張華強(qiáng)　鄧明明　王文兵　周濤

(1.宜賓市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 宜賓 644000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

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丙酮酸激酶M1和M2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義*

張華強(qiáng)1鄧明明2王文兵1周濤1

(1.宜賓市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 宜賓 644000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

【摘要】目的研究丙酮酸激酶M1(Pyruvate kinase M1，M1-PK)和丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，M2-PK)在不同臨床及病理分期的結(jié)直腸癌(CRC)組織(結(jié)直腸癌組)及癌旁正常結(jié)直腸組織(對照組)中的表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系。方法選擇CRC組織標(biāo)本69份,同時(shí)選擇癌旁正常結(jié)直腸組織標(biāo)本69份作為對照樣本,采用SP法檢測M1-PK和M2-PK在CRC組織中的表達(dá)。采用單因素和多因素分析比較M1-PK和M2-PK在CRC的低分化組、中分化組與正常癌旁組織中表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用相關(guān)分析比較CRC中M1-PK與M2-PK表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果M1-PK在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)微弱，低于癌旁正常組織，M2-PK在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；M1-PK在CRC組織中表達(dá)隨著腫瘤分化程度降低而減少(P<0.05) ，M2-PK在CRC組織中表達(dá)隨著腫瘤分化程度降低而增加(P<0.05) ；M1-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與分化程度密切相關(guān)(P<0.05) ，而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。M2-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤臨床TNM分期及腫瘤分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤部位、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。CRC組織中M1-PK的表達(dá)水平與M2-PK表達(dá)的相關(guān)性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)論從組織表達(dá)的角度提示，M1-PK與M2-PK在CRC細(xì)胞中表達(dá)量的比值可反映結(jié)腸癌的惡化程度。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌；丙酮酸激酶M1；丙酮酸激酶M2；免疫組化

結(jié)直腸癌(Colorectal Carcinoma,CRC)是一種危害性大、發(fā)病率高的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例超過100 萬例以上，每年超過50萬患者因其死亡，在目前世界上腫瘤發(fā)病率上排列第3，在腫瘤所引起的死因中排第4位[1]。CRC的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān),如基因多態(tài)性、個(gè)人飲食習(xí)慣、生活環(huán)境污染、遺傳易感性等因素均共同或單獨(dú)參與CRC的發(fā)病[2]。正常結(jié)直腸粘膜的癌變,是一個(gè)逐步進(jìn)展的過程，從細(xì)胞輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生到最終癌變，是結(jié)直腸粘膜細(xì)胞在多種致病因素影響下異常分化累積的結(jié)果[3]。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是糖酵解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，PEP的高能磷酸鍵在催化作用下轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷(adenosinediphosphate.ADP)生成三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)，自身生成烯醇式丙酮酸，再轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。在糖酵解途徑中，它是第二個(gè)以底物水平磷酸化方式生成ATP的反應(yīng)，是糖酵解途徑中的又一個(gè)關(guān)鍵限速酶[4]。哺乳動物的PK有四種同工酶，分別為L型、R型、M1型和M2型，M1-PK存在于骨骼肌、心肌和腦中；M2-PK廣泛存在于腎臟、胃、腸、肝臟、脾、肺等組織中[5]。截止目前，關(guān)于M1-PK、M2-PK在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，以及其與CRC的惡性程度之間的內(nèi)在關(guān)系仍不完全清楚。本研究的目的旨在通過用免疫組化方式檢測不同臨床及病理分期的CRC細(xì)胞、癌旁正常組織細(xì)胞中M1-PK、M2-PK的表達(dá)分布情況，找出其與CRC的發(fā)展是否相關(guān)，為CRC的早期診斷、治療提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本全部來自宜賓市第一人民醫(yī)院2013年1月～2015年1月，病理科的手術(shù)切除組織，共選擇CRC組織標(biāo)本69份(結(jié)直腸癌組),同時(shí)選擇癌旁正常結(jié)直腸組織標(biāo)本69份作為對照組,所有病理標(biāo)本均具備完整甲級臨床病歷資料。組織來源標(biāo)本具備下列條件：厚度在0.2cm以內(nèi)的無受壓變形組織,固定過程不超過12h。同時(shí)具備完整標(biāo)準(zhǔn)的甲級病歷內(nèi)容。排除患者組織標(biāo)本來源合并下列情況者:長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑患者，患有其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病;合并其它重要系統(tǒng)慢性器官功能衰竭患者；既往曾患結(jié)直腸惡性腫瘤患者；既往有其它器官系統(tǒng)腫瘤患者;應(yīng)用其他具有增加惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)藥物的患者。

1.2方法

1.2.1腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)病例中CRC分期參照AJCC第7版TNM分期T原發(fā)腫瘤。

1.2.2術(shù)后標(biāo)本的處理將CRC組織標(biāo)本放入10%中性福爾馬林液中固定不超過12小時(shí),取出標(biāo)本,酒精浸泡，脫水兩次。然后用石蠟包埋透明后的組織標(biāo)本，用切片機(jī)連續(xù)切片后烤片,融蠟后固定標(biāo)本,備用。

1.2.3檢測TUM1-PK與TUM2-PK在CRC組織中的表達(dá)采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，30 g/L過氧化氫去離子水孵育10 min，滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)，滴加一抗(兩種抗體均為兔抗大鼠多克隆抗體，濃度1∶200)，滴加試劑B(生物素化山羊抗兔IgG)，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。陽性反應(yīng)為胞質(zhì)染成棕黃色或黃色。用PBS代替一抗，其余步驟同上作陰性對照。采用Image-pro 6.0圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析，在400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)非重疊視野，測定其平均光密度值(Average optical density，AOD)，取平均值為該片的光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1TU M1-PK、TU M2-PK在正常結(jié)直腸粘膜組織和CRC組織的表達(dá)與分布TU M1-PK、TU M2-PK在正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞以及CRC上皮細(xì)胞中均有所表達(dá)，呈細(xì)胞質(zhì)分布，陽性信號表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒。TU M1-PK在CRC組織中表達(dá)比較微弱，中分化組中的表達(dá)較低分化組稍高，但均明顯低于癌旁正常組織(對照組);TU M2-PK在CRC組織中的表達(dá)則明顯升高，其中CRC低分化組表達(dá)更為顯著，與對照組均有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、表2及圖1、圖2。

Tab.1Comparison of expression positive rate of TUM1 - PK and TUM2 - PK in CRC tissue and normal colon tissue

組別nTUM1-PKTUM2-PK 2P對照組690.320±0.0260.207±0.05632.4610.007結(jié)直腸癌組690.231±0.0230.347±0.0546.9080.009 235.2317.932P<0.05<0.05

表2　TU M1-PK TU M2-PK在CRC中分化、低分化組織與對照組中表達(dá)陽性率比較

注：與對照組比較，①P<0.05；與中分化組比較，②P<0.05

圖1TUM1-PK在組織中的表達(dá)(免疫組化×400)

Figure1The expression of TUM1-PK in tissue (Immunohistochemistry,×400)

注：圖中呈黃色或棕黃色細(xì)胞為表達(dá)陽性細(xì)胞。a.對照組；b.低分化組TUM1-PK表達(dá)輕微；c.中等分化組TUM1-PK表達(dá)相對較多

圖2TUM2-PK在組織中的表達(dá)(免疫組化×400)

Figure1The expression of TUM2-PK in tissue (Immunohistochemistry,×400)

注：圖中呈黃色或棕黃色細(xì)胞為表達(dá)陽性細(xì)胞。a.對照組TUM2-PK表達(dá)輕微;b.低分化組TUM2-PK表達(dá)相對較多;c.中等分化組TUM2-PK表達(dá)明顯增強(qiáng)

2.2TU M1-PK和TU M2-PK在CRC組織中的表達(dá)與患者臨床病理資料之間的關(guān)系采用單因素和多因素分析顯示，TU M1-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)(P<0.05) ，腫瘤的分化程度越高，TU M1-PK 表達(dá)相對增加，腫瘤的分化程度越低，M1-PK的表達(dá)反而減少；TU M1-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤TNM 臨床分期及有無合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系；TU M2-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、腫瘤TNM 臨床分期密切相關(guān)(P<0.05) ，相對于直徑小于5cm的CRC組織，TU M2-PK在腫瘤直徑大于等于5cm的組織中表達(dá)更多；相對于T1/T2 期的CRC組織，TU M2-PK在T3/T4 期的組織中表達(dá)更多；相對于分化程度高的CRC組織，TU M2-PK在分化程度低的組織中表達(dá)更多；TU M2-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，見表3。

表3TU M1-PK、TU M2-PK在CRC組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Table 3The relationship of TU M1 - PK and TU M2 - PK in the CRC tissue expression and clinicopathological parameters

項(xiàng)目nTUM1-PKAOD均值PTUM2-PKAOD均值P年齡(歲) ≥65370.1380.2050.3010.238 <65320.1490.298腫瘤大小(cm) ≥5330.2310.3590.4200.036 <5360.1900.310分化程度 中等分化480.2600.0350.2590.015 低分化210.1670.420TNM分期 T1/T2期400.1910.2090.3100.011 T3/T4期290.1880.470淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有340.1190.7120.3380.092 無350.1280.319

2.3CRC組織中TU M1-PK 的表達(dá)水平與TU M2-PK 表達(dá)水平的相關(guān)性分析CRC組織中TU M1-PK 表達(dá)水平與TU M2-PK 表達(dá)水平的相關(guān)性：采用直線相關(guān)分析顯示結(jié)果如下：TU M1-PK 與TU M2-PK 表達(dá) AOD比較r=-0.689(P<0.01),提示呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3討論

CRC在我國也相當(dāng)常見，分布廣泛，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第四位，僅次于肺癌、胃癌及肝癌，其高發(fā)年齡在50歲以上,然而近年來更多深入研究表明，青年患者的患病比例及人數(shù)也在不斷攀升[6]。目前診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)是組織學(xué)病理活檢,但取樣手段有限，主要依賴于結(jié)直腸鏡檢查，但結(jié)腸鏡檢查是一種存在潛在風(fēng)險(xiǎn)的侵入性的檢查,受患者年齡、心肺功能、腹水、內(nèi)環(huán)境紊亂、感染、腸道準(zhǔn)備情況等多種因素制約,而且腸道準(zhǔn)備過程中可能出現(xiàn)腸梗阻，檢查過程中可能發(fā)生出血、穿孔等并發(fā)癥。由于結(jié)直腸屬于空腔臟器，管腔大小、管壁厚度及內(nèi)容物不恒定，通過腹部CT、MRI及彩超等影像學(xué)檢查療效欠佳，所發(fā)現(xiàn)病變多已屬于中晚期病變，治療效果及預(yù)后差?，F(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA199等敏感性及特異性偏低，不能較好適應(yīng)早期準(zhǔn)確診斷需要。因此現(xiàn)在迫切需要找出一些非侵入性，風(fēng)險(xiǎn)較低，且方便、快速、經(jīng)濟(jì)、耐受性好的檢測方法來進(jìn)行CRC的早期診斷，從而可以進(jìn)行早期治療，提高CRC的治療效果、生存質(zhì)量及預(yù)后，減輕CRC患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

無論是否有氧氣存在，腫瘤細(xì)胞都不是通過氧化磷酸化進(jìn)行代謝，而是主要依賴糖酵解提供能量，形成乳酸并消耗大量葡萄糖，這種異常的糖代謝現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)[7]。腫瘤細(xì)胞的增殖是以幾何數(shù)級倍增的過程，需要消耗大量的能量。如果細(xì)胞出現(xiàn)無限制的增殖,細(xì)胞終會因?yàn)闋I養(yǎng)元素供應(yīng)的減少、ATP耗竭而出現(xiàn)死亡[8]。在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)糖酵解過程存在兩種調(diào)節(jié)反應(yīng)，①有氧氧化可以抑制糖酵解(Pauster效應(yīng))。②在充分給予葡萄糖時(shí),機(jī)體都會產(chǎn)生很強(qiáng)的糖酵解作用,而有氧氧化反而減少，與有氧無氧無明顯關(guān)系(Crabtree效應(yīng))[9]。在腫瘤細(xì)胞的代謝中，Pauster效應(yīng)明顯減弱和Crabtree效應(yīng)明顯增強(qiáng)同時(shí)存在,再加上在腫瘤細(xì)胞中M2 -PK明顯過度表達(dá)，激素和飲食均無法對其調(diào)節(jié)，雖然它對底物三磷酸腺苷(ATP)抑制敏感性較低，但是對底物ADP的親和力較大,故M2-PK可增快糖酵解速度失控性,有利于為細(xì)胞的大量增殖提供能量[10]。

在阻止細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)過程中丙酮酸激酶發(fā)揮著重要作用,研究表明,丙酮酸激酶通過調(diào)節(jié)ATP、絲氨酸、1,6 -二磷酸果糖(1,6 fructosediphosphate,FBP)以及不同的癌蛋白(如pp60v-src、HPV-16E7等)之間的相互作用可以調(diào)控二聚體與四聚體型M2-PK的比率,因此在這幾個(gè)因素相互作用下，腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大量二聚體型M2 -PK的形成[11]。

M1-PK基因與M2-PK基因分別編碼531個(gè)氨基酸，而它們有差異的外顯子則分別編碼56個(gè)氨基酸，其中集中在C端的23個(gè)氨基酸存在著差異，因此導(dǎo)致了它們擁有完全不同的酶學(xué)特征[12]。在組織細(xì)胞中M1-PK僅能以高活性的四聚體形式存在，而M2-PK可以在低活性的二聚體與高活性的四聚體之間自由轉(zhuǎn)換，其中只有四聚體形式具有丙酮酸激酶活性，能夠催化與之親和力較高的PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸，在腫瘤細(xì)胞的代謝與增殖過程中提供了所需的能量[13]。二聚體形式的M2-PK與PEP親和力較低，無明顯丙酮酸激酶活性，不參與轉(zhuǎn)化過程[14-15]。

在胚胎發(fā)育過程中，M2-PK逐漸被M1-PK所取代，而在腫瘤發(fā)生過程中L-PK或M1-PK同工酶下調(diào)而M2-PK則再度表達(dá)，M1-PK可以轉(zhuǎn)化為M2-PK，因此在臨床上M1-PK可作為早期診斷和治療過程監(jiān)測的重要指標(biāo)[16-17]。本研究免疫組化中加入M1-PK，以觀察它與CRC的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)(P<0.05) ，腫瘤的分化程度越高，M1-PK表達(dá)相對增加，腫瘤的分化程度越低，M1-PK的表達(dá)反而減少，提示M1-PK可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑制作用，機(jī)理尚不清楚；M1-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤TNM 臨床分期及有無合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，提示M1-PK對于CRC患者的預(yù)后評估及術(shù)后監(jiān)測意義不大；本研究發(fā)現(xiàn)TU M2-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、腫瘤TNM 臨床分期密切相關(guān)(P<0.05) ，相對于直徑小于5cm的CRC組織，TU M2-PK在腫瘤直徑大于等于5cm的組織中表達(dá)更多；相對于T1/T2 期的CRC組織，TU M2-PK在T3/T4 期的組織中表達(dá)更多；相對于分化程度高的CRC組織，TU M2-PK在分化程度低的組織中表達(dá)更多；TU M2-PK在CRC組織中的陽性表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系；提示TU M2-PK的表達(dá)一定程度上可反映CRC患者的預(yù)后，對于術(shù)后患者的監(jiān)測也可起到一定的作用。

本研究從組織學(xué)角度表明，TU M2-PK與CRC的大小及惡性程度的進(jìn)展呈正相關(guān)。

Mukeher jee等通過研究TU M1-PK與TU M2-PK在不同時(shí)期多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，檢測到總蛋白中TU M1-PK與TU M2-PK均有表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的升高，總蛋白中TU M1-PK的表達(dá)也隨之升高[18-20]。而我們的研究則表明在CRC細(xì)胞中，TU M1-PK的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度升高而減低，說明在不同的惡性腫瘤中，TU M1-PK的表達(dá)有所不同。

通過比較TU M1-PK與TU M2-PK在CRC中的表達(dá)情況，我們認(rèn)為TU M1-PK與TU M2-PK在CRC中的表達(dá)量的比值可以較為準(zhǔn)確的反映出CRC的轉(zhuǎn)化情況，該比值與CRC的惡性程度呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即TU M1-PK與TU M2-PK的表達(dá)量的比值越大，其惡性程度越低，TU M1-PK與TU M2-PK的表達(dá)量的比值越小，其惡性程度越高。

4結(jié)論

本研究通過免疫組化方式對CRC組織病理切片進(jìn)行分析，檢測TU M1-PK與TU M2-PK在不同臨床及病理分期的CRC組織及癌旁正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)以獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并證實(shí)：①TU M1-PK與TU M2-PK在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及CRC上皮細(xì)胞中均有所表達(dá)，在CRC細(xì)胞中TU M2-PK的總蛋白表達(dá)情況初步反應(yīng)腫瘤大小、腫瘤分期及腫瘤分化程度。②從組織表達(dá)角度提示，TU M1-PK與CRC的惡性程度及進(jìn)展呈反比例關(guān)系，而TU M2-PK與CRC的惡性程度以及進(jìn)展呈正比例關(guān)系。③PK的活性與CRC的惡性程度呈正比例關(guān)系，比較TU M1-PK與TU M2-PK表達(dá)情況，我們認(rèn)為TU M1-PK與TU M2-PK的表達(dá)量的比值可以更加準(zhǔn)確反映出CRC惡性程度及進(jìn)展情況，這個(gè)比值與CRC的惡性程度及進(jìn)展情況之間呈現(xiàn)出明顯的反比例關(guān)系，也就是說如果TU M1-PK與TU M2-PK的比值越大，組織惡性程度反而越低，而TU M1-PK與TU M2-PK的比值越小，組織惡性程度則越高，這為CRC的檢測及治療提供了新的思路和判斷依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(201005682)

【中圖分類號】R 735.3+5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.005

(收稿日期：2015-12-17；編輯：陳舟貴)

Expression and clinical significance of pyruvate kinase M1 and M2 on colorectal cancer

ZHANG Huaqiang1,DENG Mingming2,WANG Wenbing1,et al

(1.Department of Gastroenterology,The People’s Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan,China;2.Department of Gastroenterology,The Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore pyruvate kinase M1 (M1-PK) and Pyruvate kinase M2 (M2-PK) in CRC expression with the relationship between disease development.Methods69 specimens of CRC tissue were studied and 69 normal colorectal tissue beside CRC tissue were control in the present study.The expression of M1-PK and M2-PK were measured with SP method.The relation of expression of M1-PK and M2-PK of Low differentiation group,middle differentiation group and normal tumor adjacent tissue and clinicopathological characteristics was analyzed.The correlation of expression of M1-PK and M2-PK was explored.ResultsThe expression of M1-PK in CRC tissues decreased as the degree of tumor differentiation.The expression of M2-PK in CRC tissues increased with tumor differentiation degree reduced (P<0.05).The expression and clinical pathological features shown that the positive expression of M1-PK in CRC tissues was closely related to the degree of differentiation (P<0.05),but with the patient age,tumor size,tumor location,clinical TNM stages and lymph node metastasis.M2-PK in the tissue of CRC positive expression and the tumor size,tumor was closely related to the clinical TNM staging and differentiation degree of tumor (P<0.05),but with the patient age,tumor location,presence of lymph node metastasis,no obvious relationship.The results shown that the M1-PK compared with M2-PK express AOD.Conclusion The ratio of M1-PK/M2-PK might be used as the malignant degree and the progress of CRC.

【Key words】Colorectal cancer; Pyruvate kinase M1; Pyruvate kinase M2; Immunohistochemical