許白葉，張靜，王清海，梁世山，陳真，王海島

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 兒科，福建 泉州 362000；2.福建泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建 泉州 362000）

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論著

阻斷白介素-3減輕膿毒血癥小鼠的炎癥反應(yīng)

許白葉1，張靜2，王清海1，梁世山1，陳真1，王海島1

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 兒科，福建 泉州 362000；2.福建泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362000）

摘要：目的探究阻斷白介素-3（IL-3）對膿毒性小鼠炎癥反應(yīng)的作用及其潛在機(jī)制。方法小鼠盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（CLP）后，分為野生型小鼠組和IL-3缺陷型小鼠組，每組13只，連續(xù)7 d觀察和記錄小鼠的死亡數(shù)。另取野生型小鼠和IL-3缺陷型小鼠，每組20只，分為3組進(jìn)行實驗：①組小鼠分別在CLP后0、12和24h進(jìn)行臨床癥狀評分和體溫測量；另在24h測血壓，采血，用于測定干擾素-α（IFN-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平；②組小鼠分別在CLP后0、6、12和24 h采血并在24 h取材（肝、肺），用于測定中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞總數(shù)及病理、免疫組織化學(xué)分析；③組小鼠分別在CLP后0和24h采血并收集支氣管肺泡灌洗液用于蛋白總量和生化指標(biāo)[天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）]的測定。結(jié)果與野生型小鼠組比較，CLP后IL-3缺陷型小鼠的存活率和體溫升高（P<0.05），血壓良好，臨床癥狀評分下降（P<0.05）。此外，與野生型小鼠組比較，CLP后IL-3缺陷型小鼠炎癥細(xì)胞因子IFN-α、IL-1β和IL-6水平降低（P<0.05）；肺和肝組織中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞總數(shù)降低（P<0.05）；支氣管肺泡灌洗液中的總蛋白和血生化指標(biāo)（AST、ALT）也降低（P<0.05）。結(jié)論 阻斷IL-3能夠減輕膿毒性小鼠的炎癥反應(yīng)，提高膿毒性小鼠的存活率。

關(guān)鍵詞：膿毒血癥；盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)；中性粒細(xì)胞；單核細(xì)胞；支氣管肺泡灌洗液；干擾素-α

膿毒血癥是指由病原微生物感染引起的并對宿主產(chǎn)生危害及不可控的全身炎癥反應(yīng)綜合征（sys temic inflammatory response syndrome，SIRS），導(dǎo)致多個器官衰竭，具有發(fā)病率高、病情發(fā)展迅速、臨床死亡率高（30%～70%）的特點，全球每年有超過1 800萬例的嚴(yán)重膿毒血癥患者。

盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）最廣泛用于嚙齒類動物實驗性膿毒血癥模型，目前被認(rèn)為是膿毒血癥研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)[1-4]。由于盲腸是病原菌感染的內(nèi)在來源，CLP后，穿孔的盲腸將導(dǎo)致病原菌性腹膜炎，并且引發(fā)混合的腸原桿菌轉(zhuǎn)移至血液循環(huán)系統(tǒng)。膿毒血癥發(fā)病初期，菌血癥會激活全身性炎癥反應(yīng)，隨后出現(xiàn)膿毒性休克，多器官功能損傷，最后導(dǎo)致死亡。膿毒血癥在臨床上仍然具有很大挑戰(zhàn)，其潛在的病理生理特性還不清楚。

白介素-3（Interleukin-3，IL-3），又稱多集落刺激因子，是白細(xì)胞介素家族重要成員之一，主要由活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生，IL-3不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的產(chǎn)生，增殖和生長，還能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的定向分化與增殖，并在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（Interferon-α，IFN-α）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和白介素-6 （Interleukin-6，IL-6），這些細(xì)胞因子是膿毒性休克的標(biāo)志性炎癥因子[5-7]。研究表明，大多數(shù)膿毒性休克與炎癥細(xì)胞因子增多密切相關(guān)，包括IFN-α、IL-1和IL-6[8-9]。盡管炎癥細(xì)胞因子與膿毒血癥有關(guān)，但I(xiàn)L-3在膿毒血癥中的作用仍不清楚。

本研究旨在通過盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)建立小鼠膿毒血癥模型，闡述IL-3在膿毒血癥中的作用及其潛在機(jī)制，尤其是IL-3對膿毒性小鼠炎癥反應(yīng)的影響，為臨床治療膿毒血癥提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

品系為Balb/c的IL-3基因敲除小鼠，4周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證號2014621553276679）。IL-3基因敲除：通過IL-3基因組文庫構(gòu)建一個替換型載體替換IL-3的第4個外顯子（80bp）。采用電穿孔法將此打靶載體轉(zhuǎn)入Balb/c小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞），經(jīng)過篩選得到陽性克隆的ES細(xì)胞，并植入假孕的Balb/c小鼠子宮內(nèi)，發(fā)育得到雜合子的IL-3基因敲除小鼠。小鼠的性成熟期約為35d，妊娠期約20d。雄雌鼠各1只合籠飼養(yǎng)，繁育出的子代為野生型IL-3+/+、雜合子型IL-3+/-和突變純合子型IL-3-/-3種表型。剪取小鼠尾巴末端約0.6 cm，根據(jù)QIAGEN說明書提取DNA，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定子代小鼠的基因型。野生型IL-3+/+小鼠作為對照組，突變純合子型IL-3-/-小鼠作為實驗組，雄性，8～12周齡，體重27～29g。小鼠飼養(yǎng)在無菌的籠盒內(nèi)，每籠5只，動物房溫度控制在20～25℃，12h晝/夜循環(huán)照明，動物可自由攝取高壓滅菌的水和食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有動物實驗符合國家實驗動物保護(hù)和使用健康指南，所有的動物實驗操作都遵守動物福利。

1.2試劑與儀器

紅細(xì)胞裂解液（美國，BioLegend），磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffersaline，PBS），anti-CD115（AF598，美國eBioscience公司），anti-Ly-6G（1A8，美國Bio Legend公司），生物素標(biāo)記的二抗（美國Vector Laboratories lnc公司），二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）（美國Dako公司），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT） 或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase AST）活性測定試劑盒（美國Sigma公司），Bio-Rad蛋白測定試劑盒（美國Bio-Rad公司），酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國BD Bioscience公司），酶標(biāo)儀（Model450，美國Bio-Rad Laboratories公司），BX-51光學(xué)顯微鏡（日本，Olympus公司），溫度感應(yīng)器（TH212型號，北京鴻鷗成運(yùn)科技有限公司），血壓測定儀（無創(chuàng)尾動脈血壓測定儀，RBP-1型號，澳大利亞，ADInstruments），冷凍切片機(jī)（CM1950，德國LEICA公司）。Image-Pro Plus 5.0形態(tài)學(xué)分析軟件（美國，Media Cybernetics公司）。

1.3方法

1.3.1PCR檢測PCR反應(yīng)引物由上海生物工程有限公司合成。引物1：CTCCAGATCGTTAAGGTGG A位于替換的基因片段，用于檢測突變型；引物2：GACCCTCTCTGAGGAATAAG位于IL-2基因敲除區(qū)域，用于檢測野生型；引物3：GTAGGTGGAAATTCTA GCAT作為通用引物。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸2 min。取PCR產(chǎn)物5μl于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，由引物1和3檢測出的條帶位于500bp處，為純合子小鼠；由引物2 和3檢測出的條帶位于324bp處，為野生型小鼠。2條帶均存在的為雜合子小鼠。

1.3.2小鼠CLP模型的建立所有實驗動物術(shù)前8h禁食，可自由飲水。手術(shù)前，動物常規(guī)腹部消毒，異氟烷持續(xù)麻醉，取腹部皮膚正中切開約2 cm，打開腹腔輕輕提出盲腸，小心分離其遠(yuǎn)端與大腸系膜，避免損傷腸系膜血管。如盲腸內(nèi)有糞便，可輕輕將其擠向與之相連的結(jié)腸。在盲腸遠(yuǎn)端1/2處用無菌可吸收的7號手術(shù)縫合絲線緊緊結(jié)扎，避免形成腸梗塞，用20號無菌注射針頭在已結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺2次，形成4個穿刺孔，輕輕擠出少量腸內(nèi)物以防止穿刺孔閉合，將盲腸推向腹腔，閉腹，逐層縫合。假手術(shù)：僅分離盲腸末端，不進(jìn)行結(jié)扎穿刺，其他所有手術(shù)操作一樣。所有動物均在術(shù)后背部皮下注射1 ml生理鹽水，行液體復(fù)蘇治療。整個實驗過程在室溫環(huán)境下進(jìn)行，術(shù)后小鼠自由飲食飲水。

1.3.3實驗分組①動物生存實驗。隨機(jī)選取野生型和IL-3缺陷型（IL-3-/-）的Balb/c小鼠各13只，分為野生型組（WT組）和IL-3缺陷型組（IL-3-/-組）。兩組實驗動物行CLP手術(shù)造模，CLP手術(shù)方法參考文獻(xiàn)[10]。首次造模后連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡數(shù)。②病理組織學(xué)與蛋白分析。另選取野生型和IL-3缺陷型的Balb/c小鼠各20只，分為兩組：野生型CLP組（WT組）和IL-3缺陷型CLP組（IL-3-/-組）。以前述方法造模，造模后按照以下時間點進(jìn)行病理組織學(xué)與蛋白分析。實驗操作：a.0、12和24h的臨床癥狀評分和體溫測量；0和24 h測血壓；24 h后采血，用于后續(xù)炎癥細(xì)胞因子的測定（每組7～8只）。b.0、6、12和24 h眼眶采血；24 h后取材（肝、肺），用于后續(xù)炎癥細(xì)胞總數(shù)測定、病理及免疫組織化學(xué)分析（每組6只）。C.0和24h麻醉下眼眶采血和支氣管肺泡灌洗后，收集灌洗液和血清做后續(xù)的蛋白總量和生化指標(biāo)的測定（每組6只）（0h作為CLP手術(shù)前的時間）。

1.3.4血生化指標(biāo)測定①炎癥細(xì)胞計數(shù)。將眼眶取血以1∶10稀釋比放入紅細(xì)胞裂解液中除去紅細(xì)胞，與臺盼藍(lán)1∶1混合，血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。②血清生化指標(biāo)測定。取5μl血清加入到96孔平底板中，ALT或AST測試緩沖液調(diào)整體積為50μl，加入100μl反應(yīng)混合液，37℃孵育，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度，根據(jù)吸光度計算酶的活力。方法參考AST或ALT活性測定試劑盒說明書。

1.3.5動物形態(tài)學(xué)檢測①體溫測量。將溫度感應(yīng)器插入麻醉狀態(tài)的小鼠直腸內(nèi)1.5～2.0 cm，溫度感應(yīng)器頭部涂抹凡士林以減少對動物的傷害，待溫度穩(wěn)定后記錄每只小鼠的體溫數(shù)據(jù)，平行測3次。②血壓測定。采用尾袖法（tail-cuff plethysmograph，TCP）測定小鼠的血壓。小鼠放在37℃熱板上，以保持小鼠尾部溫度適宜，連接血壓測定儀，每只動物連續(xù)測5次，取其平均值作為每只動物的收縮壓值。③臨床癥狀評分。根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)對每個小鼠進(jìn)行臨床癥狀評分：a.外表：正常，0分；缺乏理毛行為，1分；被毛雜亂，2分；彎腰弓背，3分；眼睛半閉合，4分。b.行為（無攻擊性）：正常，0分；沉郁，1分；少動孤立，2分；焦躁不安或非常平靜，3分。c.行為（攻擊性）：警覺，0分；無警覺感，3分。d.呼吸癥狀：呼吸正常，0分；呼吸微弱，1分；呼吸率降低并行腹式呼吸，2分；明顯的腹式呼吸并發(fā)紺，3分。e.脫水狀態(tài)：正常，0分；脫水，5分。臨床癥狀總分越高表明動物身體狀況越差。

1.3.6生理功能指標(biāo)檢測①蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）與免疫組織化學(xué)法。野生型（WT）和IL-3缺陷型（IL-3-/-）的Balb/c小鼠分別在CLP后24h取出肺和肝組織，切一小塊放入盛有最佳切削溫度（opti-mum cutting temperature, OCT）包埋劑的包埋盒中，包埋盒緩慢地放入預(yù)冷的異戊烷液面上，直至OCT包埋劑凝固，取出放入-80℃冰箱冷凍保存。取出冷凍的組織塊，切片機(jī)切6μm厚的薄片，放入預(yù)冷丙酮中固定10 min。將固定好的切片放入PBS中洗滌，HE染色，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡檢。另取組織切片，用磷酸鹽緩沖溶液Twen-20（phosphate buffer solution twen-20，PBST）洗滌后，經(jīng)5%BSA室溫孵育封閉1 h，加入anti-CD115和anti-Ly-6G 4℃過夜，加入生物素標(biāo)記的二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染、封片、鏡檢、拍照。BX-51光學(xué)顯微鏡和Image-Pro Plus 5.0形態(tài)學(xué)分析軟件觀察并數(shù)據(jù)分析。②ELISA測定炎癥細(xì)胞因子。CLP后24h收集血液分離出血清，適當(dāng)稀釋后ELISA試劑盒分析IFN-α、IL-1β和IL-6含量。③支氣管肺泡灌洗液總蛋白測定。小鼠在1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉下，眼科剪切開頸部皮膚，鈍性分離，暴露氣管，氣管上剪一小口，14 G針頭插入，橡皮筋扎緊，注射器吸取1 ml PBS緩沖液接上針頭，來回抽吸，直至肺部變白。Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液總蛋白。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，生存資料數(shù)據(jù)行Kaplan-Meier計算和Log-rank test分析。兩兩多重比較用Turkey檢驗，兩組比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1子代小鼠基因型鑒定

其中IL-3-/-有1條帶，大小為500 bp，IL-3+/-有2條帶，分別為500和324 bp，野生型有1條帶為324bp。見圖1。

2.2阻斷IL-3對CLP誘導(dǎo)小鼠死亡率的影響

野生型和IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后，連續(xù)觀察7d，記錄小鼠死亡數(shù)，結(jié)果顯示，野生型組小鼠手術(shù)后第1天死亡1只，第2天死亡3只，第3天死亡1只，第5天死亡1只，第6天死亡1只，存活率46%（6/13）。IL-3缺陷型小鼠手術(shù)后第3天死亡2只，第6天死亡1只，存活率76%（10/13）。經(jīng)Logrank test分析，IL-3缺陷型小鼠存活率高于野生型小鼠，膿毒性小鼠的生存率明顯提高（χ2=4.182，P= 0.040）。見圖2。

2.3阻斷IL-3對CLP小鼠行為、體溫和血壓的影響

小鼠CLP手術(shù)后0、12和24 h的臨床評分、體溫，并0和24h血壓結(jié)果中，IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后12和24 h的臨床評分分別為（5.41±3.95）和（6.63±3.56）分，與野生型小鼠的臨床評分[（18.44± 4.70）和（21.02±5.28）分]比較，分別降低70.88%和68.47%（t=6.005和6.392，P=0.000）；體溫分別為（35.77±3.60）和（36.18±1.79）℃，與野生型小鼠的體溫[（28.90±4.32）和（27.57±2.18）℃]比較，升高23.78%和 31.25%（t=3.455和 8.634，P=0.004和 0.000）。野生型小鼠和IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后0h的血壓分別為（95.58±2.84）和（95.81±5.12）mmHg；CLP手術(shù)后24h，IL-3缺陷型小鼠的血壓為（91.56± 6.06）mmHg，野生型小鼠血壓低于測量范圍。見圖3。

圖1　子代IL-3小鼠PCR鑒定結(jié)果

圖2　CLP術(shù)后兩組小鼠生存曲線

2.4阻斷IL-3對CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響

CLP手術(shù)后24 h，IL-3缺陷型小鼠支氣管肺泡灌洗液的總蛋白含量為（0.34±0.28）mg/ml，與野生型小鼠[（0.81±0.18）mg/ml]比較，下降57.82%（t= 3.990，P=0.001）；而CLP手術(shù)后0 h，IL-3缺陷型小鼠和野生型小鼠支氣管肺泡灌洗液的總蛋白含量分別為（0.32±0.06）和（0.28±0.13）mg/ml，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.720，P=0.483）。IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后24 h，血清中的AST和ALT分別為（1.66± 0.33）IU/ml和（18.86±5.77）IU/ml，比野生型小鼠AST[（2.28±0.62）UI/ml]和ALT[（32.02±15.82）IU/ml]降低27.15%和41.11%（t=2.490和2.211，P=0.026和0.044）；而CLP手術(shù)后0 h，IL-3缺陷型小鼠的AST[（0.61±0.39）IU/ml]和ALT[（9.34±4.80）IU/ml]與野生型的AST[（0.34±0.10）IU/ml]和ALT[（12.93± 4.58）IU/ml]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.931和1.529，P=0.074和0.149）。見表1。

表1　阻斷IL-3對CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響 （n=6±s）

表1　阻斷IL-3對CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響 （n=6±s）

注：1）與WT組比較，P<0.01；2）與WT組比較，P<0.05

組別肺泡灌洗液蛋白總量/（mg/ml）AST/（IU/ml）ALT/（IU/ml）24h WT組　0.28±0.13　0.81±0.18　0.34±0.10　2.28±0.62　12.93±4.58　32.02±15.81 IL-3-/-組　0.32±0.06　0.34±0.281）　0.61±0.39　1.66±0.332）　9.34±4.80　18.86±5.772）0h 24h 0h 24h 0h

HE染色表明，CLP手術(shù)后1d，野生型小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的間質(zhì)性肺炎病理學(xué)特征，肺泡壁增寬，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，嚴(yán)重的可見炎癥細(xì)胞浸潤和肺泡上皮細(xì)胞脫落，肺組織損傷嚴(yán)重；IL-3缺陷型小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細(xì)胞浸潤較少，肺組織損傷較輕。野生型小鼠的肝組織顏色變淺，發(fā)生水腫，肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞核裂解，溶解，細(xì)胞體積膨脹，細(xì)胞膜不完整，肝組織損傷嚴(yán)重；IL-3缺陷型小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞較完整。見圖4。

2.5阻斷IL-3對CLP小鼠炎癥細(xì)胞的影響

為檢測IL-3對組織和血液中炎癥細(xì)胞的影響，小鼠CLP手術(shù)后0、6、12和24 h采血并在24 h安樂死取肺和肝組織，測定血液中的炎癥細(xì)胞，并行肺以及肝組織的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果表明，CLP手術(shù)后24 h，IL-3缺陷型小鼠血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分別為（7.23±3.79）×105/ml和（0.60± 0.28）×105/ml，與野生型小鼠[（13.22±6.86）×105/ml和（1.37±0.65）×105/ml]比較，分別降低1.83和2.29倍（t=3.213和3.063，P=0.015和0.008）。此外，野生型小鼠的單核細(xì)胞在CLP手術(shù)后0和24 h分別（0.52±0.42）×105/ml和（1.37±0.65）×105/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.072，P=0.008）。見表2。

圖3　阻斷IL-3對CLP小鼠行為、體溫和血壓的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，小鼠CLP手術(shù)后24 h后，野生型小鼠肺和肝組織存在大量的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，肺組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為（5.25±1.79）×106和（1.80±0.87）× 106；肝組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為（1.23± 0.36）×106和（5.44±4.56）×107；而IL-3缺陷型小鼠肺組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為（3.44± 0.99）×106和（1.03±1.00）×106；肝組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為（0.56±0.32）×106和（1.59± 1.63）×107，兩組比較IL-3缺陷型小鼠中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量減少（t=2.493、2.594、3.940和2.253，P=0.026、0.021、0.002和0.041）。見表3和圖5～7。

2.6阻斷IL-3對CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

ELISA檢測結(jié)果表明，野生型小鼠組中，IL-1β、IL-6和 IFN-α 分別為（412.84±243.23）pg/ml、（37.94±24.49）ng/ml和（139.71±114.18）pg/ml。IL-3缺陷型小鼠組中，IL-1β、IL-6和IFN-α分別為（22.61±6.68）pg/ml、（7.22±5.00）ng/ml和（23.17± 26.95）pg/ml，與野生型小鼠組比較，分別下降95%、81%和83%（t=4.536、3.475和2.810，P=0.001、0.004 和0.014）。見表4和圖8。

圖4　阻斷IL-3對CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響

圖5　阻斷IL-3對CLP小鼠肺組織炎癥細(xì)胞的影響

表2　兩組CLP術(shù)后血液中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞比較 （n=6，×105/ml±s）

表2　兩組CLP術(shù)后血液中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞比較 （n=6，×105/ml±s）

注：1）與WT組比較，P<0.05；2）與WT組比較，P<0.01

組別0h 6h 12h 24h WT組中性粒細(xì)胞　5.62±2.55　8.93±5.58　6.30±3.52　13.22±6.86單核細(xì)胞0.52±0.42 0.49±0.23 0.75±0.42 1.37±0.65 IL-3-/-組中性粒細(xì)胞　6.45±2.74　12.17±3.38　8.93±5.71　7.23±3.791）單核細(xì)胞　0.64±0.42　0.49±0.32　0.46±0.46　0.60±0.282）

表3　兩組CLP術(shù)后24 h肺及肝組織炎癥細(xì)胞比較 （n=6，×106±s）

表3　兩組CLP術(shù)后24 h肺及肝組織炎癥細(xì)胞比較 （n=6，×106±s）

注：1）與WT組比較，P<0.05；2）與WT組比較，P<0.01

組別肺組織肝組織中性粒細(xì)胞WT組　5.25±1.79　1.80±0.87　1.23±0.36　54.44±45.58 IL-3-/-組　3.44±0.991）　1.03±1.001）　0.56±0.322）　15.88±16.321）單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞

圖6　阻斷IL-3對CLP小鼠肝組織炎癥細(xì)胞的影響

圖7　阻斷IL-3對CLP小鼠血液中炎癥細(xì)胞的影響

圖8　阻斷IL-3對CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

表4　兩組CLP后24 h血清炎癥細(xì)胞因子含量比較（n=6±s）

表4　兩組CLP后24 h血清炎癥細(xì)胞因子含量比較（n=6±s）

注：1）與WT組比較，P<0.001；2）與WT組比較，P<0.01；3）與WT組比較，P<0.05

組別TNF-α/（pg/ml）WT組　412.84±243.23　37.94±24.49　139.71±114.18 IL-3-/-組　22.61±6.681）　7.22±5.002）　23.17±26.953）IL-1β/（pg/ml）IL-6/（ng/ml）

3　討論

膿毒血癥是由感染引起的，具有免疫與炎癥反應(yīng)的高發(fā)病率和死亡率疾病。炎癥反應(yīng)往往伴隨著炎癥細(xì)胞的激活和多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。許多研究表明，膿毒血癥與大量的炎癥細(xì)胞因子（IFN-α、IL-1和IL-6）產(chǎn)生有關(guān)。這些炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生似乎代表著不受控制的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。據(jù)研究報道，給予這些炎癥細(xì)胞因子可以模仿產(chǎn)生許多膿毒性休克癥狀，包括不良的心血管反應(yīng)[8，11]。給予抗細(xì)胞因子，如IFN-α抗體能夠提高嚴(yán)重膿毒性休克動物和人的成活率[12-13]。本研究表明，IL-3缺陷型小鼠組CLP手術(shù)后小鼠的存活率和臨床癥狀表現(xiàn)出明顯的改善，提示IL-3參與膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制。WEBER等[14]研究發(fā)現(xiàn)，給予健康的野生型小鼠IL-3，可以使其炎癥細(xì)胞數(shù)增加,等同野生型CLP小鼠。相反，給予IL-3受體拮抗劑（Anti-CD123）能夠減少野生型CLP小鼠的炎癥細(xì)胞數(shù)并提高其生存率。研究報告表明，膿毒血癥患者中的IL-3濃度很高，并伴有高死亡風(fēng)險[15]。這些研究表明IL-3通過與其受體結(jié)合，可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生，提高膿毒性小鼠的成活率。

本研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，敲除IL-3能夠降低小鼠肺和肝組織中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及血液中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IFN-α的表達(dá)水平。這提示當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染，IL-3會促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及免疫細(xì)胞等產(chǎn)生，而這些細(xì)胞會釋放出大量的炎癥細(xì)胞因子。膿毒血癥是免疫系統(tǒng)對感染或組織損傷發(fā)生的一種過度反應(yīng)，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，導(dǎo)致大量的免疫細(xì)胞募集。這些細(xì)胞又會釋放出更多的細(xì)胞因子，從而又招募更多的免疫細(xì)胞，形成一個惡性循環(huán)。這些細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞并不會阻止初始的感染，而是攻擊機(jī)體的組織和器官，導(dǎo)致器官衰竭和死亡。RAUCH等[16]研究表明，IL-3由脾臟、胸腺和淋巴結(jié)中的B細(xì)胞產(chǎn)生，IL-3能導(dǎo)致多種白細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖，從而釋放出大量的細(xì)胞因子（被稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴）。另有研究顯示，CLP術(shù)后，小鼠產(chǎn)生IL-3的T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)不同，但嗜堿性細(xì)胞與肥大細(xì)胞數(shù)相差不大，這表明IL-3在炎癥初期對嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞的產(chǎn)生及功能沒有影響[17-19]。本研究也表明，CLP術(shù)后野生型小鼠的肺和肝組織積累著比IL-3缺陷型小鼠更多的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，并且支氣管灌洗液中的蛋白也明顯增多。這說明IL-3促進(jìn)膿毒血癥中的炎癥反應(yīng)。ANNANE[20]和WARD 等[21]報道，IL-3還會導(dǎo)致膿毒血癥中的膿毒性休克。

綜上可知，IL-3可以通過增強(qiáng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)膿毒血癥的發(fā)生，而阻斷IL-3能夠減輕炎癥反應(yīng)，改善膿毒血癥的成活率，這為IL-3成為臨床上治療膿毒血癥的靶點提供研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]RITTIRSCH D,HOESEL L M,WARD P A.The disconnect between animal models of sepsis and human sepsis[J].J Leukoc Biol, 2007,81(1):137-143.

[2]DEITCH E A.Rodent models of intra-abdominal infection[J]. Shock,2005,24(1):19-23.

[3]DYSON A,SINGER M.Animal models of sepsis:why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting[J].Crit Care Med,2009,37(1):30-37.

[4]BURAS J A,HOLZMANN B,SITKOVSKY M.Animal models of sepsis:setting the stage[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(10): 854-865.

[5]ANGUS D C,POLL T.Severe sepsis and septic shock[J].N Engl J Med,2013,369(21):2063.

[6]HOTCHKISS R S,MONNERET G,PAYEN D.Sepsis-induced immunosuppression:from cellular dysfunctions to immunotherapy [J].Nat Rev Immunol,2013,13(12):862-874.

[7]DEUTSCHMAN C S,TRACEY K J.Sepsis:current dogma and new perspectives[J].Immunity,2014,40(4):463-475.

[8]CASEY L C,BALK R A,BONE R C.Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome[J].Ann Intern Med,1993,119(8):771-778.

[9]高戎,徐建如,李仁奇,等.人參皂苷Rg5對膿毒血癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(11):2062-2064.

[10]RITTIRSCH D,HUBER-LANG M S,FLIERL M A,et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc,2009,4(1):31-36.

[11]TAKAO K,MIYAKAWA T.Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases[J].Proc Natl A-cad Sci USA,2015,112(4):1167-1172.

[12]ABRAHAM E,WUNDERINK R,SILVERMAN H,et al.Effi-cacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome.A randomized, controlled,double-blind,multicenter clinical trial[J].TNF-alpha MAb Sepsis Study Group JAMA,1995,273(12):934-941.

[13]BOSMANN M,WARD PA.The inflammatory response in sepsis[J]. Trends Immunol,2013,34(3):129-136.

[14]WEBER G F,CHOUSTERMAN B G,HE S,et al.Nterleukin-3 amplifies acute inflammation and is a potential therapeutic target in sepsis[J].Science,2015,347(6227):1260-1265.

[15]WEBER G F,CHOUSTERMAN B G,HE S,et al.Inflammatory factor IL-3 may play essential role in development of sepsis[J]. Science,March 2015.DOI:10.1126/science.aaa4268

[16]RAUCH P J,CHUDNOVSKIY A,ROBBINS C S,et al.Innate response activator B cells protect against microbial sepsis[J]. Science,2012,335(6068):597-601.

[17]JAMUR MC,OLIVER C.Origin,maturation and recruitment of mast cell precursors[J].Front Biosci,2011,3:1390-1406.

[18]VOEHRINGER D.Basophil modulation by cytokine instruction[J]. Eur J Immunol,2012,42(10):2544-2550.

[19]RONNBERG E,JOHNZON C F,CALOUNOVA G,et al.Mast cells are activated by staphylococcus aureus in vitro but do not influence the outcome of intraperitoneal S[J].Aureus Infection In Vivo Immunology,2014,143(2):155-163.

[20]ANNANE D,BELLISSANT E,CAVAILLON J M.Septic shock[J]. Lancet,2005,365(9453):63-78.

[21]WARD P A.New approaches to the study of sepsis[J].EMBO Mol Med,2012,4(12):1234-1243.

（申海菊編輯）

中圖分類號：R 459.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.006

文章編號：1005-8982（2016）13-0028-09

收稿日期：2015-12-02

Blockade of IL-3 ameliorates sepsis-induced inflammation in mice

Bai-ye Xu1,Jing Zhang2,Qing-hai Wang1,Shi-shan Liang1,Zhen Chen1,Hai-dao Wang1
（1.Department of Pediatrics，Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou，F(xiàn)ujian 362000，China；2.Quanzhou Medical College，Quanzhou，F(xiàn)ujian 362000，China）

Abstract:Objective To investigate the effect of blockade of IL-3 on sepsis-induced inflammation in mice and explore its underlying mechanism.Methods Mice in WT group（n=13）and IL-3-/-group（n=13）were observed and mortality was recorded up to 7 days after cecal ligation and puncture（CLP）.In addition，more mice were randomly assigned to WT group（n=20）and IL-3-/-group（n=20）after CLP，each group was divided into 3 subgroups for study.In the first subgroup，clinical score assessment and body temperature measurement were conducted at 0，12 and 24 h after CLP；blood pressure was measured and blood was collected to determine the levels of IFN-α，IL-1β and IL-6 by ELISA at 24 h after CLP.In the second subgroup，blood was collected to determine the total number of neutrophils and monocytes at 0，6，12 and 24 h after CLP，and lungs and liver were harvested for histopathological analysis at 24 h after CLP.In the third subgroup，blood and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were collected to determine total protein content and enzyme activity（AST and ALT）at 0 h，24 h after CLP.Results The survival，body temperature and blood pressure of septic mice in the IL-3-/-group were significantly improved after CLP compared with mice in the WT group（P＜0.05）.The clinical score of the septic mice in the IL-3-/-group significantly decreased compared with the WT group（P＜0.05）.In addition，the levels of IL-2 and IFN-γ in the IL-3-/-group significantly decreased compared with the WT group（P＜0.05）.The total number of neutrophils and monocytes inthe lung and liver tissues of the IL-3-/-group significantly decreased，and the total protein content of BALF and enzyme activity of serum AST and ALT also significantly decreased in the IL-3-/-group compared with the WT group（P＜0.05）.Conclusions Blockade of IL-3 can improve survival of septic mice through alleviation of sepsis-induced inflammation.

Keywords:sepsis；cecal ligation and puncture；neutrophil；monocyte；blood and bronchoalveolar lavage fluid；interferon-α