劉麗琦　周劍芳　魯健　李梓　曾曉旭　趙翔　王大燕　舒躍龍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，世界衛(wèi)生組織流感參比與研究合作中心

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流感H10亞型重配病毒在不同細胞生長能力的比較

劉麗琦周劍芳魯健李梓曾曉旭趙翔王大燕舒躍龍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，世界衛(wèi)生組織流感參比與研究合作中心

【摘要】目的評估兩株流感H10亞型重配病毒在不同細胞內(nèi)的生長特性，篩選可用于疫苗生產(chǎn)的細胞。 方法基于A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)病毒的表面基因，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建以高產(chǎn)PR8病毒為骨架的RG-H10N8(6+2)和RG-H10N1(7+1)兩種重配病毒，在SPF雞胚增殖病毒后，經(jīng)序列測定確認，以質(zhì)粒拯救RG-PR8病毒為對照，比較病毒在MDCK和Vero細胞上的生長敏感性；以相同MOI感染MDCK細胞后，比較病毒的生長特性。結(jié)果兩種流感H10重配病毒和RG-PR8病毒在MDCK細胞上均能檢測到病毒滴度，但是在Vero細胞上，RG-H10N8檢測不到病毒滴度，RG-H10N1和RG-PR8可以檢測到病毒滴度；用相同的MOI感染MDCK細胞后，RG-PR8生長能力強于兩種重配病毒，兩種重配病毒間差異不大。結(jié)論兩種流感H10重配病毒在MDCK細胞上生長能力較好，MDCK較Vero細胞對H10重配病毒更敏感，來源不同的NA會影響病毒在Vero細胞上的生長敏感性。

【主題詞】流感病毒；H10亞型；重配；生長特性

Fund program: National Science and Technology Major Project-Study on the cross species mechanism of new subtype influenza virus H7N9 (2014ZX10004002-001-003)

流感病毒在人群可造成季節(jié)性流感或流感大流行，接種疫苗是預(yù)防流感最有效的途徑。由于流感病毒容易變異，因此世界衛(wèi)生組織每年組織疫苗推薦會，以確定新的季節(jié)性流感疫苗株，同時篩選可能會造成流感大流行的動物源性流感病毒疫苗株。為了快速獲得有效高產(chǎn)的疫苗株，需要構(gòu)建含有表面蛋白HA和NA，內(nèi)部基因來源于經(jīng)實驗室長期篩選的在雞胚中高產(chǎn)并減毒的A/ PR/ 8/ 34 (H1N1) (簡稱PR8) 毒株，即6+2 重配策略，或僅替換表面HA基因，其余基因均使用PR8，即7+1重配。構(gòu)建重配病毒的方法包括經(jīng)典重配和反向遺傳技術(shù)，后者能夠快速獲得重配疫苗株。2013年我國首次發(fā)現(xiàn)人感染H10N8禽流感病例[1]，并在同一地區(qū)又接連發(fā)生兩例病例，在隨后的流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病毒來源于活禽市場[2]，因此快速獲得H10N8流感疫苗株是防控的重要手段。

本研究利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了兩種不同基因構(gòu)成的H10亞型重配病毒，兩種病毒分別感染MDCK和Vero細胞，比較病毒在兩種細胞上的生長敏感性，以及在敏感細胞上的生長特性，篩選出更適于病毒生長的細胞系，為未來生產(chǎn)細胞基質(zhì)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細胞和病毒MDCK和Vero細胞由國家流感中心保存，野生型病毒A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)(簡稱JX346)分離自首例人感染H10N8病例，由國家流感中心分離并保存。

1.2重配病毒的構(gòu)建利用國家流感中心反向遺傳技術(shù)平臺系統(tǒng)中的A/PR/8/34(簡稱PR8)骨架質(zhì)粒系統(tǒng)，按照之前發(fā)表的拯救方法[3]構(gòu)建重配病毒；同時制備重配的PR8病毒作為對照病毒；以上病毒均經(jīng)SPF雞胚傳代擴增一次用于本實驗。

1.3序列測定與分析為確認兩株H10重配病毒HA和NA基因來源，將病毒按照國家流感中心標準操作規(guī)程，使用德國Qiagen公司的RNeasy Mini Kit (74106)提取核酸RNA，使用科室引物庫中兩端帶有M13序列的正反向引物，用德國Qiagen公司one-step RT-PCR kit(210212)擴增HA和NA基因，擴增后基因經(jīng)Affymetrix公司的USB PCR產(chǎn)物純化酶純化后，使用3730xl測序儀測序，使用Lasergene(Version 7.1.0) 軟件拼接，使用BioEdit(Version 7.1.3.0)分析序列。

1.4病毒滴度測定

1.4.1細胞組織中病毒滴度測定：于96孔板中制備單層細胞，每孔100 μl PBS洗兩次，將病毒稀釋液以每孔100 μl接種于細胞上，每稀釋度4個復(fù)孔，置37℃的5%C02培養(yǎng)箱吸附1 h，棄病毒感染液，PBS洗兩次；每孔加100 μl病毒維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察CPE并取上清作HA血凝實驗。

1.4.2雞胚組織中病毒滴度測定：將病毒做稀釋，以每稀釋度100 μl l接種4枚雞胚，35℃培養(yǎng)48h后收尿囊液作HA血凝實驗；HA血凝實驗用1%豚鼠紅細胞測定，結(jié)果按Reed—Muench方法計算TCID50和EID50。

1.5生長曲線測定將病毒分別以MOI=0.1，0.01和0.001感染細胞，在感染后24 h、48 h和72 h分別收取感染細胞上清后，放置-80℃保存，所有樣本統(tǒng)一解凍后用1%豚鼠紅細胞測定HA血凝滴度，根據(jù)HA結(jié)果繪制生長曲線。

2結(jié)果

2.1重配病毒鑒定利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了包含JX346基因和A/PR/8/34病毒基因的2株重配病毒，一株重配病毒的表面基因HA和NA來自JX346，內(nèi)部基因來自PR8，命名為RG-H10N8；另外一株重配病毒的表面基因HA來自JX346，NA和內(nèi)部基因來自PR8，命名為RG-H10N1。

兩種重配病毒經(jīng)序列測定顯示，其HA基因與原始母本病毒比較氨基酸序列沒有差異，表明HA基因是來自母本病毒的H10亞型；NA基因經(jīng)序列測定顯示分別是NA1和NA8亞型，內(nèi)部基因來自PR8病毒，與預(yù)期相符，具體基因來源見圖1。

2.2在不同培養(yǎng)介質(zhì)上的病毒滴度測定為了檢測兩株病毒在不同培養(yǎng)介質(zhì)上的敏感性，將病毒分別感染Vero、MDCK和SPF雞胚，同時以RG-PR8病毒做對照，結(jié)果顯示在雞胚和MDCK上，三株病毒均能檢測到病毒滴度，在MDCK細胞上的滴度從低至高分別相差約10倍，依次是RG-H10N8

圖1　重配病毒基因來源示意圖Fig.1　Gene source sketch map of reassortant viruses

滴度Titer病毒VirusesRG-H10N8RG-H10N1PR8log10EID50/ml7.427.639.17log10TCID50/ml(V)/4.252.37log10TCID50/ml(M)5.876.787.73

注：“V” Vero 細胞；M：MDCK細胞；“/”：未檢測到病毒滴度；表中結(jié)果均是兩次檢測結(jié)果均值

Note： “V” Vero cell；M：MDCK Vero cell；“/”virus was not detected; Results in the table is the mean of the twice test

2.3病毒生長曲線上述病毒滴度測定結(jié)果顯示MDCK細胞較Vero細胞對病毒更敏感，為了進一步了解病毒在MDCK細胞上的生長情況，將病毒分別以不同的MOI感染MDCK細胞，從圖2中的結(jié)果可見三株病毒在不同的MOI感染后均呈現(xiàn)HA滴度隨時間增加的趨勢；在MOI=0.1和MOI=0.01感染時，在24 h時三株病毒HA滴度相差不大，雖然所有病毒感染48 h后滴度均明顯上升，72 h后滴度繼續(xù)上升，同時鏡下觀察細胞CPE較48 h明顯，但是兩株H10重配病毒的HA滴度在48 h和72 h時均明顯低于RG-PR8病毒，重配病毒之間差異不大；在MOI=0.001時，三株病毒HA滴度均較低，病毒之間HA滴度差異不大。

圖2　病毒以不同MOI感染MDCK細胞的生長曲線Fig.2　Growth curve at different MOI in MDCK cells

3討論

近年來，禽流感病毒感染人的病例時有發(fā)生，感染人類的病毒型別也不僅限于H5N1、H7N9和H9N2亞型[4，5，6]，2013年首次報道人感染H10N8病例后，2014年又有2例感染病例報道，因此構(gòu)建H10亞型流感病毒疫苗株，并選擇合適的培養(yǎng)介質(zhì)是疫情防控的重要技術(shù)儲備；WHO推薦采用傳代細胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建重配病毒作為流感大流行相關(guān)禽流感病毒儲備疫苗株，即構(gòu)建含有HA和NA或僅含有HA基因，其余基因來自高產(chǎn)的PR8的重配病毒。重配病毒可以感染細胞或雞胚制備疫苗，但雞胚作為疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)，可能引入外源性病毒污染，同時制備的疫苗產(chǎn)品均質(zhì)性差，因此選用合適的細胞生產(chǎn)疫苗是流感疫苗的發(fā)展趨勢，可使疫苗的抗原性更接近流行株；但不同的毒株對細胞的易感性不同，因此本研究就構(gòu)建的兩株H10重配病毒對MDCK和Vero細胞的易感性進行了研究，為未來研究細胞基質(zhì)疫苗奠定基礎(chǔ)。

本研究病毒感染細胞實驗結(jié)果表明，在感染MDCK細胞的實驗中，兩株H10重配病毒均易感，在MOI=0.1和MOI=0.01感染時，病毒能達到較高的滴度但是低于PR8病毒。已有文獻報道Vero細胞在流感病毒疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用[7]，但本研究結(jié)果顯示在Vero細胞上RG-H10N8檢測不到病毒滴度，可以檢測到RG-H10N1的滴度，序列分析顯示兩株H10重配病毒的HA基因完全相同，僅NA基因不同，說明NA的不同會影響毒株對細胞的感染能力；但RG-H10N1檢測到病毒滴度也明顯低于在MDCK細胞中的培養(yǎng)滴度，說明Vero細胞對H10重配病毒病毒不如MDCK細胞敏感，這與之前的文獻結(jié)論是一致的：即使是生長能力良好的PR8病毒在Vero細胞上也需要適應(yīng)性傳代以獲得高滴度產(chǎn)物[8]。

MDCK細胞是流感病毒分離培養(yǎng)的常用細胞，近年來用該細胞生產(chǎn)流感疫苗也獲得了較好的效果[9,10]，本研究的結(jié)果表明MDCK細胞較Vero細胞對流感H10亞型重配病毒更敏感，可進一步用于H10重配病毒細胞疫苗的培養(yǎng)基質(zhì)研究。

4參考文獻

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通信作者：舒躍龍，Email：yshu@cnic.org.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.020

基金項目：國家科技重大專項—H7N9等新型流感病毒跨種傳播機制研究(2014ZX10004002-001-003)

(收稿日期：2015-10-20)

Comparison of the growth characteristics of influenza subtype H10 reassortant viruses in different cells

LiuLiqi,ZhouJianfang,LuJian,LiZi,ZengXiaoxu,ZhaoXiang,WangDayan,ShuYuelong

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC,WHOCollaboratingCenterforReferenceandResearchonInfluenza,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:ShuYuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the cells for producing vaccine of avian influenza H10 subtype, the growth characteristics of influenza H10 subtype reassortant viruses in different cells (MDCK and Vero) were investigated. MethodsReassortant viruses, RG-H10N1(7+1) and RG-H10N8(6+2), between wild-type virus A/Jiangxi-donghu/346/2013(JXH10N8) and high-yielding virus A/ Puerto Rico/ 8/ 34(PR8) were constructed with reverse genetic system. Viruses were propagated in SPF embryonated chicken eggs. The growth characteristics of the two reassortant viruses were compared after inoculating MDCK and Vero cells respectively, with RG-PR8 as the control. Viral growth characteristics were studied at different MOI in MDCK cells. ResultsAll viruses could be detected TCID50in MDCK cells. RG-PR8 and RG-H10N1could be detected TCID50in Vero cells but not RG-H10N8. There were no significant difference in HA titer between the two reassortant viruses at the same MOI, but both reassortant viruses exhibited lower HA titers than that of PR8 in MDCK cells. ConclusionBoth influenza H10 subtype reassortant viruses grew better in MDCK cells. MDCK cells are more sensitive to the influenza H10 reassortant viruses, and NA from different subtypes could affect the grow capability of reassortant viruses in Vero cells.

【Key words】Influenza virus; H10 subtype; Reassortant virus; Growth characteristics