徐濤　后望　汪宇輝　成姝婷　劉延友　江舟　肖靜　郭慧玲　王正榮

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

?

·論著·

NIH3T3細(xì)胞中miR-29b表達(dá)變化對mPer1和Egr2的影響*

徐濤后望汪宇輝成姝婷劉延友江舟肖靜郭慧玲王正榮

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

【摘要】目的探討NIH3T3細(xì)胞中miR-29b對血清誘導(dǎo)的立早基因Egr2 mRNA表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照組。實(shí)驗(yàn)組用miR-29b轉(zhuǎn)染，陰性對照組空轉(zhuǎn)，而空白對照組則不做任何處理。RT-qPCR檢測近日節(jié)律基因mPer1與立早基因Egr2 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mPer1和Egr2的表達(dá)均發(fā)生了較明顯的變化。與陰性對照組相比，空白對照組中mPer1和 Egr2的mRNA表達(dá)水平無明顯差異；而實(shí)驗(yàn)組中mPer1的mRNA表達(dá)降低了42%，Egr2的mRNA表達(dá)升高了49%。結(jié)論miR-29b能上調(diào) Egr2的表達(dá)，其途徑可能是通過抑制NIH3T3細(xì)胞近日節(jié)律基因mPer1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】mPer1；miR-29b；Egr2；NIH3T3細(xì)胞

近日節(jié)律系統(tǒng)是生物體的基本系統(tǒng)之一[1]。它能夠幫助生物體與每日外界環(huán)境的變化相協(xié)調(diào)，保證生物體的生理活動正常進(jìn)行[2]。該系統(tǒng)由一系列基因及其表達(dá)產(chǎn)物相互作用形成的負(fù)反饋環(huán)路構(gòu)成。其中Pers、Bmal1、Clock和Crys是其核心組成[3]。在維持生物節(jié)律穩(wěn)定的同時，不同的核心節(jié)律基因在諸如細(xì)胞分化、生物發(fā)育等領(lǐng)域都扮演了重要角色[4]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、長度在19～25核苷酸(nt)之間、高度保守的非編碼小RNA，是包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等在內(nèi)的眾多生物學(xué)進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)因子[5-6]。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA對近日鐘系統(tǒng)有非常重要的調(diào)節(jié)作用。例如，miR192/194和miR-29b基因簇可以負(fù)性調(diào)節(jié)per1、per2和per3的表達(dá)[6-7]。miR-142-3p 能夠直接作用于Bmal1的3′UTR區(qū)域抑制Bmal1的表達(dá)[8]。這些發(fā)現(xiàn)提示我們，miRNA可能是近日鐘調(diào)節(jié)的重要組成部分。

早期生長應(yīng)答基因2(early growth response 2，Egr2)是20世紀(jì)80年代在果蠅胚胎發(fā)育分節(jié)現(xiàn)象的研究中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子[9]。它包括一個C2H2型的鋅指結(jié)構(gòu)，在中腦的發(fā)育中起著非常重要的作用[10]。研究顯示，Egr2受節(jié)律基因Per2和Dbp的調(diào)控且具有節(jié)律性[11]。而我們的前期實(shí)驗(yàn)提示miR-29b可能調(diào)節(jié)節(jié)律基因per1的表達(dá)。這種在調(diào)節(jié)區(qū)域和參與的生物學(xué)事件的高度重合提示了miR-29b可能通過影響Egr2表達(dá)水平，從而對上述生理活動發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1PCR引物合成PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司和廣州銳博生物科技有限公司合成。引物序列，見表1。

表1　PCR引物序列

1.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件：選取NIH3T3細(xì)胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基加入10%新生牛血清作為完全培養(yǎng)基，5% CO2和37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在對數(shù)生長期用胰酶消化后以5×105/孔接種到六孔板中，待生長到對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選取對數(shù)生長期的NIH3T3細(xì)胞，用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基清洗兩次；加入1.5ml的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基待用。對照組：直接加入0.5ml的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基；陰性對照組：配制0.5ml的只含lipo 2000的轉(zhuǎn)染液，孵育20min后加入待用的六孔板中；實(shí)驗(yàn)組：配制0.5ml的含有miR-29b和lipo 2000的轉(zhuǎn)染液，孵育20min后加入待用的六孔板中。孵育5～6小時后更換含有血清的培養(yǎng)基，48小時后提取總RNA。

1.3實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)Eastep?Super總RNA提取試劑盒說明書提取NIH3T3細(xì)胞的總RNA，用微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測RNA的濃度和純度。分別取1μg的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的cDNA稀釋成5倍的量待用。RT-qPCR反應(yīng)體系：9μl的SYBR Green Mix，1μl上游引物，1μl下游引物，2μl cDNA模板，補(bǔ)加高壓滅菌蒸餾水至總體積20μl。反應(yīng)條件，預(yù)變性：95℃，10min，擴(kuò)增條件：95℃，10s；55～65℃，20s；72℃，20s；40個循環(huán)；融解曲線：65～95℃，5s。其中Gapdh、mPer1和Egr2各自的退火溫度分別為56.9℃、62.5℃和62℃。而miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要用特定的RT引物，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA不需要稀釋。RT-qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上。以U6作為檢測的內(nèi)參基因。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析mPer1與Egr2基因的mRNA相對表達(dá)水平以2-△△Ct方法計(jì)算。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件分析，采用單因素方差分析法，當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-29b轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞前后細(xì)胞狀態(tài)的變化轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的狀態(tài)正常(見圖1)；轉(zhuǎn)染期的細(xì)胞空白對照組的細(xì)胞狀態(tài)正常(見圖2A)，陰性對照組(見圖2B)和實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組(見圖2C)的細(xì)胞都出現(xiàn)了明顯的死亡，觸角變短。

2.2miR-29b顯著抑制了NIH3T3細(xì)胞內(nèi)mPer1基因的表達(dá)以U6為內(nèi)參基因(銳博公司提供)，采用RT-qPCR法檢測空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組中miR-29b mRNA的相對表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組(29b)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加miR-29b轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞；陰性對照組(NC)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞；空白對照組(Blank)：正常生長的NIH3T3細(xì)胞。結(jié)果顯示，相對于空白對照組和陰性對照組，實(shí)驗(yàn)組miR-29b的相對表達(dá)明顯升高(P<0.001)，而兩個對照組則沒有顯著差異(見圖3)。其中空白對照組miR-29b的相對表達(dá)量為0.22，陰性對照組miR-29b的相對表達(dá)量為0.11，實(shí)驗(yàn)組miR-29b的相對表達(dá)量為1.04。

圖1轉(zhuǎn)染前NIH3T3細(xì)胞的狀態(tài)

Figure 1State NIH3T3 cells before transfection

注：A.為空白對照組;B.為陰性對照組;C.為實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組

圖2轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞的狀態(tài)

Figure 2State NIH3T3 cells after transfection

注：A.為空白對照組;B.為陰性對照組;C.為實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組

圖3miR-29b在NIH3T3細(xì)胞中的相對表達(dá)

Figure 3The relative expression of miR-29b in NIH3T3 cells

注：miR-29b的表達(dá)明顯升高(P<0.001)，其中Blank為空白對照組，NC為陰性對照組，29b為實(shí)驗(yàn)組

以Gapdh為內(nèi)參基因，RT-qPCR證實(shí)相對于空白對照組和陰性對照組，實(shí)驗(yàn)組mPer1的相對表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組之間沒有差異(見圖4)。其中空白對照組mPer1的相對表達(dá)量為1.07，陰性對照組mPer1的相對表達(dá)量為1.05，實(shí)驗(yàn)組mPer1的相對表達(dá)量為0.63。

圖4mPer1在NIH3T3細(xì)胞中的相對表達(dá)

Figure 4The relative expression of mPer1 in NIH3T3 cells

注：mPer1的表達(dá)明顯降低(P<0.05),其中Blank為空白對照組，NC為陰性對照組，29b為實(shí)驗(yàn)組

2.3miR-29b上調(diào)Egr2基因表達(dá)以Gapdh為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR法檢測陰性對照組、空白對照組和實(shí)驗(yàn)組Egr2基因的mRNA的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組(29b)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加miR-29b轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞；陰性對照組(NC)：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞；空白對照組(Blank)：正常生長的NIH3T3細(xì)胞。結(jié)果顯示，相對于空白對照組和陰性對照組，實(shí)驗(yàn)組Egr2的相對表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而兩個對照組之間則不存在顯著性差異(見圖5)。其中空白對照組Egr2的相對表達(dá)量為0.80，陰性對照組Egr2的相對表達(dá)量為0.96，實(shí)驗(yàn)組Egr2的相對表達(dá)量為1.45。

圖5Egr2在NIH3T3細(xì)胞中的相對表達(dá)

Figure 5The relative expression of Egr2 in NIH3T3 cells

注：Egr2的表達(dá)明顯升高(P<0.05),其中Blank為空白對照組，NC為陰性對照組，29b為實(shí)驗(yàn)組

3討論

miRNA是一類非編碼的小RNA分子，能在轉(zhuǎn)錄后水平上改變基因的表達(dá)[12]。最近的研究表明，miRNA能夠調(diào)控近日節(jié)律系統(tǒng)。miR-219能夠調(diào)控近日周期的長短和速度，敲除體內(nèi)miR-219能夠延長晝夜周期[13]。miR-132能夠調(diào)節(jié)近日鐘基因的表達(dá)和光誘導(dǎo)重置近日節(jié)律的過程[14]。這些研究結(jié)果表明，miRNA可以作為近日節(jié)律系統(tǒng)的一項(xiàng)重要的效應(yīng)器。miR-29s家族可以結(jié)合Per1的3′UTR區(qū)域來抑制Per1的表達(dá)[15]。同時已有報(bào)道證實(shí)mPer1也在動物代謝調(diào)節(jié)和生物發(fā)育及細(xì)胞分化方面扮演了重要角色[16]。

Egr2的表達(dá)受多個信號通路如Wnt、FGF等信號通路的調(diào)控[17]，進(jìn)而對動物脂肪細(xì)胞的分化及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響[18]。有研究報(bào)道，Egr2表達(dá)呈現(xiàn)出節(jié)律性，并且與近日節(jié)律基因Per2和Dbp的變化趨勢類似[11]且由于Egr2在中腦的發(fā)育過程中至關(guān)重要，而生物節(jié)律的中央調(diào)控位于下丘腦的SCN區(qū)域，加之二者所參與的生物學(xué)事件高度重合，由此可以推測，Per1和 Egr2之間可能存在一定的關(guān)系。但是Per1是通過何種機(jī)制來刺激Egr2的表達(dá)卻沒有研究。而近日節(jié)律基因的紊亂與某些細(xì)胞增殖與凋亡的發(fā)生息息相關(guān)，Per1作為核心的近日鐘基因能夠參與到該過程之中[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-29b轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞影響了Per1和Egr2的表達(dá)，具體表現(xiàn)為Per1的表達(dá)降低，而Egr2的表達(dá)升高。這提示miR-29b能上調(diào)Egr2的表達(dá)，而這種改變有可能是通過Per1來介導(dǎo)的。但這還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

4結(jié)論

本研究證實(shí)，通過miR-29b抑制NIH3T3細(xì)胞內(nèi)mPer1基因表達(dá)同時顯著上調(diào)Egr2的表達(dá)。該結(jié)果提示了miR-29b可通過影響Egr2基因表達(dá)的方式在諸多生理活動中發(fā)揮調(diào)控作用，這將有助于相關(guān)疾病的檢測、預(yù)防與治療，為病理性疾病的預(yù)防和治療提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Oike H,Oishi K,Kobori M.Nutrients,Clock Genes,and Chrononutrition[J].Current Nutrition Reports,2014,3(3):204-212.

[2]Mohammed S,Harrison D A.The clocks that time us are not the same:A theory of temporal diversity,task characteristics,and performance in teams [J].Organ Behav Hum Dec,2013,122(2):244-256.

[3]Albrecht,Urs.Timing to Perfection:The Biology of Central and Peripheral Circadian Clocks[J].Neuron,2012,74(2):246-260.

[4]Bae K,Jin X,Maywood ES,et al.Differential Functions of mPer1,mPer2,and mPer3 in the SCN Circadian Clock[J].Neuron,2001,30(2):525-536.

[5]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[6]Zhao Xiyan,Zhu Xueqiang,Cheng Shuting,et al.MiR-29a/b/c regulate human circadian gene hPER1 expression by targeting its 3′UTR[J].Acta Biochim Biophys Sin,2014,46 (4):313-317.

[7]Nagel R,Clijsters L,Agami R.The miRNA-192/194 cluster regulates the Period gene family and the circadian clock [J].The FEBS journal,2009,276(19):5447-5455.

[8]Shende V R,Neuendorff N,Earnest D J.Role of miR-142-3p in the post-transcriptional regulation of the clock gene Bmal1 in the mouse SCN [J].PloS one,2013,8(6):e65300.

[9]Weger N,Schlake T.Igf-I signalling controls the hair growth cycle and the differentiation of hair shafts [J].Invest Dermatol,2005,125(5):873-882.

[10] Shampa D,Jack E,Turman,Jr.Krox-20 gene expression:Influencing hindbrain-carniofacial developmental interaactions[J].Arch Histol Cytol,2005,68(4):227-234.

[11] Alvarez JD,Dechun Chen,Elizabeth Storer,et al.Non-cyclic and Developmental Stage- Specific Expression of Circadian Clock Proteins During Murine Spermatogenesis[J].Biology of Reproduction,2003,69(1):81-91.

[12] Cheng H-YM,Papp JW,Varlamova O,et al.microRNA modulation of circadian clock period and entrainment[J].Neuron,2007,54(5):813-829.

[13] Kocerha J,Faghihi M A,Lopez-toledano M A,et al.MicroRNA-219 modulates NMDA receptor-mediated neurobehavioral dysfunction [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(9):3507-3512.

[14] Alvarez-saavedra M,Antoun G,Yanagiya A,et al.miRNA-132 orchestrates chromatin remodeling and translational control of the circadian clock [J].Human molecular genetics,2011,20(4):731-751.

[15] Nicola Amodio,Marco Rossi,Lavinia Raimondi,et al.miR-29s:a family of epi-miRNAs with therapeutic implications in hematologic malignancies[J].Oncotarget,2015,6(15):12837-12861.

[16] Ansari N,Agathagelidis M,Lee C,et al.Differential maturation of circadian rhythms in clock gene proteins in the suprachiasmatic nucleus and the pars tuberalis during mouse ontogeny[J].The European journal of neuroscience,2009,29(3):477-489.

[17] Gabet Y,Baniwal SK ,Leclerc N,et al.Krox20/EGR2 deficiency accelerates cell growth and differentiation in the monocytic lineage and decreases bone mass[J].Blood,2010,116(19):3964-3971.

[18] Zhu C,Javier I,Bruce M,et al.Krox20 stimulates adipogenesis via C/EBPβ-dependent and -independent mechanisms[J].Cell Metab,2005,1(2):93-106.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31371180)；國家自然科學(xué)青年基金(3150035)

通訊作者：汪宇輝，Email:wangyuhui1972@163.com

【中圖分類號】R 392;R 393

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.003

(收稿日期：2016-01-19；編輯：母存培)

The effects of miR-29b expression change on mPer1 and Egr2 in NIH3T3 cells

XU Tao,HOU Wang,WANG Yuhui,et al

(Key Laboratory of Chronobiology,Ministry of Health (Sichuan University) ,West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of miR-29b on serum-induced immediate early gene Egr2 mRNA expression in NIH3T3 cells.MethodsNIH3T3 cells cultured in vitro were divided into experiment group,negative control group and blank control group.Experimental group transfected with miR-29b,negative control group idling,while the control group received no treatment.The expression of mPer1 and Egr2 were detected by RT-qPCR.ResultsThe experimental results show that mPer1 and Egr2 expressions were more obvious changes.Compared with the negative control group,the mRNA expression level of mPer1 and Egr2 were not obvious difference in the blank control group; but,the mRNA expression of mPer1 was reduced 42%,the mRNA expression of Egr2 was increased 49% in the experimental group.ConclusionmiR-29b can increase Egr2 expression,the approach is probably achieved by inhibiting circadian gene mPer1 expression in NIH3T3 cells.

【Key words】mPer1; mir-29b; Egr2; NIH3T3 cells