王　晴,李和權(quán),周建英

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州　310003)

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小鼠平滑肌祖細(xì)胞培養(yǎng)及其體內(nèi)外遷移功能的研究

王晴,李和權(quán),周建英

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州310003)

目的建立一種有效的小鼠平滑肌祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并對其遷移功能進(jìn)行研究。方法使用C57BL/6小鼠制備密質(zhì)骨來源間充干細(xì)胞，PDGF-BB誘導(dǎo)其分化并采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及流式分析的方法進(jìn)行鑒定。使用Transwell小室及流式分析方法檢測其遷移能力。結(jié)果PDGF-BB誘導(dǎo)7 d后，鏡下可見細(xì)胞呈長梭型，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示開始表達(dá)α-SMA。誘導(dǎo)21 d后，流式分析證實(shí)70%以上的細(xì)胞表達(dá)CD34+/α-SMA+雙陽性，58.5%細(xì)胞開始表達(dá)SM-MHC。遷移實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)得到的平滑肌祖細(xì)胞在體內(nèi)外均具有良好的遷移能力。結(jié)論通過使用密質(zhì)骨來源間充干細(xì)胞制備平滑肌祖細(xì)胞具有操作簡便、獲取率高及培養(yǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，培養(yǎng)得到的平滑肌祖細(xì)胞在體內(nèi)外均具有遷移能力，適于進(jìn)行后續(xù)功能及機(jī)制研究。

平滑肌祖細(xì)胞；間充干細(xì)胞；培養(yǎng)；遷移；平滑肌肌動(dòng)蛋白；PDGF-BB

血管重塑主要包括血管新生及血管平滑肌層病理性增厚，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、移植血管病等眾多血管增殖性疾病發(fā)病的重要因素，探索新生及增生平滑肌細(xì)胞的來源和重塑機(jī)制，尋找其干預(yù)的靶點(diǎn)一直是學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)問題[1-4]。近來，隨著平滑肌祖細(xì)胞在外周血中的發(fā)現(xiàn)，增多的平滑肌細(xì)胞可能部分來源于骨髓的觀點(diǎn)越來越受到人們的重視。研究表明，平滑肌祖細(xì)胞能夠從外周血遷移至局部器官并進(jìn)一步分化成平滑肌細(xì)胞，是導(dǎo)致血管重塑的一個(gè)重要原因[3-4]。新證據(jù)顯示，平滑肌祖細(xì)胞的這一遷移運(yùn)動(dòng)不僅在血管平滑肌重塑中有著重要的作用，也可能參與了氣道平滑肌重塑的過程。Makowska等[5]的研究表明，哮喘患者的外周血中CD34+祖細(xì)胞含量升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。而Wu等[6]的研究則進(jìn)一步顯示能夠表達(dá)平滑肌特異性標(biāo)志物——平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)的祖細(xì)胞在哮喘模型小鼠外周血中含量增高。鑒于平滑肌祖細(xì)胞在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，如何在體外制備平滑肌祖細(xì)胞以進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探索研究也成為眾多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。本文報(bào)道一種簡單有效的小鼠平滑肌祖細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，并對其遷移功能進(jìn)行探索分析。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ C57BL/6小鼠，4～6周齡，清潔級，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、免疫組化用小鼠平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、anti-FITC-α-SMA流式抗體、卵白蛋白(OVA)、PKp6細(xì)胞染色試劑盒購自Sigma公司。血小板源性生長因子(PDGF-BB)、纖連蛋白購自Invitrogen公司。兔II抗和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。anti-PE-CD34流式抗體購自Biolegend公司，anti-PE-SM-MHC流式抗體購自Santa Cruz公司，anti-FITC-SM-MHC購自biorbyt公司。小鼠重組肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)蛋白購自Prospec公司。小鼠間充干細(xì)胞(MSC)專用培養(yǎng)基及低氧培養(yǎng)箱購自Stem cell公司。

1.3哮喘模型小鼠外周血平滑肌祖細(xì)胞檢測

1.3.1哮喘模型制備[7]全部小鼠在d 0和d 12腹腔注射100 g·L-1硫酸鋁鉀與25 μg OVA混懸液0.1 mL致敏。實(shí)驗(yàn)組小鼠自d 18～d 23予質(zhì)量濃度為50 g·L-1的OVA行霧化攻擊，30 min·d-1，連續(xù)霧化6 d，d 24處死部分小鼠，為急性哮喘模型。自d 26起，予50 g·L-1OVA霧化攻擊，30 min/次，3次/周。d 35及d 55分別處死部分小鼠，為哮喘氣道重塑模型。對照組在霧化階段用PBS代替OVA，余處理均同實(shí)驗(yàn)組。

1.3.2外周血中平滑肌祖細(xì)胞流式檢測小鼠眼球取血制備單細(xì)胞懸液，破紅后行anti-PE-CD34表面染色，避光孵育30min后，PBS洗滌并固定破膜，行anti-FITC-SM-MHC胞內(nèi)染色，避光孵育30min后，PBS洗滌去除未結(jié)合抗體。離心后重懸細(xì)胞于流式PBS中，上機(jī)檢測。

1.4平滑肌祖細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

1.4.1密質(zhì)骨來源間充干細(xì)胞(MSC)培養(yǎng)[8]小鼠麻醉處死后取后腿脛骨及股骨，將骨表面肌肉分離干凈后置入研缽中，輕刮骨表面去除肌肉組織及骨骺端，于研缽中碾磨并壓碎骨組織，讓骨髓流出并棄去。此步驟重復(fù)多次直至骨髓基本被去除干凈，骨質(zhì)顏色轉(zhuǎn)白。將骨骼碎片繼續(xù)切碎成1～2 mm的碎片，于含2.5 g·L-1Ⅰ型膠原酶的PBS液中水浴孵育(37℃, 40 min)，棄去沉渣后細(xì)胞濾器過濾并離心(500×g，10 min)。取沉淀細(xì)胞培養(yǎng)于小鼠MSC專用培養(yǎng)基，并置于低氧培養(yǎng)箱中37℃，5% CO2培養(yǎng)。每2 d換液1次，直至90%融合。

1.4.2平滑肌祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化使用培養(yǎng)基稀釋纖連蛋白至20 μg·L-1包被6孔細(xì)胞板。取生長良好，90%融合的MSC消化后重新培養(yǎng)于纖連蛋白包被的6孔板中。培養(yǎng)基中添加PDGF-BB 蛋白(50 μg·L-1)誘導(dǎo)MSC分化[9]。每2 d換液1次，每周傳代2次。

1.4.3形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。

1.4.4α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色分別以多聚甲醛固定細(xì)胞(4℃，15 min)，2 g·L-1Triton X-100穿膜15 min，羊血清封閉10 min，加入α-SMA小鼠I抗(1 ∶100)，37℃孵育2 h，再加入兔抗小鼠IgG Ⅱ抗，37℃孵育1 h，隨后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.4.5流式分析鑒定平滑肌祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后的d 7、d 14及d 21，選取狀態(tài)較好的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后收集于Epidoff管中并多次洗滌，然后將細(xì)胞重懸于流式PBS中，使用anti-PE-CD34抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，anti-FITC-α-SMA抗體及anti-PE-SM-MHC抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，避光室溫孵育30 min。孵育結(jié)束后，再次使用PBS液洗滌，去除未結(jié)合的抗體。離心后重懸細(xì)胞于流式PBS中，上機(jī)檢測。

1.5平滑肌祖細(xì)胞功能檢測

1.5.1體外遷移實(shí)驗(yàn)[10]胰酶消化平滑肌祖細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以3×108·L-1濃度重懸于含BSA(濃度為1 g·L-1)的DMEM:F12培養(yǎng)基中制備細(xì)胞懸液。遷移小室置于24孔板中，每個(gè)小室中加入100 μL細(xì)胞懸液。下室中加入不含血清的DMEM:F12培養(yǎng)基，并添加小鼠重組HB-EGF蛋白(20 μg·L-1)進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。24孔板置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h后取出。遷移小室經(jīng)甲醇固定，1 g·L-1結(jié)晶紫染料染色20 min及PBS洗滌后，棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。每個(gè)遷移小室均取中心及四周，共5個(gè)固定位置視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，定量遷移細(xì)胞數(shù)。

1.5.2體內(nèi)遷移實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1平滑肌祖細(xì)胞標(biāo)記及注射胰酶消化平滑肌祖細(xì)胞并收集制成細(xì)胞懸液，與PKp6染液混合后避光室溫孵育30 min后，加入15～20 mL含F(xiàn)BS(濃度為10 g·L-1)的PBS終止染色并洗滌3次。最后1次洗滌后使用PBS液重懸PKp6標(biāo)記的平滑肌組細(xì)胞(5×109·L-1)。1 mL無菌注射器抽取適量，于霧化周期中的d 19及d 22，以每鼠0.4 mL的劑量注入小鼠尾靜脈。

1.5.2.2流式分析取哮喘模型小鼠的氣管組織充分剪碎后使用0.2 g·L-1Ⅳ型膠原酶孵育(37℃, 30 min)。孵育結(jié)束后，將組織置于200目濾網(wǎng)上充分碾磨，并不斷沖洗。沖洗3次后收集所有濾過液體離心，使用70 μm過濾器過濾雜質(zhì)后得到單細(xì)胞懸液。固定破膜后行anti-FITC-α-SMA抗體胞內(nèi)染色，避光孵育洗滌后上流式檢測，檢測PKp6標(biāo)記陽性細(xì)胞在α-SMA+細(xì)胞中的比例。

Fig 1　Number of CD34+/SM-MHC+ cells increased progressively during prolonged OVA challenge

CD34+/SM-MHC+cell numbers in blood from acute and prolonged OVA-challenged mice and PBS controls were analyzed by flow cytometry. The numbers indicated are the average values of three independent experiments

2　結(jié)果

2.1哮喘模型小鼠外周血中平滑肌祖細(xì)胞含量測定我們使用流式分析技術(shù)測定小鼠外周血中CD34+/SM-MHC+細(xì)胞含量，結(jié)果顯示，急性哮喘模型外周血中CD34+/SM-MHC+細(xì)胞含量較對照組無明顯增多，而隨著OVA霧化時(shí)間的延長，氣道重塑模型中CD34+/SM-MHC+細(xì)胞含量明顯升高，表明平滑肌祖細(xì)胞參與了哮喘氣道重塑的發(fā)生(Fig 1)。

2.2平滑肌祖細(xì)胞鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)基中添加高濃度PDGF-BB(50 μg·L-1)培養(yǎng)7 d后，小鼠MSC即逐漸呈現(xiàn)長梭形，并呈“峰谷狀”分布(Fig 2)。

Fig 2　Phase-contrast micrograph of mesenchymal stem cells cultured with PDGF-BB for 7 days

The cells showed spindle shape after PDGF-BB stimulation

2.2.2細(xì)胞鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)染色：PDGF-BB誘導(dǎo)分化7 d后，可見部分細(xì)胞開始表達(dá)α-SMA，對照組為未經(jīng)誘導(dǎo)分化的MSC(Fig 3)。

Fig 3　Cells expressed α-SMA after cultured with PDGF-BB for 7 days

Representative photomicrographs of immunocytochemical staining of the culture cells. Brown staining showed positive α-SMA expressing after PDGF-BB stimulation contrast to PBS controls.

流式分析檢測：含PDGF-BB(50 μg·L-1)培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，部分細(xì)胞開始表達(dá)α-SMA單陽性。培養(yǎng)14 d后，單一表達(dá)α-SMA或CD34的陽性細(xì)胞增多，10%細(xì)胞同時(shí)表達(dá)α-SMA及CD34。培養(yǎng)20 d以上，71%左右的培養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)陽性表達(dá)CD34、α-SMA(Fig 4A)。SM-MHC為平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，培養(yǎng)3周以上約有58.5%細(xì)胞陽性表達(dá)，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞能夠向平滑肌細(xì)胞分化(Fig 4B)。

2.3平滑肌祖細(xì)胞遷移功能檢測

2.3.1體外遷移我們使用具有強(qiáng)效促遷移作用的細(xì)胞因子HB-EGF誘發(fā)平滑肌祖細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)，并應(yīng)用Transwell小室進(jìn)行遷移功能檢測，不含HB-EGF的無血清培養(yǎng)基作為空白對照組。結(jié)果顯示，平滑肌祖細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的遷移能力(Fig 5)。

Fig 4　PDGF-BB induced mesenchymal stem cells to express α-SMA, CD34 and SM-MHC

A: α-SMA and CD34 expression after cells cultured with PDGF-BB(50 μg·L-1) were analyzed by flow cytometry on 7thday, 14thday and 21stday. B: SM-MHC and CD34 expression in the cells stimulated with PDGF-BB were analyzed by flow cytometry on 14thday and 21stday. The numbers indicated are the average values of three independent experiments

Fig 5　Smooth muscle progenitor cells migrated in vitro

A:The migration of smooth muscle progenitor cells induced by HB-EGF was investigated by Boyden chamber assay;B:The magnitude of smooth muscle progenitor cells migration was expressed as the fold change of migrationvsblank control group. Studies included three independent experiments.*P<0.05 compared to the blank control group.

2.3.2體內(nèi)遷移我們使用PKp6染色劑作為體內(nèi)示蹤劑，通過OVA或PBS的霧化攻擊觀察平滑肌祖細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的遷移能力。結(jié)果顯示，與空白對照組以及PBS霧化組相比，OVA霧化攻擊可明顯增加小鼠氣道組織中陽性標(biāo)記細(xì)胞的含量，證實(shí)平滑肌祖細(xì)胞在體內(nèi)也具有遷移能力(Fig 6)。

3　討論

2002年，Smiper等首先從人外周血中分離出能夠向平滑肌細(xì)胞分化的CD34+祖細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)PDGF-BB能夠促進(jìn)這種前體細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞[2]。由于骨髓是體內(nèi)多種干細(xì)胞及祖細(xì)胞的重要來源，且平滑肌祖細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于外周血，因此學(xué)者普遍認(rèn)為其最可能來源于骨髓MSC。之后，許多圍繞誘導(dǎo)骨髓MSC向平滑肌祖細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)因此展開，研究者發(fā)現(xiàn)，使用大劑量PDGF-BB刺激骨髓MSC，能夠誘導(dǎo)其表達(dá)α-SMA、SM-MHC及鈣調(diào)蛋白等平滑肌特異性標(biāo)志物，分化成為平滑肌祖細(xì)胞[4,9,11]。

然而，這種由骨髓來源MSC進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得平滑肌祖細(xì)胞的方法雖然能夠在人、大鼠等動(dòng)物中得到成功實(shí)施，卻不易在小鼠中進(jìn)行[8]。小鼠骨髓中富含造血干細(xì)胞，而MSC的含量卻極低，細(xì)胞數(shù)僅為百萬分之一[12]，較難通過貼壁法獲取真正的MSC，且即便多次重復(fù)傳代換液也很難排除造血干細(xì)胞的干擾。同時(shí)，小鼠骨髓SMC培養(yǎng)周期長，往往在獲得純化MSC之前細(xì)胞已衰老或分化形成異質(zhì)細(xì)胞群，這都致使采用骨髓來源MSC進(jìn)行體外祖細(xì)胞定向分化培養(yǎng)及其功能研究的小鼠模型實(shí)驗(yàn)極為困難。因此，本實(shí)驗(yàn)改為嘗試采用小鼠密質(zhì)骨來源MSC制備平滑肌祖細(xì)胞，并采用膠原酶消化長骨骨干40 min中后直接取游出細(xì)胞進(jìn)行鋪板，簡化了密質(zhì)骨來源MSC的提取方法。我們發(fā)現(xiàn)，直接提取游出細(xì)胞進(jìn)行鋪板，并培養(yǎng)于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)[13]，48 h細(xì)胞即可貼壁且增殖旺盛，3～4 d即有70%～80%細(xì)胞融合，可開始進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。使用PDGF-BB刺激1周后，細(xì)胞開始出現(xiàn)峰谷狀排列，部分細(xì)胞即開始表達(dá)α-SMA或CD34。而誘導(dǎo)3～4周后，70%以上細(xì)胞為CD34和α-SMA雙陽性，提示分化為平滑肌祖細(xì)胞。由此證實(shí)，密質(zhì)骨來源間充干細(xì)胞同樣具有向平滑肌祖細(xì)胞分化的能力。采用這種方法進(jìn)行平滑肌祖細(xì)胞培養(yǎng)，能夠明顯縮短平滑肌祖細(xì)胞的培養(yǎng)周期，造血干細(xì)胞污染少，前期不需要添加細(xì)胞因子或其他制劑亦能獲得純度較高的MSC，后期亦無需特殊培養(yǎng)體系或技術(shù)。經(jīng)PDGF-BB誘導(dǎo)2～3周后，雙陽性表達(dá)CD34+/α-SMA+的細(xì)胞含量高，具有較好的細(xì)胞活性，適于進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能研究。

此外，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在使用PDGF-BB誘導(dǎo)分化的過程中，細(xì)胞首先表達(dá)單一陽性的CD34或α-SMA，后期才出現(xiàn)兩者雙陽性的細(xì)胞，這種標(biāo)志物出現(xiàn)順序不一致的原因目前尚不得而知，可能反映了細(xì)胞分化過程中復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。SM-MHC是較為特異性的平滑肌標(biāo)志物，我們的實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)3周以上時(shí)可見部分細(xì)胞開始表達(dá)這一標(biāo)志物，顯示平滑肌祖細(xì)胞具有進(jìn)一步向平滑肌細(xì)胞分化的能力。后續(xù)針對平滑肌祖細(xì)胞遷移功能的研究顯示，無論在體外或體內(nèi)，平滑肌祖細(xì)胞都具有較強(qiáng)的遷移能力，能夠被促遷移細(xì)胞因子或OVA誘導(dǎo)的肺部炎癥募集，證實(shí)用本方法培養(yǎng)得到的平滑肌祖細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活性，適于進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)功能研究。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)介紹了一種改良的小鼠平滑肌祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，這種方法培養(yǎng)小鼠平滑肌祖細(xì)胞周期更短，獲得細(xì)胞比率高且活性好，且更為簡便，能夠用于后續(xù)的平滑肌祖細(xì)胞功能及相關(guān)機(jī)制研究。

Fig 6Smooth muscle progenitor cells migratedinvivoSensitized mice were transferred with smooth muscle progenitor cells labed with PKp6 red fluorescence via tail vein on day 19 and day 22, and challenged with OVA from day 18 to day 23.Control group received PBS instead. The frequency of PKp6 labeled cells in α-SMA+cells harvested from tracheae was analyzed by flow cytometry. The data showed as the average percentage of PKp6+cells in α-SMA+cells from three independent experiments.n=5/group.*P<0.05 compared with PBS and control group.

(致謝：本文于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室完成，感謝陳君君、盧珊、陸國華等實(shí)驗(yàn)人員的參與，特此致謝！)

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Invitroculture and migration assay of mouse smooth muscle progenitor cells

WANG Qing, LI He-quan, ZHOU Jian-ying

(DeptofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FirstAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003，China)

AimTo establish a reliable method for the culture of mouse smooth muscle progenitor cells and investigate their migration ability.MethodsMesenchymal stem cells from compact bones were obtained from C57BL/6 mice and stimulated with PDGF-BB to induce these cells to differentiate into smooth muscle progenitor cells. Morphological analysis, immunocytochemical and flow cytometric analysis were used to identify the cell type and the migration ability was investigated by the transwell system and flow cytometry.ResultAfter PDGF-BB stimulation for 7 days, the cells showed spindle shape and started to express α-SMA as demonstrated by immunocytochemistry. After 21 days induction, Flow cytometric analysis revealed that over 70% of the cells expressed both CD34 and α-SMA and 58.5% of the cells expressed SM-MHC. Migration assay showed that the smooth muscle progenitor cells from culture could migrateinvivoandinvitro.ConclusionsThe culture of smooth muscle progenitor cells from compact bone-derived mesenchymal stem cells is easily operated with high yield rate and shorten culture period. Obtained smooth muscle progenitor cells from culture could migrateinvivoandinvitro, which is suitable for the mechanism studies.

smooth muscle progenitor cells; mesenchymal stem cells; culture; migration；α-SMA；PDGF-BB

◇論著◇

2016-01-18,

2016-04-20

國家自然科學(xué)基金資助課題(No 81100020,81170038)

王晴(1983-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸病學(xué)，E-mail：wqingss@163.com,Tel:0571-87236876;周建英(1957-)女，碩士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：呼吸病學(xué)，通訊作者，E-mail：zjyhz@zju.edu.cn,Tel:0571-87236876

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.007

A

1001-1978(2016)07-0915-06

R-332；R322.74；R329.24；R349.33

`網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.014.html