洪蘭，洪英姬，金紅花

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研部，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 延吉 133000）

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論著

糖原合成酶激酶3β介導(dǎo)心房鈉尿肽對H9c2心肌細(xì)胞線粒體保護(hù)作用的研究*

洪蘭1，洪英姬1，金紅花2

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研部，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 延吉 133000）

摘要：目的探討心房鈉尿肽（ANP）對H9c2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法采用四甲基羅丹明乙酯（TMR E）熒光染料和激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)測定H9c2心肌細(xì)胞TMR E熒光強(qiáng)度的變化，即線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放程度。利用雙氧水H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞線粒體mPTP的開放，預(yù)處理不同濃度的ANP后，觀察ANP對mPTP開放的影響；同時(shí)利用Western blot檢測H9c2心肌細(xì)胞的糖原合成酶激酶3β（GSK-3β Ser9）磷酸化程度，即失活程度。利用激活型GSK-3β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H9c2心肌細(xì)胞（GSK-3β-S9A-HA），來觀察ANP對GSK-3β-S9A-HA的線粒體mPTP開放程度。結(jié)果與對照組（600μmol/L H2O2）比較，0.01、0.10、1.00和10.00nmol/L ANP明顯抑制H2O2對TMR E熒光強(qiáng)度的衰減效應(yīng)（P<0.05），其中1.00 nmol/L的ANP效應(yīng)最強(qiáng)。Western blot檢測結(jié)果顯示，0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L ANP明顯增強(qiáng)GSK-3β Ser9的磷酸化（P<0.05），即抑制GSK-3β的活性。利用GSK-3β-S9A-HA后發(fā)現(xiàn)，ANP（1.0nmol/L）不能抑制mPTP開放（與H9c2比較P<0.05）。結(jié)論ANP通過調(diào)節(jié)GSK-3β活性來抑制H9c2心肌細(xì)胞mPTP的開放，從而保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞：心房鈉尿肽；缺血再灌注；線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔；糖原合成酶激酶3β

心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）是由心房肌細(xì)胞合成和分泌的肽類激素。ANP對缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用。在大鼠離體心臟灌流模型中，ANP可以增加再灌注心臟的心輸出量，減少缺血再灌注心臟的心梗面積，對急性心肌梗死患者靜脈注射ANP能減輕缺血再灌注造成的心臟損傷[1]，但ANP發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未清楚。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素[2]，防止mPTP的開放是減輕再灌注損傷的有效手段，抑制mPTP的開放是一些心臟保護(hù)類藥物，如腺苷，抗缺血再灌注損傷的共同作用機(jī)制。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase 3β，GSK-3β）是真核生物中普遍存在的一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，靜息時(shí)GSK-3β保持激活狀態(tài)。GSK-3β的絲氨酸（Serine，Ser9）位點(diǎn)磷酸化使GSK-3β活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK-3β的活性可以有效抑制mPTP的開放[3]。但是，ANP保護(hù)缺血再灌注損傷機(jī)制與GSK-3β活性和mPTP的開放是否有關(guān)，尚不清楚。本研究采用激光共聚焦顯微成像技術(shù)和Western blot檢測，觀察ANP是否通過降低GSK-3β的活性而抑制mPTP的開放，起到抵制缺血再灌注損傷的作用，擬探討ANP的心肌保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細(xì)胞株（美國ATCC菌種收藏中心），ANP、細(xì)胞培養(yǎng)所用的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶等（美國Gibco公司），GSK-3β-S9A-HA（美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院），四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethylester，TMRE）熒光染料（美國Invitrogen公司），Western blot檢測凝膠試劑盒（北京索萊寶 公 司），抗 磷酸化的 GSK-3α/β（Phospho-GSK-3α/β，Ser21-GSK-3α/Ser9-GSK-3β）抗體以及α-actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

實(shí)驗(yàn)中主要儀器有FV-1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olmpus公司），JY200C電泳系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Red公司），ChampGel 6000凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），5430R臺式低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2線粒體膜電位的測定及實(shí)驗(yàn)分組

TMRE熒光探針是一種帶正電荷、可透過細(xì)胞膜的無毒性熒光染料，其激發(fā)光波長為543 nm，發(fā)射波長為560 nm。在正常生理?xiàng)l件下，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）保持內(nèi)負(fù)外正的狀態(tài)。由于該電壓差使正電的TMRE可迅速地進(jìn)入并聚集在線粒體內(nèi)。mPTP的開放使得氫離子等進(jìn)入細(xì)胞，造成MMP消失，MMP降低是mPTP開放的象征，從而導(dǎo)致TMRE從線粒體釋放。所以線粒體內(nèi)TMRE熒光強(qiáng)度變化能較為準(zhǔn)確地顯示MMP的高低和mPTP的開放。故利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)檢測線粒體內(nèi)TMRE熒光強(qiáng)度值的變化值，可推測線粒體膜電位的變化，從而可以測定線粒體mPTP的開放。本實(shí)驗(yàn)利用雙氧水H2O2誘導(dǎo)H9c2的缺血再灌注損傷，TMRE熒光強(qiáng)度減少至<50%基礎(chǔ)值則認(rèn)為誘導(dǎo)缺血再灌注損傷成功。

H9c2分成7組，用H2O2（終濃度600μmol/L）在37℃孵育箱內(nèi)孵育20 min，誘導(dǎo)H9c2氧化應(yīng)激損傷。H9c2分成兩組，對照組：H2O20min+H2O220min；ANP組：ANP（終濃度 0.001、0.010、0.100、1.000、10.000和100.000nmol/L）20min+H2O220min。各組以每10 min間隔掃描圖片，并用定量分析軟件測定熒光強(qiáng)度值。

1.3GSK-3β質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

GSK-3β質(zhì)粒（GSK-3β-S9A-HA）采用Fugene6轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所有實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48 h內(nèi)進(jìn)行[5]。對照組：H2O 20min+H2O2（終濃度600μmol/L）20 min；ANP組：ANP（終濃度1 nmol/L）20 min+H2O220min；S9A組：轉(zhuǎn)染激活型GSK-3β質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞+H2O 20 min+H2O2（終濃度600μmol/L）20 min；S9A/ANP組：轉(zhuǎn)染激活型GSK-3β質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞+ANP（終濃度1 nmol/L）20 min+H2O220 min。各組以每10 min間隔掃描圖片，并用定量分析軟件測定熒光強(qiáng)度值。

1.4Western blot檢測GSK-3β磷酸化水平

采用終濃度為0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 和100.000 nmol/L ANP預(yù)處理H9c2細(xì)胞20 min，常規(guī)Western blot檢測GSK-3β Ser9位點(diǎn)的磷酸化，從而觀察GSK-3β的活性。其最終數(shù)據(jù)表示為（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）/（對照組蛋白/對照組內(nèi)參蛋白）×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ANP對線粒體mPTP開放的影響

對照組利用600μmol/L H2O2處理H9c2細(xì)胞20 min后，TMRE熒光強(qiáng)度明顯減少至基礎(chǔ)值的（36.75±3.87）%，即H2O2可以明顯誘導(dǎo)缺血再灌注損傷。不同濃度的ANP預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞20min后發(fā)現(xiàn)，0.01、0.10、1.00和10.00nmol/L ANP均抑制H2O2減少TMRE熒光強(qiáng)度的效應(yīng)（P<0.05），而濃度0.001nmol/L和最高濃度100.000nmol/L ANP未能抵制H2O2對MMP的衰減作用。ANP防止mPTP開放的有效濃度范圍為0.01～10.00 nmol/L。見表1和圖1。

表1　不同濃度的ANP對TMRE熒光強(qiáng)度的影響（n=6±s）

表1　不同濃度的ANP對TMRE熒光強(qiáng)度的影響（n=6±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與對照組比較，P<0.01 ANP（/nmol/L）

20min對照組　100.0±0.0　36.8±3.9 ANP（0.001nmol/L）　100.0±0.0　51.8±9.0 ANP（0.010nmol/L）　100.0±0.0　52.0±2.41）ANP（0.100nmol/L）　100.0±0.0　75.1±1.02）ANP（1.000nmol/L）　100.0±0.0　78.5±11.02）ANP（10.000nmol/L）　100.0±0.0　75.9±14.51）ANP（1000.000nmol/L）　100.0±0.0　50.4±14.3 F值P值組別0min 2.820 0.023

圖1　不同濃度ANP預(yù)處理后各組TMRE熒光強(qiáng)度比較 （×120）

2.2ANP對GSK-3β活性的影響

0.01～100.00nmol/L ANP均明顯增加GSK-3β Ser9的磷酸化水平，即可以明顯抑制GSK-3β的活性，其中1.0 nmol/L ANP效果最明顯，只有最低濃度ANP（0.001 nmol/L）對GSK-3β磷酸化沒有影響。該有效濃度范圍與ANP對mPTP抑制作用的有效濃度范圍基本一致。見圖2和表2。

2.3ANP對轉(zhuǎn)染GSK-3β質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞mPTP開放的影響

對照組、ANP組、S9A組、S9A/ANP組經(jīng)20 min H2O2處理后，各組TMRE熒光強(qiáng)度分別減少至基礎(chǔ)值的（36.75±3.87）%、（78.47±11.00）%、（35.32± 5.49）%和（39.95±4.51）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 8.830，P=0.000），ANP組TMRE熒光強(qiáng)度高于對照組、S9A組及S9A/ANP組（t=3.576、3.520和3.247，P=0.003、0.003和0.006）。而S9AANP組的TMRE熒光強(qiáng)度與S9A對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見圖3。

圖2　不同濃度ANP對GSK-3β磷酸化的影響

圖3　各組TMRE熒光強(qiáng)度比較 （×120）

表2　ANP對GSK-3β磷酸化的影響 （n=6±s）

表2　ANP對GSK-3β磷酸化的影響 （n=6±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與對照組比較，P=0.000

Phosphor-GSK-3β對照組　100.00±0.00 ANP（0.001nmol/L）　124.80±15.26 ANP（0.010nmol/L）　146.40±15.021）ANP（0.100nmol/L）　188.60±19.482）ANP（1.000nmol/L）　225.60±21.042）ANP（100.000nmol/L）　184.10±20.311）ANP（1000.000nmol/L）　151.10±20.701）F值P值組別6.886 0.000

3　討論

心肌缺血再灌注損傷是治療缺血性心臟病過程中面臨的最棘手的醫(yī)學(xué)問題[6]。雖然介入和搭橋手術(shù)等目前先進(jìn)的醫(yī)療手段能夠改善缺血帶來的損傷，但由于冠狀動(dòng)脈再通后容易引起再灌注損傷，急性心肌梗死的治療難度和死亡率依然很高。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，再灌注期給予幾種藥物，如腺苷，可以改善缺血再灌注損傷，但臨床試驗(yàn)結(jié)果均不理想[7]，究其原因是還未完全了解保護(hù)再灌注損傷的作用機(jī)制[8]。研究認(rèn)為，心肌缺血再灌注時(shí)，mPTP持續(xù)性開放是導(dǎo)致再灌注損傷的重要原因[2]，因此抑制mPTP的開放是防止再灌注損傷的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先反復(fù)短暫缺血（缺血預(yù)處理）可以提高心肌組織對隨后持續(xù)缺血的耐受性，減少心肌梗死面積，減少心律失常發(fā)生，而缺血預(yù)處理保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制就是通過抑制mPTP的開放而減輕再灌注損傷[9]。

ANP最早發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)作用是排鈉利尿，而近年來的研究證實(shí)，ANP在許多缺血缺氧相關(guān)性疾病如急性心肌梗死、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病中保持高分泌狀態(tài)，并且在該類疾病中分泌的ANP可以發(fā)揮抵制心肌肥大[10]、氧化應(yīng)激[11]、保護(hù)缺血再灌注損傷等作用[12]。在本研究中，0.01、0.10、1.00、10.00 nmol/L ANP可以明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞mPTP開放，提示ANP可能通過抑制線粒體mPTP的開放，抵制氧化應(yīng)激傷的損傷，進(jìn)而保護(hù)缺血再灌注的心臟。本實(shí)驗(yàn)室長期對大鼠ANP濃度測定結(jié)果顯示，大鼠心房灌流液的ANP濃度一般在50～300 pg/ml，而本實(shí)驗(yàn)所用的ANP濃度已經(jīng)超出大鼠灌流液當(dāng)中的ANP生理濃度。本實(shí)驗(yàn)室前期研究還顯示，大鼠心房缺氧時(shí)ANP濃度明顯升高，并且升高至常氧時(shí)的5～10倍。故根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測，缺氧缺血時(shí)增高的ANP可能起到抵制缺氧缺血等的生理學(xué)作用，從而保護(hù)缺氧缺血的心臟。

防止mPTP開放可以有效抵制心肌缺血再灌注損傷。而在抑制mPTP開放的具體信號機(jī)制中，目前普遍認(rèn)為GSK-3β發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理能夠增加GSK-3β的磷酸化，而抑制GSK-3β的活性能模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用[13]，提示GSK-3β在心肌保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。JUHASZOVA等[14]認(rèn)為，抑制GSK-3β的活性對阻止mPTP的開放可能發(fā)揮重要作用。在心肌細(xì)胞中，一些心臟保護(hù)類物質(zhì)如腺苷[3]、酒精[15]和外源性鋅[16]均通過抑制GSK-3β的活性而阻止mPTP的開放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANP能夠增加GSK-3βSer9的磷酸化，表明ANP能明顯抑制GSK-3β的活性，并且有效濃度和最高效應(yīng)濃度與ANP抑制mPTP開放的濃度值相吻合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，利用GSK-3β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞（GSK-3β-S9A）觀察發(fā)現(xiàn)，ANP未能抵制H2O2誘導(dǎo)GSK-3β-S9A的mPTP開放效應(yīng)，說明ANP通過抑制GSK-3β的活性，從而抵制線粒體mPTP開放。綜上所述，ANP具有保護(hù)缺血再灌注損傷作用，其作用機(jī)制是通過抑制增加GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β的活性，從而防止mPTP開放，最終起到心肌保護(hù)作用。

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（童穎丹編輯）

中圖分類號：R 542.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.002

文章編號：1005-8982（2016）13-0007-05

收稿日期：2015-12-21

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（No：81260035）；吉林省衛(wèi)生廳科研課題基金（No：2013300-612013111）

[通信作者]金紅花，E-mail：kimflower1988@163.com；Tel：0433-2660788

Protective mechanism of ANP on mitochondria of H9c2 myocardial cells via GSK-3β*

Lan Hong1,Ying-ji Hong1,Hong-hua Jin2
（1.Department of Physiology and Pathophysiology，Medical College of Yanbian University，Yanbian，Jilin 133002，China；2.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanbian，Jilin 133000，China）

Abstract:Objective To investigate protective mechanism of atrial natriuretic peptide（ANP）on H9c2 myocardial cell mitochondria via glycogen synthase kinase 3β（GSK-3β）.Methods The change of mitochondrial membrane potential was determined using fluorescent dye tetramethylrhodamine ester（TMRE）and laser confocal microscopy imaging technique.The open degree of mitochondrial permeability transition pore（mPTP）was reflected as TMRE fluorescence intensity and the GSK-3β Ser9 phosphorylation（deactivation degree）was detected by Western blot.Then the protective effect of ANP on H9c2 cells transfected with activated GSK-3β plasmid （GSK-3β-S9A-HA）was observed.Results Compared to the control group（600 μmol/L H2O2），0.01，0.10，1.00 and 10.00 nmol/L ANP significantly inhibited attenuation effect of TMRE fluorescence intensity induced by H2O2（P ＜0.05）；of which 1.00 nmol/L ANP had the strongest effect.It suggested that ANP may modulate the mPTP opening.Western blot result showed that 0.01，0.10，1.00，10.00 and 100.00 nmol/L ANP significantlyincreased the level of phosphorylation of GSK-3β（P＜0.05）；which indicated that ANP could inhibit the activity of GSK-3β；however，1.00 nmol/L ANP was not able to inhibit mPTP opening in cells of GSK-3β-S9AHA.Conclusions ANP prevents the mPTP opening by inactivating GSK-3β so as to protect H9c2 myocardial cells during ischemia-reperfusion injury.

Keywords:atrial natriuretic peptide；ischemia-reperfusion injury；mitochondrial permeability transition pore；glycogen synthase kinase 3β