu)上無需糖基化；芽孢漆酶的適用pH范圍廣，能更好地降解偏堿性的染料及廢水［4-8］，因此，漆酶在工業(yè)應(yīng)用中具有更廣闊的前景。

在紡織業(yè)、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)生產(chǎn)中需要用到大量染料，染料廢液的處理有待研究。大多染料的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，穩(wěn)定性較高，可降解性差，在印染過程中對環(huán)境的污染嚴(yán)重。傳統(tǒng)的化學(xué)或物理處理方法很有可能在降解過程中造成二次污染［9］。采用生物學(xué)方法處理染料是較為環(huán)保的方式。采用酶制劑降解染料廢水不僅效率高，而且操作簡單。漆酶是在染料降解與廢水脫色方面應(yīng)用最為廣泛的一種酶制劑［10-11］。

為了探尋可對染料廢水進(jìn)行生物處理的新菌株，筆者從東北林業(yè)大學(xué)實驗林場白樺林下的土壤中分離出1株具有較高漆酶活性的菌株，對該菌株進(jìn)行鑒定，并研究該菌株芽孢漆酶的性質(zhì)，利用其芽孢漆酶對偶氮、蒽醌、靛藍(lán)及三苯甲烷類染料進(jìn)行脫色，取得了較好的脫色效果，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

土樣采自東北林業(yè)大學(xué)實驗林場白樺林下。

Taq DNA Polymerase、B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒、溶菌酶和大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞購自北京TIANGEN公司；DNA Marker DL2000、dNTP（2.5 mmol/L）、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；氨芐青霉素、丁香醛連氮、結(jié)晶紫、靛紅、活性黑5和茜素紅購自Sigma公司；其他的常規(guī)試劑均為國產(chǎn)、分析純制品。

1.2方法

1.2.1菌株的篩選與純化

菌株的篩選與純化方法見參考文獻(xiàn)［12］。利用丁香醛連氮對篩選出的單菌落進(jìn)行定性檢測，選取1株長勢較好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2菌株生長特性的觀測

該菌株的革蘭氏染色方法及該菌株的生理生化特性測定方法參見文獻(xiàn)［13］。

1.2.3菌株的16S rDNA序列分析

菌株總DNA的提取方法見參考文獻(xiàn)［14］。以菌株的總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物［15］進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：滅菌蒸餾水35.5 μL，10×PCR Buffer（含15 mmol/L MgCl2）5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，2.5 μmol/L的引物27F和1492R 各1.5 μL，DNA模板2 μL，5 U/μL Taq Polymerase 0.5 μL。反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［12］。

采用膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD18-T載體連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用其對氨芐青霉素的抗受性進(jìn)行菌落篩選，經(jīng)PCR檢測出條帶，然后送華大基因公司進(jìn)行測序。在 NCBI上將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源比對分析，選取一些同源性較高的序列經(jīng)ClustalX比對后，采用最大簡約法，用Phylip軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4菌株的生物學(xué)特性研究

研究不同溫度（15～55 ℃）、pH值（3～10）、NaCl濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%～10%）和 Cu2+濃度（0.2～6.0 mmol/L）對菌株生長的影響。將菌株活化后按1%的接種量分別接種于不同條件的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，測定OD600 nm，重復(fù)測定3次。

1.2.5菌株芽孢漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

利用含0.2 mmol/L Cu2+的LB固體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)該菌株，37 ℃倒置培養(yǎng)5～7 d，參見文獻(xiàn)［14］制備芽孢漆酶懸液。以丁香醛連氮為底物檢測漆酶的活性，反應(yīng)體系：0.5 mL的1 mmol/L丁香醛連氮溶液，50 μL芽孢漆酶懸液，2.45 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）。設(shè)置空白對照（體系中不加芽孢漆酶懸液）。37 ℃反應(yīng)3 min后測OD525nm，重復(fù)測定3次。將1 min內(nèi)氧化1 μmol底物所需的酶量定義為一個酶活單位。取1 mL芽孢懸液，在80 ℃下烘干至恒重，計算每1 g芽孢（干重）所具有的漆酶的活性。

研究溫度、pH值、抑制劑和金屬離子對芽孢漆酶活性的影響，反應(yīng)體系均為3 mL，其中金屬離子終濃度均為10 mmol/L，抑制劑十二烷基硫酸鈉（SDS）、疊氮化鈉（NaN3）、二硫蘇糖醇（DTT）和半胱氨酸（Cysteine）的終濃度均設(shè) 3個梯度（0.1、1.0、10 mmol/L），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的終濃度設(shè) 5個梯度（0.1、1.0、10、50、100 mmol/L），具體操作方法參見文獻(xiàn)［14］。

1.2.6菌株芽孢漆酶對染料脫色影響的研究

所用染料結(jié)構(gòu)、終濃度及其最大吸收波長見表1。染料脫色體系緩沖液的pH值為該菌株芽孢漆酶的最適pH 6.8。反應(yīng)總體積為6 mL，其中芽孢漆酶懸浮液 50 μL，介體乙酰丁香酮（Ace）的終濃度為 0.1 mmol/L，于40 ℃、160 r/min搖床中進(jìn)行脫色。在相應(yīng)的波長下測定染料的光密度值。以不含芽孢漆酶的體系為空白對照，計算芽孢漆酶對染料的脫色率。脫色率R=（A0-A）/A，其中A為定期取樣時染料的光密度值，A0為初始染料的光密度值。

2　結(jié)果與分析

2.1具有漆酶活性菌株的篩選與純化結(jié)果

經(jīng)過丁香醛連氮的定性檢測，在白樺林下的土壤樣品中篩選并純化 10株具有漆酶活性的菌株。選取1株顯深紅色的菌株（將其編號為4bs）進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2菌株的生長特性

菌株4bs革蘭氏染色顯藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌，具有芽孢。該菌株能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖和果糖等單糖和蔗糖、乳糖和麥芽糖等，不能利用的糖類有甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖、鼠李糖和甘露糖。

菌株4bs的16S rDNA序列全長為1 513 bp，在NCBI上經(jīng)BLAST同源性分析的結(jié)果表明，該菌株與多種芽孢桿菌的同源性達(dá)到99%，結(jié)合16S rDNA序列分析以及該菌株的生長特性，可確定 4bs為芽孢桿菌屬菌株，故將其命名為Bacillus sp. 4bs。以16S rDNA序列構(gòu)建的該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。

圖1　菌株4bs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain 4bs

菌株4bs的最適生長溫度為37 ℃，在20～42 ℃均能生長（圖2）；最適生長pH值為7.0，在pH 5.0～8.0菌株生長良好（圖3）；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～6%的NaCl溶液中可以正常生長（圖4）；在含0.2～2.0 mmol/L Cu2+的培養(yǎng)基中可以正常生長，4.0～6.0 mmol/L Cu2+輕度抑制其生長（圖5）?？梢?，該菌株對NaCl溶液和Cu2+的抗性都比較強，適合用于對工業(yè)廢水進(jìn)行處理。

圖2　菌株4bs在不同生長溫度的OD600 nmFig.2 OD600 nmof the strain 4bs at different temperatures

圖3　 菌株4bs在不同pH的OD600 nmFig. 3 OD600 nmof the strain 4bs at different pH

圖4　菌株4bs在不同濃度NaCl下的OD600nmFig.4 OD600 nmof the strain 4bs at different concentration of NaCl

圖5　 菌株4bs在不同濃度Cu2+下的OD600nmFig.5 OD600 nmof the strain 4bs at different concentration of Cu2+

2.3菌株4bs芽孢漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

以丁香醛連氮為底物，測定菌株4bs芽孢漆酶的活性為35.66 U/g（干重）。

菌株4bs芽孢漆酶在80 ℃時的酶活最大，在37～90 ℃均具有較高的酶活（圖6），其最適酶活溫度比真菌漆酶的最適溫度高10～30 ℃［16］，其最適反應(yīng)pH值為6.8，在pH為6.0～7.5時酶活較高（圖7）。終濃度均為10 mmol/L的Na+、K+、Cu2+和Li+能夠增強菌株4bs芽孢漆酶的活性，而終濃度均為10 mmol/L的Mn2+、Fe2+、Ag+、Hg2+和Fe3+都強烈抑制其活性（表2）。

圖6　 菌株4bs芽孢漆酶在不同溫度下的相對酶活性Fig.6 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 4bs at different temperatures

圖7　 菌株4bs芽孢漆酶在不同pH下的相對酶活性Fig.7 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 4bs at different pH

表2　在終濃度為10 mmol/L的金屬離子作用下菌株4bs的芽孢漆酶活性Table 2 Effects of metal ions at the final concentration of 10 mmol/L on spore laccase activity of the strain 4bs

0.1mmol/L Cysteine和DTT強烈地抑制菌株4bs芽孢漆酶的活性。0.1 mmol/L的EDTA對芽孢漆酶的活性有輕微的促進(jìn)作用，EDTA的濃度大于50 mmol/L時對芽孢漆酶活性有一定的抑制作用。濃度大于1 mmol/L的SDS和NaN3都對芽孢漆酶活性有一定的抑制作用（表3）。

表3　不同抑制劑作用下菌株4bs的芽孢漆酶活性Tab.3 Effects of different inhibitors on spore laccase activity of the strain 4bs

2.4菌株4bs的芽孢漆酶對染料脫色的效果

菌株4bs的芽孢漆酶在pH 6.8的條件下，6 h內(nèi)對結(jié)晶紫（三苯甲烷類）、茜素紅（蒽醌類）、靛紅（靛藍(lán)類）和活性黑5（偶氮類）的脫色率分別為83.57%，77.16%，52.73%和19.01%（圖8），說明該芽孢漆酶對三苯甲烷類染料的脫色效果較好。體系中加入介體乙酰丁香酮（Ace），芽孢漆酶在6 h內(nèi)對這4種染料的脫色率都達(dá)到了80%以上，對靛紅和活性黑5的脫色率有較顯著的提高，分別提高到 94.98%和90.10% （圖9）。

圖8　菌株4bs芽孢漆酶在不同脫色時間對4種染料的脫色率Fig.8 Decolorization of 4 kinds of dyes by spore laccase in the strain 4bs at different time

圖9　添加乙酰丁香酮后菌株4bs芽孢漆酶在不同脫色時間對4種染料的脫色率Fig. 9 Decolorization of 4 kinds of dyes with acetosyringone by spore laccase in the strain 4bs at different time

3　結(jié)論與討論

菌株4bs具有很好的耐銅特性，這一特性使得該菌株容易被篩選出來。菌株4bs對Cu2+的抗性較強，在含2 mmol/L Cu2+的培養(yǎng)基中仍能正常生長。與文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果（芽孢桿菌屬菌株CLb在Cu2+濃度為0～0.6 mmol /L時可正常生長［12］；枯草芽孢桿菌WD23在含0～0.2 mmol/L Cu2+的培養(yǎng)基中可以正常生長［14］；芽孢桿菌9BS在含有0.2 mmol/L Cu2+培養(yǎng)基中能夠生長［17］）相比較，菌株4bs對Cu2+的抗性非常強，這是它獨有的特性。

Cu2+是漆酶催化中心的輔助因子［18］，在漆酶轉(zhuǎn)錄后的折疊與組裝中也是必需的［19］。漆酶的活性依賴于 Cu2+的研究結(jié)果［20］已在細(xì)菌漆酶和真菌漆酶中得到證實。本研究中Cu2+能夠增強菌株4bs芽孢漆酶的活性，10 mmol/L Cu2+能夠使其活性增強104.5%。工業(yè)廢水中常含有Cu2+，Cu2+的濃度超過一定范圍就會干擾漆酶的活性，所以，漆酶對Cu2+的耐受性也受到特別關(guān)注［21］。

大多數(shù)真菌漆酶在酸性pH范圍內(nèi)具有活性，如靈芝漆酶在pH值2.2～2.6具有活性［22］，血紅密孔菌以ABTS為底物時的最適反應(yīng)pH值為2.4，pH值大于3.0時抑制該酶活性［23］，絲孢菌（Monodictys asperospera）的漆酶在pH值為6.0時的活性最高，而細(xì)菌漆酶大多數(shù)在中性至堿性范圍內(nèi)具有活性［24］，細(xì)菌菌株WD23的漆酶最適反應(yīng)pH值為6.8［25］。本研究中菌株 4bs的芽孢漆酶最適反應(yīng) pH值為6.8，在強堿（pH值9.0）環(huán)境下仍具有活性。

本研究中0.1 mmol/L的Cysteine和DTT以及10 mmol/L的NaN3對菌株4bs芽孢漆酶有明顯的抑制作用。據(jù)報道，DTT和Cysteine也能夠強烈抑制解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LS05的芽孢漆酶活性，0.1 mmol/L的NaN3也可使其酶活喪失30%左右［26］；10 mmol/L的EDTA、0.1 mmol/L 的DTT和10 mmol/L的NaN3能夠完全抑制子囊菌（Paraconiothyrium variabile）漆酶的活性［27］，絲狀真菌（Aspergillus ochraceus）NCIM-1146的漆酶活性被NaN3、EDTA、DTT和Cysteine強烈抑制［28］，可見，這幾種漆酶抑制劑對細(xì)菌漆酶的作用和對真菌漆酶的作用相似。本研究中菌株4bs的芽孢漆酶對三苯甲烷類染料結(jié)晶紫和蒽醌類染料茜素紅具有較好的脫色效果，在pH值6.8時，脫色6 h對結(jié)晶紫的脫色率達(dá)83.57%，對茜素紅的脫色率達(dá)77.16%（漆酶Lac3T93在pH為8.0的脫色體系中12 h使結(jié)晶紫脫色10%左右，鳳尾菇漆酶經(jīng)過5 d對結(jié)晶紫的脫色率約 44%［29］）。介體通常能夠增強漆酶對染料的脫色率，加入介體乙酰丁香酮后，菌株4bs芽孢漆酶對偶氮類染料活性黑 5的脫色率由 19.01%提高至 90.10%，對靛藍(lán)類染料靛紅的脫色率由52.73%提高至94.98%。

菌株4bs芽孢漆酶適于對高鹽度和高pH工業(yè)廢水進(jìn)行處理，在沒有介體的情況下對結(jié)晶紫和茜素紅有較好的脫色效果，在介體乙酰丁香酮作用下對靛紅和活性黑的脫色率提高，可見，菌株 4bs的芽孢漆酶在染料廢水脫色方面具有較大的應(yīng)用潛力。

本研究結(jié)果表明：篩選出的菌株 4bs對銅離子和NaCl都具有很強的耐性，其芽孢漆酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃，最適反應(yīng)pH值為6.8，半胱氨酸、二硫蘇糖醇和疊氮化鈉抑制其活性，Na+、K+、Cu2+和Li+能夠增強其活性，其芽孢漆酶對多種染料具有較好的脫色效果，是很有潛力的治理廢水的菌株。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Identification of the copper tolerance strain 4bs and its effects on dye decolorization

Sun Haiqiong， Wang Chunlei*
（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

A novel strain showing high laccase activity was separated from soil using screening agent， the strain was identified as Bacillus from classical and molecular biological methods, and named by Bacillus sp. 4bs. The optimum temperature and pH for the strain growth was 37 ℃ and 7.0， respectively. It cloud normal grow in solution of 6% NaCl （w/v） or 2.0 mmol/L Cu2+. The spore laccase activity was 35.66 U/g by dry weight in the substrate with syringaldazine. The optimum reaction temperature and pH for spore laccase of the strain was 80 ℃ and 6.8， respectively， its activity could be strongly inhibited with 0.1 mmol/L Cysteine， DTT， and NaN3， while， 10 mmol/L Na+， K+， Cu2+， and Li+could increase its activity. The spore laccase of the strain could decolorize 83.57% of crystal violet and 77.16% of alizarin red at pH 6.8 without mediator， however， the decolorization rate of isatin and reactive black 5 was increased from 52.73% and 19.01% to their 94.98% and 90.10% respectively when acetosyringone was added as a mediator.

bacterial laccase； dye decolorization； copper tolerance； phylogenetic tree

孫海瓊（1993—），女，甘肅蘭州人，主要從事微生物學(xué)研究，626343869@qq.com；*通信作者，汪春蕾，博士，副教授，主要從事微生物學(xué)研究，wcls-1972@163.com

X172；X788；S188

A

1007-1032（2016）04-0403-06

2015-11-10 修回日期：2016-06-26

國家自然科學(xué)基金項目（J1210053）