劉澤娟，趙　萍，陳　娟，趙佳佳，華　晶，王　凌，蔣學華

(四川大學華西藥學院，四川 成都　610041)

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LC-MS/MS法測定人血漿中甲磺酸雷沙吉蘭的濃度及其體內藥動學研究

劉澤娟，趙萍，陳娟，趙佳佳，華晶，王凌，蔣學華

(四川大學華西藥學院，四川 成都610041)

目的建立人血漿中甲磺酸雷沙吉蘭(rasagiline mesylate，PAI)的液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定方法，并應用于研究其在中國健康人體內的藥動學特征。方法以氯吡格雷為內標，血漿樣品經液-液萃取后，通過三重四級桿串聯(lián)質譜儀，以選擇性正離子反應監(jiān)測進行測定，檢測離子對為m/z172.3→117.1(雷沙吉蘭)，m/z322.3→184.0(氯吡格雷)。甲磺酸雷沙吉蘭線性范圍為0.1047～20.93 μg·L-1，定量限為0.1047 μg·L-1，方法學各項指標均符合要求。應用此法研究24名(男女各半)中國健康志愿者口服甲磺酸雷沙吉蘭片的藥動學特點及進行了統(tǒng)計學比較。結果結果顯示0.5、1.0及2.0 mg 3個劑量組(n=12)甲磺酸雷沙吉蘭的吸收呈線性動力學特征；中劑量多次給藥后，無蓄積現(xiàn)象；性別對雷沙吉蘭主要藥動學參數的影響差異也無統(tǒng)計學意義；但高脂飲食對雷沙吉蘭的藥物峰濃度有明顯影響，但對吸收程度無明顯影響。結論建立的LC-MS/MS測定法專屬、靈敏，滿足甲磺酸雷沙吉蘭片的人體藥動學研究。

甲磺酸雷沙吉蘭；藥代動力學；血藥濃度；LC-MS/MS；人血漿；測定

甲磺酸雷沙吉蘭(rasagiline mesylate，PAI)是一種強效、高選擇性、不可逆的B型單胺氧化酶(MAO-B)抑制劑，對多巴胺能運動神經功能失調具有治療作用[1]。目前多種藥物用于帕金森病(PD)的治療[2]，PAI在臨床上主要用于治療早期PD，亦可作為較晚期患者治療藥物左旋多巴的補充用藥[3]。其作用機制是阻滯神經遞質多巴胺的分解，從而增加多巴胺的蓄積，引起紋狀體中多巴胺細胞外水平上升。多巴胺水平的升高和隨后多巴胺能活性的增強，能使PD患者的臨床癥狀(多巴胺能運動功能障礙)得到改善[4]。本研究建立了一種高效、快速、準確的LC-MS/MS法，對24名健康受試者空腹單次、多次及高脂餐后口服甲磺酸雷沙吉蘭片后的藥動學進行研究，為臨床治療的有效性和安全性評價提供全面參考。

1　材料與方法

1.1藥品和試劑甲磺酸雷沙吉蘭片(規(guī)格：1.0 mg/片，批號：20130104，四川方向藥業(yè)有限責任公司)；甲磺酸雷沙吉蘭對照品(PAI，批號：121223，含量99.68%，四川方向藥業(yè)有限責任公司)；硫酸氫氯吡格雷(CLO，內標)對照品(批號：100819-201102，含量99.5%，中國食品藥品檢定研究院)；乙酸乙酯(分析純，批號為20140624，天津市致遠化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，批號：20111101，天津市瑞金特化學品有限公司)；甲酸銨(色譜純，批號：WC390060，Shanghai ANPEL Scientific instrument Co.Ltd)；甲醇(色譜純，批號：3DL0001，SPECTRUM CHEMICAL MFG.CORP)；水為去離子水。

1.2色譜條件CTC Analytics HTS PAL Autosampler自動進樣器(瑞典CTC Analytics AG)；SHIMADZU SCL-10A vp二元泵；DGU-14A脫氣系統(tǒng)(日本Shimadzu 公司)；色譜柱CAPCELL PAK C18(5 μm，2.0×50 mm)；流動相水溶液(含5 mmol·L-1甲酸銨；A)，甲醇(含5 mmol·L-1甲酸銨；B)，梯度洗脫(洗脫程序見Tab 1)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量5 μL。

Tab 1　Gradient elution procedure

1.3質譜條件API 3000TM型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，ESI 離子源(美國Applied Biosystem公司)；監(jiān)測模式正離子模式；掃描方式多反應監(jiān)測(MRM)；監(jiān)測離子對m/z 172.3→117.1(PAI)，m/z 322.3→184.0(CLO)；離子噴射電壓3 500 V；溫度400℃；霧化氣10；氣簾氣8；碰撞氣8；去簇電壓12V(PAI)、40V(CLO)；聚焦電壓64V(PAI)、109V(CLO)；碰撞能量17V(PAI)、30V(CLO)；碰撞室出口電壓10V(PAI)、10V(CLO)。

1.4溶液配制PAI對照品溶液：精密稱取PAI對照品20.93 mg置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度為209.3 mg·L-1的PAI對照品儲備液。進一步以甲醇稀釋得PAI濃度分別為2.094、4.188、10.47、20.94、104.7、209.3和418.6 μg·L-1的標準曲線工作液。

內標溶液：精密稱取CLO對照品10.11 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度為202.2 mg·L-1的CLO對照品儲備液；進一步用甲醇稀釋成濃度為101.1 μg·L-1的內標工作液。

1.5樣品處理與測定精密移取志愿者血漿(室溫融化)0.3 mL，加入甲醇15 μL，渦旋振蕩30 s，靜置備用。

取含藥血樣或待測血樣，加入內標工作液15 μL，渦旋30 s后加入氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)50 μL，渦旋30 s后加入3 mL萃取劑(乙酸乙酯)，再渦旋3 min，12 000 r·min-1離心5 min。移取上清液于37℃潔凈氮氣吹干，殘渣加入100 μL甲醇復溶，渦旋混合3 min后12 000 r·min-1離心3 min，上清液轉入0.5 mL EP管內12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清液進樣。

1.6給藥設計入選24名健康受試者(男女各半)，經全面體檢合格，簽署知情同意書，并經中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批同意。將受試者隨機分為兩組，每組男女各半，其中1組進行空腹低(0.5 mg)、中劑量(1.0 mg)單次給藥和多次給藥(每天1.0 mg，連續(xù)7 d)試驗，另一組進行空腹、餐后高劑量(2.0 mg)單次給藥試驗，兩周期之間間隔7 d?？崭菇M禁食12 h后給藥；餐后組于服藥前30 min內進食總熱量為800～1 000卡路里的高脂早餐(150卡路里左右的蛋白質、250卡路里左右的碳水化合物、500～600卡路里的脂肪)，之后給藥。受試者于實驗d 1或d 7服藥前(0時)和服藥后5、10、15、20、30、45 min、1、1.25、1.5、2、3、4、6、8、10 h從靜脈采血，中劑量多次給藥試驗d 4、d 5、d 6早晨于服藥前采血，采血量約4 mL，置于肝素抗凝的試管中，離心5 min(4 000 r·min-1)，分離血漿，置-20℃冰箱備用。

2　結果

2.1專屬性試驗在優(yōu)化后的色譜/質譜條件下，雷沙吉蘭及內標氯吡格雷的質譜圖見Fig 1。分別取6個不同來源的人空白血漿、空白血漿+PAI、空白血漿+CLO和志愿者服藥后血漿樣品，按上述方法處理樣品，分別進樣，圖譜見Fig 2。由圖可見，血漿中內源性物質對待測物的測定無干擾。

2.2線性范圍和最低定量限取空白血漿0.3 mL于4.0 mL EP管中，分別精密加入PAI標準曲線工作溶液15 μL，渦旋振蕩30 s，得濃度分別為0.1047、0.2094、0.5235、1.047、5.235、10.47和20.93 μg·L-1的含藥血漿，按上述方法處理樣品。以含藥血漿中PAI與CLO峰面積的比值R為縱坐標，濃度C為橫坐標，進行加權回歸，計算得PAI的標準曲線方程R=0.401C+0.00503，r=0.9987。含藥血漿中PAI在0.1047～20.93 μg·L-1范圍內線性關系良好。最低定量限(LLOQ)為0.1047 μg·L-1。

2.3準確度和精密度分別配制0.1047、0.2618、5.235和16.75 μg·L-1的含藥血漿(即LLOQ、低、中、高濃度，下同)，各濃度6個，連續(xù)3 d測定，計算準確度和日內、日間RSD。見Tab 2。

2.4提取回收率記錄精密度試驗項下d 1低、中、高濃度的含藥血漿圖譜中PAI和CLO峰面積，以此作為樣品提取后測定的峰面積。取空白人血漿0.3 mL，加入氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)50 μL，渦旋30 s后加入3 mL萃取劑(乙酸乙酯)，再渦旋3 min，12 000 r·min-1離心5 min，移取上清液，于上清液中分別加入低、中、高(0.2618、5.235、16.75 μg·L-1)3種不同濃度的PAI系列工作溶液及內標工作溶液各15 μL，渦旋30 s后，按上述方法處理樣品。記錄PAI、CLO峰面積，以此作為PAI樣品未提取測定的峰面積。計算得低、中、高濃度的含藥血漿中PAI的提取回收率分別為(74.20±4.81)%、(75.37±5.38)%、(82.55±4.40)%(n=6)；內標萃取回收率為：(74.51±5.28)%(n=18)。

Fig 1　Parention full scan mass-spectrogram of PAI(A) and COL (B) Production mass-spectrograms of PAI (C) and GLO (D)

Fig 2　Typical chromatograms

A：Blank plasma;B:Blank plasma+PAI;C:Blank plasma+CLO;D: Plasma sample 30 min after single oral administration of 1.0 g rasagilinemesylate tablet

Tab 2　Results of accuracy and precision tests/%

2.5基質效應取4 mL EP管12個，分別加入低、高濃度的PAI對照品溶液和內標工作液15 μL，各6份，加入氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)50 μL，渦旋30 s后，按上述方法處理樣品。記錄PAI、CLO峰面積。計作set1。選擇6種不同來源的空白血漿，加入低、高濃度(n=6)的PAI對照品溶液，按“3.4”項下方法制備未提取的含藥血漿，得到set2。

絕對基質效應評價：以不同來源樣品set2中樣品峰面積/set1中樣品平均峰面積之比值計算基質效應因子(matrix factor，MF)；以待測物與內標MF的比值計算內標歸一化基質效應因子(IS-normalized MF)。

相對基質效應評價：以多個樣品獲得的內標歸一化基質效應因子計算變異系數。結果見Tab 3?？梢姷?、高濃度樣品的變異系數(即相對基質效應)為6.05%和1.15%，均小于15%，表明基質對于未知樣品測定結果準確度的影響可以忽略。

Tab 3　Results of Matrix effects(n=6)

2.6穩(wěn)定性試驗按“2.3”項下方法配制0.2618和16.75 μg·L-1的含藥血漿(即低、高濃度)，分別考察了含藥血漿處理后4℃放置24 h、室溫放置8 h、凍融3次以及-20℃凍存40 d后的穩(wěn)定性。結果與0時刻含藥血漿相比較，變異均在±4%范圍內(n=6)，表明含藥血漿在上述條件下穩(wěn)定。

2.7藥動學試驗

2.7.1藥時曲線數據采集完成后，經Phoenix WinNonlin 6.3藥動學統(tǒng)計軟件處理得到不同給藥方式組平均血藥濃度-時間數據，志愿者單次給藥(SL、SM、SH)、多次給藥(MM)、飲食影響(FH)的試驗中，各個平均藥-時曲線，見Fig 2。

2.7.2藥動學參數由實際測定的血藥濃度經時數據讀出Cmax和Tmax。采用Phoenix WinNonlin6.3軟件擬合計算相關藥動學參數，結果見Tab 4-1、4-2。

Fig 3　Mean Drug Concentration-time Curves of rasagiline following oral administration in Healthy Volunteers(n=12)

Tab 4-1

PharmacokineticparameterLow-dosesingleMedium-dosesingleMultipleCmax/μg·L-12.45±0.445.36±1.035.74±1.15Tmax/h0.35±0.100.40±0.100.39±0.11T1/2/h0.47±0.270.73±0.320.71±0.30AUC0→t/μg·L-1·h1.39±0.363.36±1.035.18±1.95AUC0→∞/μg·L-1·h1.52±0.423.54±1.035.37±2.01CL/L·h-1359.03±0.36311.58±113.65211.07±77.26Vz/L224.49±106.40312.69±154.47203.87±80.09MRT0→t/h0.59±0.110.79±0.170.96±0.29MRT0→∞/h0.75±0.210.96±0.201.08±0.34

Tab 4-2

PharmacokineticparameterHigh-doseFastHighfatprandialCmax/μg·L-19.37±1.316.60±1.36Tmax/h0.50±0.200.58±0.26T1/2/h0.74±0.500.87±0.66AUC0→t/μg·L-1·p.65±1.805.43±1.69AUC0→∞/μg·L-1·p.86±1.805.66±1.43CL/L·h-1373.60±120.01387.06±123.05Vz/L382.61±240.88456.50±298.16MRT0→t/h0.81±0.271.11±0.36MRT0→∞/h0.94±0.321.27±0.46

對空腹單次與多次給予相同劑量本品后，PAI的lg(AUC0→t)、lg(AUC0→∞)、lg(Cmax)和消除半衰期T1/2進行配對t檢驗，結果表明，T1/2的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但AUC0→t、AUC0→∞、Cmax的結果有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對其Tmax進行秩和檢驗，結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。計算PAI的蓄積因子為(1.09±0.09)。

對空腹與餐后單次給予相同劑量本品后的lg(AUC0→t)、lg(AUC0→∞)、lg(Cmax)和消除半衰期T1/2進行配對t檢驗，其AUC0→t、AUC0→∞和消除半衰期T1/2的結果沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但Cmax的結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明高脂飲食會導致雷沙吉蘭峰濃度降低，但暴露量與空腹比較無統(tǒng)計學差異，與文獻報道一致[6]。

對男、女不同受試者給予相同劑量本品后的lg(AUC0→t)、lg(AUC0→∞)、lg(Cmax)和消除半衰期T1/2進行獨立樣本t檢驗，對其Tmax進行秩和檢驗，結果表明，性別對于主要藥動學參數影響的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3　討論

本實驗建立的LC-MS/MS法快速、準確、靈敏，適用于本實驗樣本中甲磺酸雷沙吉蘭的人體藥動學研究。

對線性動力學特征進行判斷的方法，目前常用有3種[5]。① 傳統(tǒng)方法，即基于趨勢圖進行線性藥動學判斷。以相關系數(r)作為評價指標，r越接近于1，線性越好，但是r值為多大時認為不具有線性動力學特征并沒有準確的、規(guī)范的判斷標準，不免具有主觀性。② 采取假設檢驗的方法，即各受試者藥動學參數進行劑量標準化處理后再進行單因素方差分析。此法簡單易于計算，但只能定性地分析是否有線性動力學特征，具體劑量增加后，藥物線性動力學偏移程度無法獲得。③ 冪指數模型，即基于置信區(qū)間法的線性動力學特征判定方法。置信區(qū)間法應用統(tǒng)計學知識與臨床實踐經驗，不僅將個體間的變異納入考察范圍，而且借鑒生物等效性試驗中藥動學參數的等效標準，對線性回歸斜率進行了明確的判斷界定，一改傳統(tǒng)判斷方法的主觀性及單因素方差分析不明確性，更符合藥代動力學研究的要求。本文應用②、③兩種方法進行分析，均可得出劑量與吸收(AUC、Cmax)具有線性關系。雖然，用③法中統(tǒng)計學得出，AUC判定區(qū)間與置信區(qū)間有交叉，可能是因為等效標準是針對24個人的，過于嚴苛所致。由此，我們可以認為，本實驗所考察劑量范圍內，劑量與吸收(AUC、Cmax)具有明顯線性關系。

關于多次給藥后的蓄積程度，用蓄積因子來評價，但蓄積因子界值也沒有統(tǒng)一的認識。從FDA Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics Review(rasagiline mesylate)中得知，原研制劑連續(xù)7 d多次給藥后的AUC和Cmax分別是單次給藥后的1.39、1.45倍，結論是多次給藥后PAI幾乎沒有蓄積。本實驗中，本品連續(xù)7 d多次給藥后，在中國人中的AUC和Cmax分別是單次給藥后的1.54、1.09倍，與本品原研制劑的研究結果基本一致，且蓄積因子為(1.09±0.09)。故得出，本品在健康中國人體內幾乎沒有蓄積現(xiàn)象，與文獻報道一致[7]。高脂飲食對本品藥動學參數影響試驗中，結果顯示高脂餐對PAI的Cmax存在明顯影響(P<0.05)，對暴露量的影響較小，研究結果與文獻報道一致[8]?？赡苁歉咧嬍秤绊懳概趴?，減慢藥物吸收速率，使Cmax明顯下降，由血藥濃度曲線可以看出，在藥物消除整個過程中，高脂餐組的血藥濃度比空腹給藥組更高，表明可能是餐后藥物清除速率降低所致，由此，高脂飲食對PAI的AUC降低并不十分明顯。因此，本品的臨床治療用藥可不考慮食物的影響。

實驗結果表明，健康中國人單劑量口服本品(0.5～2.0 mg)后，劑量與吸收(AUC、Cmax)具有明顯線性關系；多次給藥后PAI在健康中國人體內幾乎沒有蓄積現(xiàn)象；高脂飲食會使PAI的峰濃度降低，但對吸收程度無明顯影響；臨床推薦劑量下，男女受試者的主要藥動學參數無明顯差異。

(致謝:感謝王凌、蔣學華兩位老師對本文研究工作的悉心指導和大力支持，同樣感謝本教研室研究生趙萍、陳娟、趙佳佳、華晶同學的關心和幫助。)

[1]Pagonabarraga J,Rodríguez-Oroz M C. Rasagiline in monotherapy inpatients with early stages of Parkinson’s disease and in combined and adjunct therapy to levodopa with moderate and advanced stages[J].RevNeurol,2013,56(1):25-34.

[2]張萬鑫, 馬婧怡,陳虹,等.松果菊苷對帕金森病大鼠紋狀體及海馬細胞外液中單胺類神經遞質的影響[J].中國藥理學通報,2014,30(8):1131-6.

[2]Zhang W X, Ma J Y, Chen H,et al. Effects of echinacoside on striatal and hippocampus extracellular fluid of monoamine neurotransmitter in Parkinson’s disease rats[J].ChinPharmacolBull,2014,30(8):1131-6.

[3]Perez-Lloret S,Rascol O.Safety of rasagiline for the treatment ofParkinson’s disease[J].ExpertOpinDrugSaf,2011,10(4):633-43.

[4]孫銅,郝麗娜.帕金森病治療新藥-雷沙吉蘭[J].齊魯藥事,2007,26(8):509-10.

[4]Sun T,hao L N.Parkinson′s disease treatment novel drugs-rasagiline[J].QiluPharmAffairs,2007,26(8):509-10.

[5]趙明,楊勁,魏敏吉.置信區(qū)間法用于線性藥代動力學特征評價[J].中國臨床藥理學雜志,2015,31(3):238-40.

[5]Zhao M,Yang J,Wei M J.Using confidence interval method to assess linear pharmacokinetics in doseescalation study[J].ChinJClinPharmacol,2015,31(3):238-40.

[6]顧霄,張圓,宋敏,等.飲食對甲磺酸雷沙吉蘭人體藥代動力學的影響[J].中國藥科大學學報,2013,44(1):85-8.

[6]Gu X,Zhang Y,Song M,et al.Food effects on the human pharmacokinetics of rasagilinemesylate[J].JChinaPharmaUniv,2013,44(1):85-8.

[7]Thebault J J,Guillaume M,Levy R.Tolerability, safety, pharmacodynamics,and pharmacokinetics of rasagiline:A potent, selective, and irreversible monoamine oxidase type B inhibitor[J].Pharmacotherapy, 2004,24(10): 1295-305.

[8]Chen J J, Swope D M. Clinical pharmacologyof rasagiline: a novel,second-generation propergylamine for the treatment of Parkinson diseas[J].JClinPharmacol,2005,45(8) : 878-94.

Determination of rasagiline mesylate in human plasma by LC-MS/MS and its pharmacokinetics study

LIU Ze-juan,ZHAO Ping,CHEN Juan,ZHAO Jia-jia,HUA Jing,WANG Ling, JIANG Xue-hua

(WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

AimTo develop LC-MS/MS method to determine rasagiline mesylate in human plasma and its application in a pharmacokinetics study. MethodsPlasma samples were extracted using liquid-liquid extraction with clopidogrel as internal standard.The content of rasagiline mesylate in human plasma was detected by selectivelypositive ion reaction monitoring on a triple quadrupoles tandem mass spectrometer.The detected ions were m/z 172.3→117.1(rasagiline), m/z 322.3 →184.0(clopidogrel).The linear calibration curve was obtained in the concentration range of 0.1047～20.93 μg·L-1.The lower limit of quantification was 0.1047 μg·L-1.Indicators of the method validation were in line with requirements.The method was used to determine the concentration of rasagiline in human plasma after oral administration of rasagiline mesylate capsule to 24 healthy Chinese volunteers(with half males and females) and the results were compared statistically.ResultsThe single oral dose of 0.5,1.0 and 2.0 mg presented linear pharmacokinetics in the health volunteers. No accumulation was observed with multiple doses. Meanwhile, no significant difference was identified between the gender groups. High fat postprandial has obvious effects on the peak serum concentration of rasagiline，but there was no effect on the absorption amount and cumulative excretion. ConclusionThe LC-MS/MS method is specific and sensitive, and can be successfully applied to the pharmacokinetic study of Rasagiline mesylate tablets in healthy Chinese volunteers.

rasagiline mesylate；pharmacokinetics；plasma concentration；LC-MS/MS；human Plasma；determine

2016-01-14修回稿日期：2016-05-25

劉澤娟(1988-)，女，碩士，研究方向：臨床用藥的藥動學基礎，E-mail:873709777@qq.com；王凌(1978-)，女，博士后，副教授，研究方向：藥動學的研究與應用，通訊作者，Tel:028-85503968,E-mail:7649800@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.025

A

1001-1978(2016)07-1017-06

R446.112；R916.4；R969.1；R971.5

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.050.html