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315010， 寧波市第一醫(yī)院(朱小霞、朱紅明)；310016 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院(周強、程浩、韓睿)

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尖銳濕疣患者皮損中TLR7/9相關(guān)信號通路蛋白的表達

朱小霞周強程浩韓睿朱紅明

315010， 寧波市第一醫(yī)院(朱小霞、朱紅明)；310016 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院(周強、程浩、韓睿)

【摘要】目的探討TLR7/9及其信號通路在尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)免疫發(fā)病機制中的可能作用。方法采用免疫組織化學SP法檢測23例CA患者皮損TLR7/TLR9、IRF7和IRAK1的表達和分布情況，以13例邊緣帶正常皮膚的CA患者為對照，分別比較分析23例CA皮損與其中13例CA皮損邊緣正常皮膚，以及13例CA皮損與其邊緣正常皮膚中TLR7/TLR9、IRF7和IRAK1表達密度和陽性率的差異。結(jié)果TLR9在表皮角質(zhì)形成細胞和真皮乳頭層部分單核樣細胞胞漿內(nèi)表達；TLR7、IRF7、IRAK1表達陽性細胞主要位于真皮乳頭層，均為胞漿表達。尖銳濕疣患者皮損真皮乳頭層TLR9表達陽性細胞密度和陽性率均比邊緣正常皮膚明顯增高(P<0.05)；TLR7、IRF7、IRAK1表達陽性細胞密度和陽性率與邊緣正常皮膚無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論尖銳濕疣患者皮損中TLR9的表達水平上調(diào)，而TLR7、IRF7、IRAK1的表達水平未見明顯改變。推測：盡管尖銳濕疣皮損TLR9的表達上調(diào)，但TLR7/9下游通路未被有效激活，故而未能激活抗HPV免疫反應，進而HPV病毒清除困難，并可能與臨床上尖銳濕疣的易復發(fā)或遷延不愈有關(guān)。

【主題詞】尖銳濕疣；TLR7；TLR9；IRF7；IRAK1；乳頭狀瘤病毒，人

尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是由人類乳頭瘤病毒(HPV)感染引起的性傳播疾病，發(fā)病機制不甚清楚。已有的研究表明，尖銳濕疣的反復難治可能與患者機體免疫功能低下或免疫調(diào)節(jié)紊亂導致免疫失衡有關(guān)[1]。漿細胞樣樹突狀細胞(Plasmacytoid dendritic cells，pDC)是皮膚組織中抗病毒免疫反應的重要DC之一，其特異性表達高水平TLR7(Toll-like receptor 7)和TLR9[2]，通過pDC/TLR通路介導分泌大量I型干擾素(IFN)，發(fā)揮抗病毒作用。本研究擬通過免疫組化法檢測CA皮損中pDCs分泌的TLR7、TLR9及其信號通路中相關(guān)蛋白分子IRF7(Interferon Regulatory Factor 7)和IRAK1(Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1)的表達情況，探討pDC及其TLR7/9信號通路在CA發(fā)病機制中的可能作用。

1材料與方法

1.1臨床資料寧波市第一醫(yī)院和浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院于2012年10月至2013年8月收集的23例CA初發(fā)患者，符合2000年衛(wèi)生部疾病控制司制訂的CA診斷標準，且經(jīng)組織病理證實為CA患者，其中女性10例，男性13例，年齡21歲～42歲，病程1周～2月。23例CA患者中有13例皮損邊緣帶正常皮膚，分別以23例CA皮損和13例邊緣帶正常皮膚的CA皮損為觀察組，以13例邊緣正常皮膚作為對照。所有病例均無糖尿病和嚴重肝腎功能異常，無免疫缺陷病史，無合并使用免疫抑制劑的疾病。本研究已經(jīng)過相關(guān)倫理委員會審批及患者的知情同意。

1.2試劑TLR7鼠抗人單克隆抗體、TLR9鼠抗人單克隆抗體、IRF7鼠抗人單克隆抗體和IRAK1鼠抗人單克隆抗體均購自英國Abcam公司；即用型UltrasensitiveTMSP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色：取CA皮損組織，常規(guī)制成蠟塊和切片。分別以TLR7鼠抗人單克隆抗體、TLR9鼠抗人單克隆抗體、IRF7鼠抗人單克隆抗體和IRAK1鼠抗人單克隆抗體為一抗，按免疫組化S-P試劑盒說明書進行染色，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)代替一抗作為陰性對照。染色后的切片在顯微鏡下觀察并判斷結(jié)果。

1.3.2結(jié)果判斷：光鏡下細胞膜和(或)細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃或黃褐色顆粒的細胞為陽性細胞。陽性細胞密度=5個視野陽性細胞總數(shù)/5個視野總細胞數(shù)；陽性率=含陽性細胞的病例數(shù)/總病例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)M表示，兩組間比較用秩和檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

2結(jié)果

2.1CA皮損中TLR9的表達CA皮損真皮層有中等量炎癥細胞浸潤，主要位于乳頭層，以單核細胞為主，邊緣正常皮膚真皮層僅有少量炎癥細胞(見圖1)。比較23例CA皮損與其中13例CA皮損邊緣正常皮膚中TLR9的表達(見表1)，配對比較13例邊緣帶正常皮膚的CA皮損與其邊緣正常皮膚中TLR9的表達(見表2)，發(fā)現(xiàn)表皮角質(zhì)形成細胞胞漿內(nèi)可見TLR9陽性表達，棘層為主，但染色強度較弱。

1A：CA真皮乳頭層較多胞漿黃褐色單核樣細胞；1B：CA邊緣組織真皮乳頭層少量胞漿黃褐色細胞；1C： CA皮損表皮各層角質(zhì)形成細胞胞漿著棕黃色，棘層為主。圖1　TLR9在CA皮損和邊緣組織中的表達(SP×400)1A：More cytoplasmic brownish monocyte-like cells were observed in dermal papillary layer of CA lesions. 1B：Small number of cytoplasmic brownish monocyte-like cells were observed in papillary layer of CA normal borderline tissues. 1C：Many cytoplasmic brownish keratinocytes were observed in epidermis of CA, mainly in spinous layerFig.1　The expression of TLR9 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.2CA皮損中TLR7的表達TLR7陽性細胞少量表達于真皮乳頭層，胞漿著棕色，表皮層未見明顯陽性表達細胞(見圖2)。比較23例CA皮損與其中13例CA皮損邊緣正常皮膚中TLR7的表達(見表1)。配對比較13例CA皮損與其邊緣正常皮膚TLR7的表達(見表2)，23例CA皮損和13例CA皮損邊緣正常皮膚中TLR7陽性細胞密度無顯著性差異(P>0.05)。

2A：CA皮損真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞；2B：CA邊緣組織真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞圖2　TLR7在CA皮損和邊緣組織中的表達(SP×400)2A：Few of cytoplasmic brownish cells were observed in papillary layer of CA lesions. 2B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissuesFig.2　The expression of TLR7 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.3CA皮損中IRF7的表達IRF7陽性細胞少量表達于真皮乳頭層，胞漿著棕色，表皮層未見陽性表達細胞(見圖3)。比較23例CA皮損與其中13例CA皮損邊緣正常皮膚中IRF7的表達(見表1)。配對比較13例CA皮損與其邊緣正常皮膚IRF7的表達(見表2)，23例CA皮損和13例CA邊緣正常皮膚中IRF7陽性細胞密度無明顯差異(P>0.05)。

3A：CA皮損真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞；3B：CA邊緣組織真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞圖3　IRF7在CA皮損和邊緣組織中的表達(SP×400)3A：Few of cytoplasmic brownish cells were observed in papillary layer of CA lesions. 3B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissuesFig.3　The expression of IRF7 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.4CA皮損中IRAK1的表達IRAK1陽性細胞少量表達于真皮乳頭層，胞漿著棕色，表皮層未見陽性表達細胞(見圖4)。比較23例CA皮損與其中13例CA皮損邊緣正常皮膚中IRAK1的表達(見表1)，配對比較13例CA皮損與其邊緣正常皮膚IRAK1的表達(見表2)。23例CA皮損和13例邊緣正常皮膚中IRAK1陽性細胞密度無顯著性差異(P>0.05)。

4A：CA皮損真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞；4B：CA邊緣組織真皮乳頭層偶見胞漿著棕色細胞圖4　IRAK1在CA皮損和邊緣組織中的表達(SP×400)4A：Few of cytoplasmic brownish brown cells were observed in papillary layer of CA lesions. 4B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissues. Fig.4　The expression of IRAK1 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

3討論

CA是由HPV感染引起的皮膚黏膜疾病，機體不能建立針對HPV感染有效的免疫應答是CA反復難治愈的主要原因。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的模式識別受體，在抗病毒的信號轉(zhuǎn)導通路和免疫應答中發(fā)揮重要作用[3]。迄今為止，在人類已發(fā)現(xiàn)10余種TLR，包括TLR1～10[4]。其中TLR7和TLR9定位于細胞內(nèi)，主要識別病毒核酸，它們可通過MyD88依賴途徑，引發(fā)信號轉(zhuǎn)導，活化NF-κB或干擾素調(diào)節(jié)因子家族(IRF7)，調(diào)節(jié)炎性細胞因子和I型IFN的表達，從而產(chǎn)生抗病毒反應[5]。pDC是皮膚組織中免疫反應的重要細胞之一，表達高水平的TLR7和TLR9，在抗病毒免疫反應中起重要作用。 pDC中參與TLR7/9信號傳導通路的主要分子有IRAK1和IRF7等[6]。在某些病毒如單純皰疹病毒[7]等感染過程中，pDC通過TLR信號傳導通路介導分泌大量I型IFN來抑制病毒復制。與此相反，某些病毒如HPV-16[8]感染過程中，TLR信號通路未能有效激活，從而不能建立有效的抗病毒免疫反應，引起病毒的持續(xù)感染。

本課題組已有的研究[9]發(fā)現(xiàn)CA皮損中pDC密度和陽性率高于邊緣正常皮膚，推測HPV感染影響局部粘膜的pDC數(shù)量，pDC可能參與了機體局部抗HPV感染的免疫反應。本研究發(fā)現(xiàn)CA患者皮損真皮層TLR9陽性細胞密度和陽性率高于邊緣正常皮膚，說明隨著pDC數(shù)量增加，TLR9水平上調(diào)，提示pDC分泌TLR9功能未受抑制。此外研究發(fā)現(xiàn)CA皮損表皮各層角質(zhì)形成細胞內(nèi)可見TLR9陽性表達，棘層為主，與茅曉紅等[10]的研究結(jié)果一致，表明角質(zhì)形成細胞亦可表達TLR9，在抗病毒免疫中也起一定作用。研究還發(fā)現(xiàn)CA皮損中TLR7陽性細胞密度和陽性率與邊緣正常皮膚無顯著性差異，提示CA皮損中TLR7未上調(diào)，說明pDC分泌TLR7功能未被明顯激活，推測HPV感染可能抑制了pDC部分功能，與CA的發(fā)病和持續(xù)感染有關(guān)。用TLR7激動劑(如咪喹莫特)治療CA有效提示TLR7功能激活有助于病毒清除。本研究還顯示CA皮損中IRF7和IRAK1陽性細胞密度和陽性率與皮損邊緣正常皮膚無顯著性差異，提示即便TLR9表達上調(diào)但TLR7/9下游信號通路未能有效激活，導致pDC不能建立有效的抗HPV病毒免疫反應，從而引起HPV的持續(xù)感染及臨床上CA的復發(fā)。HPV如何影響pDC的功能及其TLR通路有待進一步研究。

表1　23例CA皮損與13例邊緣正常皮膚中陽性細胞密度和陽性率比較

標注(note)：M：中位數(shù)(median)U：秩和檢驗Z值(rank sum test Z value)

表2　13例CA皮損與其邊緣正常皮膚中陽性細胞密度和陽性率比較

4參考文獻

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[9]朱小霞, 周強, 程浩，等. 尖銳濕疣患者皮損中朗格漢斯細胞和漿細胞樣樹突狀細胞的檢測.中華皮膚科雜志, 2015,48: 343-345. doi: 10.3760/cma. j.issn.0412-4030.

[10]茅曉紅, 張巍巍, 陳賢禎，等. Toll樣受體在尖銳濕疣皮損中的表達.中華皮膚科雜志, 2010,43:637-640. doi: 10.3760/cma. j.issn.0412-4030.

通信作者：程浩， Email：hz_chenghao@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.007

基金項目：寧波市自然科學基金(2012A610218)；寧波市衛(wèi)生局科研項目(2011B04)；國家自然科學基金(81301375)

(收稿日期：2015-10-28))

The expression of TLR7/9 and associated signaling pathway proteins in condyloma accuminatum lesions

ZhuXiaoxia，ZhouQiang，ChengHao，HanRui，ZhuHongming

NingboFirstHospital,Ningbo, 315010,Zhejiang,China(ZhuXX,ZhuHM)；SirRunRunShawHospital,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China(ZhouQ,ChengH,HanR)Correspondingauthor:ChengHao,Email:hz_chenghao@126.com

【Abstract】ObjectiveTo detect the expressions of TLR7/9, IRF7 and IRAK1 in condyloma accuminatum (CA) lesions and to investigate their possible roles in pathogenesis of CA. MethodsThe expressions of TLR7/9, IRF7 and IRAK1 in 23 cases of CA lesions were tested by immunohistochemistry. ResultsTLR9-positive cells were observed both in the epidermis and in the papillary layer of dermis. The density and positive rate of TLR9-positive cells in the papillary layer of CA lesions were significantly higher than those in their normal borderline tissues (P<0.05). TLR7-positive cells, IRF7-positive cells and IRAK1-positive cells were observed mostly in the papillary layer of dermis. There were no obvious difference of their density and positive rate between the CA lesions and their normal borderline tissues (P>0.05). ConclusionsThe TLR9 expression was up-regulated，while the TLR7, IRF7 and IRAK1 expression were un-changed in CA lesions. Our results suggested that the downstream of TLR7/9 signaling pathways in CA could not be provoked despite the up-regulation of TLR9 expression, which lead to the difficulty to HPV removal and the recurrence of CA.

【Key words】Condyloma accuminatum；TLR7；TLR9；IRF7；IRAK1； Papillomavirus； human Fund programs: The Natural Science Foundation of Ningbo(No. 2012A610218); Scientific research project of Ningbo Municipal Health Bureau(No. 2011B04); The National Natural Science Foundation of China(No. 81301375)