寇美玲　朱建波　楊恒　肖雷　王金萍　苗海生　王靜林　李華春

650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點實驗室

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·論著·

云南庫蠓中版納病毒的首次分離及鑒定

寇美玲朱建波楊恒肖雷王金萍苗海生王靜林李華春

650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點實驗室

【摘要】目的了解云南庫蠓攜帶病毒及感染情況。方法2011年9月-11月在云南曲靖市采集庫蠓、牛血清及豬血清標本；庫蠓上清液接種于C6/36細胞進行病毒分離；對可疑分離物進行分子生物學(xué)鑒定；采用微量中和試驗檢測牛、豬血清病毒抗體。結(jié)果捕獲到的18 160只庫蠓中，短跗庫蠓8 300只(45.7%)，琉球庫蠓7 100只(39.1%)。分離到2株陽性分離物，命名為SC093和SC233。經(jīng)鑒定，其VP2、VP4、VP8序列與版納病毒中國株(AF134526)核苷酸序列同源性為99.0%，屬于版納病毒；1份牛血清與SC093和SC233病毒株中和抗體滴度分別為160和40,陽性率為0.5%(1/200)；10份豬血清與SC093和SC233病毒中和滴度分別為80-320和20-80,陽性率為1.7%(10/535)。結(jié)論所分離的SC093和SC233病毒株經(jīng)鑒定為版納病毒，并能引起豬和牛的感染，這是首次從庫蠓中分離到版納病毒。

【主題詞】庫蠓；版納病毒；分離；鑒定

Fund programs: Important cattle and sheep arbovirus disease prevention and control key technology research and application(201303035); Applied basic research projects of the youth science fund in Yunnan province(2015FD064)

云南省曲靖市師宗縣氣候溫和，立體氣候明顯，年平均相對濕度在80%左右，適合各類吸血節(jié)肢動物生存繁殖，利于蠓媒病毒的存在和傳播。1979年，我國首次在云南省師宗縣分離到藍舌病病毒[1]。近年來，一些蠓媒病毒在世界各地動物中引起嚴重的傳染病，甚至導(dǎo)致大量動物的死亡以及巨大的經(jīng)濟損失，成為日益嚴重的世界公共衛(wèi)生問題。為了進一步了解師宗縣庫蠓種類、攜帶病毒和當?shù)貏游锔腥厩闆r，我們于2011年9月-11月在師宗縣監(jiān)控牛場采集庫蠓標本、牛血清標本,以及在麒麟?yún)^(qū)及陸良縣采集豬血清標本，進行蠓傳蟲媒病毒分類鑒定及其動物感染調(diào)查，結(jié)果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1雞胚、細胞及培養(yǎng)基:10日齡雞胚購至小哨雞場；金黃地鼠腎細胞(BHK-21)、白紋伊蚊卵細胞(C6/36)為本實驗室保存；細胞用培養(yǎng)基M199、MEM 為云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點實驗室自行配制。1.1.2試劑及儀器:混合酶-DNase購自Ambion公司，Benzonase購自Novagen公司，RNase購自美國Promega公司；核酸提取試劑盒Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0及Klenow Fragment試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；cDNA合成試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自日本TaKaRa公司；SuperScript II購自美國Invitrogen公司；pGem T-easyX載體購自Invitrogen公司；引物K-8N(GACCATCTAGCGACCTCCACNNNNN)及引物K(GACCATCTAGCGACCTCCAC)由上海生物工程公司合成；PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；310DNA測序儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2標本采集

1.2.1庫蠓標本采集:2011年9月—11月，夜間23：00-06：00，共采集庫蠓標本12次。在云南省曲靖市師宗縣藍舌病監(jiān)控牛場用改裝的捕蚊器捕捉庫蠓，次日清晨把蚊籠放入-20℃冰箱20 min，根據(jù)庫蠓形態(tài)學(xué)特征[2]在顯微鏡下進行分類鑒定，40～50只/組放入凍存管中，編號登記，迅速凍存于液氮罐中。1.2.2動物血清標本采集:2011年8月—11月，在云南省曲靖市師宗縣藍舌病監(jiān)控牛場采集牛全血，在曲靖麒麟?yún)^(qū)及陸良縣豬場采集豬全血，取血后37℃讓血液凝固 1 到 2 h(不加抗凝劑)；4℃ 冰箱過夜；當血清自然析出后，4℃離心3 000 r/min 10 min，將血清移至另一干凈試管，分裝成小份，編號儲藏在-80℃。

1.3蠓標本處理、病毒分離和鑒定

1.3.1庫蠓標本處理和病毒分離:從液氮罐中取出庫蠓凍存管，將庫蠓標本對應(yīng)編號放入潔凈1.5 ml離心管中，用無血清液Eagle(含1%雙抗、1%谷氨酰胺) 清洗庫蠓標本2次，1 500 r/min離心10 min，棄上清。置庫蠓于研缽，加入2 ml M199細胞維持液研磨成勻漿，4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液100 μl接種至長成70%～80%單層的C6/36細胞試管，25℃吸附1 h后棄去細胞管內(nèi)液體，加入2 ml含2%小牛血清的細胞維持液，設(shè)置2支正常細胞對照管，共同置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE變化情況。舍棄連續(xù)盲傳三代后仍不出現(xiàn)CPE的細胞管，出現(xiàn)CPE的細胞管連續(xù)傳代使之出現(xiàn)規(guī)律病變，再傳一代擴增病毒分裝-85℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒鑒定

1.3.2.1病毒液的處理及核酸的提取:向出現(xiàn)規(guī)律CPE后的1代細胞上清中加入混合酶，處理外源核酸[3]。按核酸提取試劑盒說明書提取病毒總核酸。

1.3.2.2cDNA合成及RT-PCR 利用cDNA合成試劑盒，引物K-8N[4]等合成cDNA第一鏈。取5 μl模板，采用引物 K進行PCR擴增，擴增體系為50 μl，依次加入下列試劑，使最終濃度達到5 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNRPs、1×PCR Gold buffer、 0.8 mmol/L primer K、0.8 μmol/L引物 K及0.94U AmpliTaq Gold，充分混勻。95℃預(yù)變性5 min;95℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，33個循環(huán);72℃ 7 min。1%瓊脂糖電泳檢查擴增條帶。回收大于500 bp片段PCR產(chǎn)物，克隆入載體,本實驗室測序儀進行測序，將序列進行Blast比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，MEGA 3.1 軟件采用Neighbour-joining (NJ) 方法的進化樹繪制，Bootstrap值為1 000。

1.4雞胚感染實驗取0.1 ml出現(xiàn)規(guī)律CPE后1代細胞上清，靜脈接種雞胚，逐日觀察，48 h內(nèi)死亡的雞胚為非特異性死亡，48 h后死亡雞胚按第1天算起，登記死亡天數(shù)，并將死胚放于4℃冰箱內(nèi)保存，待收胚全部完畢，剪破殼膜、尿囊膜、羊膜，取出胚體觀察記錄。

A：C6/36細胞對照(C6/36 Cell Control)B：接種SC093的C6/36細胞(SC093 4d Post-Infection)C：SC233感染后的C6/36細胞(SC233 4d Post-Infection)圖1　云南省師宗縣庫蠓分離物SC093和SC233對C6/36 細胞的致病變作用Fig.1　CPE caused by Culicoides isolates from Shizong County of Yunnan province on C6/36 cells

1.5微量中和試驗血清中抽出535份豬血清、200份牛血清，按Karber方法計算出TCID50/50 μl[5], 參照國標《藍舌病微量血清中和試驗及病毒分離和鑒定方法》(GB/T180089-2000)方法進行[6]。

2結(jié)果

2.1標本采集2011年9月-11月云南省曲靖市師宗縣藍舌病監(jiān)控牛場共采集到庫蠓18 160只，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類鑒定，短跗庫蠓有8 300只，琉球庫蠓有7 100只，分別占采集庫蠓標本總數(shù)的45.7%和39.1%，提示這兩種庫蠓為該地優(yōu)勢蠓種，還有少數(shù)東方庫蠓、連斑庫蠓、荒川庫蠓等。

2.2病毒分離采集到的所有蠓標本分454批處理，離心上清接種C6/36細胞進行病毒分離，獲得2株可疑分離物SC093和SC233，這兩株可疑分離物在C6/36細胞上產(chǎn)生規(guī)律細胞病變，病變時間分別是4～5 d、2～3 d，細胞病變特點主要表現(xiàn)為聚集、破碎、脫落(圖1)；在BHK-21細胞上不產(chǎn)生細胞病變。

2.3病毒分子生物學(xué)鑒定采用隨機RT-PCR對兩株可疑分離物進行擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)彌散條帶。切膠純化大于500 bp片段的PCR產(chǎn)物，克隆入pGem T-easyX載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后隨機選取SC093、SC233各6個克隆進行測序，對獲得序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)SC233株病毒6個克隆中有5個[VP2基因3個(719 nt，754 nt,693 nt)、VP8(457 nt)和VP4(625 nt)基因各1個]，SC093株病毒有1個[VP2基因(745 nt)]克隆序列與版納病毒核苷酸序列的同源性在81%(EU265684)-99%(AF134528)之間。進一步對SC093和SC233兩株新病毒VP2基因部分序列(2301-2900)進行分析，結(jié)果顯示兩株新分離病毒核苷酸同源性為100%；新分離的2 株病毒與東南亞雙鏈RNA病毒屬病毒繪制基因遺傳進化樹顯示：2 株新分離病毒與8株版納病毒處于同一個進化分支，提示云南師宗縣2株可疑分離物SC093和SC233為版納病毒(見圖2)。

圖2　云南省師宗縣新分離病毒株SC093和SC233 VP2基因(2 301-2 900)600 nt核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2　Phylogenetic tree based on 600 nt of the VP2 (2 301-2 900) of SC093 and SC233 viruses isolated from Shizong County of Yunnan Province, China Abbreviations are as follows: BAV: Banna virus；KDV: Kappdio virus; LNV: Liaoning virus.

2.4病毒對雞胚的感染性將SC093和SC233兩株病毒分別接種10日齡雞胚7枚，兩毒株分別在接種雞胚后計算天數(shù)的第4天、第6天收胚。收胚后觀察到：雞胚全身性出血(圖3)，提示兩株新分離版納病毒對雞胚有致病性。

A：SC233毒株接種雞胚4天后出血情況; B：SC093毒株接種雞胚6天后出血情況； C：對照組接種M199 9天后A: 4 days after inoculated with SC233 virus；B: 6 days after inoculated with SC093 virus；C: 6 days after inoculated with M199圖3　云南師宗縣兩株新分離版納病毒SC093和SC233感染雞胚結(jié)果Fig.3　Hemorrhages of chicken embryo inoculated with Banna virus

2.3動物血清檢測結(jié)果在曲靖市麒麟?yún)^(qū)、陸良等牛場和豬場共采集到牛血清200份、豬血清535份，對這些血清樣本進行微量中和實驗檢測新分離版納病毒中和抗體，結(jié)果顯示牛血清版納病毒抗體陽性1份，陽性率為0.5%；曲靖市麒麟?yún)^(qū)豬場采集豬血清版納病毒抗體陽性8份，陸良縣豬場采集豬血清版納病毒抗體陽性2份，兩地豬場豬血清陽性率為1.7%；檢測陽性牛血清標本抗SC093和SC233病毒中和抗體滴度分別為160和40；豬血清標本抗 SC093和SC233病毒中和抗體滴度為80-320、20-80。

3討論

1987 年，版納病毒首次從中國云南西雙版納的腦炎患者中分離到[6]。隨后在當?shù)夭幻髟虬l(fā)熱患者和腦炎患者血清標本、蚊蟲、豬和牛標本內(nèi)分離到數(shù)十株版納病毒[6,7]。近年來在我國多個省區(qū)以及在越南、印度尼西亞等東南亞國家蚊蟲中也多次分離到該類病毒[8,9]。本研究從師宗庫蠓中分離到2株僅在C6/36細胞上產(chǎn)生明顯細胞病變的病毒，通過進一步的分子生物鑒定，獲得3個基因片段6條序列，這些片段序列均與版納病毒中國分離株同源性最高達到99%，遺傳進化結(jié)果也顯示本次新分離的2株病毒與版納病毒處于同一個進化分支，表明它們親緣關(guān)系較為密切，提示云南師宗縣2株新分離病毒SC093和SC233為版納病毒，這是首次從云南省庫蠓中分離到版納病毒，庫蠓究竟是偶然感染版納病毒還是可作為版納病毒的傳播媒介，尚需進一步研究。2株病毒是通過隨機引物擴增克隆鑒定為版納病毒，對該病毒的進一步研究需要設(shè)計其特異性引物，說明分節(jié)段版納病毒的帶型,擴增全基因序列等等。庫蠓樣品的鑒定過程主要是通過形態(tài)學(xué)的方法進行，對樣品的采集及保存就需要較高的要求，下一步需要尋求更有效可靠的方法進行種屬鑒定。

版納病毒為東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬(Seadomavirus)的病毒，該屬病毒目前包括三種病毒，版納病毒(Banna virus，BAV)、Kadipiro病毒(KDV)和遼寧病毒(Liaoning virus，LNV)，其PAGE 電泳帶型為12 條帶，具有12 條帶的病毒還有在歐洲和美洲科羅拉多蜱媒熱病毒(Colorado Tick Fever Virus，CTFV)，該病毒能引起人類嚴重腦炎[10]。版納病毒是該屬病毒中惟一一種從人的血清標本中分離并與人的發(fā)熱和腦炎有關(guān)的病毒，感染BAV的患者顯示出流感樣癥狀，疲乏、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱，嚴重者可引起腦炎[11,12]。本次從云南省師宗縣庫蠓中分離到版納病毒，該病毒能引起雞胚全身性出血，提示兩株新分離版納病毒對雞胚有致病性。同時在當?shù)夭杉Ｑ搴拓i血清中存在版納病毒中和抗體，抗體滴度高達1:320，提示在當?shù)嘏：拓i等家畜動物中存在著版納病毒感染的狀況，約454組庫蠓樣品中僅分離到2株版納病毒，分離率為0.44%，豬、牛血清版納病毒抗體陽性率分別為1.7%、0.5%，提示二者之間存在感染相關(guān)性，而版納病毒是否是引起當?shù)丶倚蟛幻髟騽游锛膊〉牟≡w，還需要對其致病性、流行病學(xué)等方面進行更深入的調(diào)查研究[13，14]。

4參考文獻

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通信作者：李華春，Email: li_huachun@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.02546450.2016.01.001

基金項目：重要牛羊蟲媒病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用(201303035);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目青年基金(2015FD064)

(收稿日期：2015-06-02)

First isolation and identification of Banna virus fromCulicoidespools in Yunnan

KouMeiling，ZhuJianbo，YangHeng，XiaoLei，WangJinping，MiaoHaisheng，WangJinglin，LiHuachun

YunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,YunnanTropicalandSubtropicalAnimalVirusDiseaseLaboratory,Kunming650224,ChinaCorrespondingauthor:LiHuachun,Email:li_huachun@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo understand the virus-carrying status and infection condition of Culicoides in Yunnan province. MethodsCulicoides, cattle serum samples and pig serum samples were collected in Qujing City in Yunnan province from Sep. to Nov. in 2011; the supernatant of Culicoides was inoculated in C6/36 cells to isolate virus. Suspected isolates were identified by molecular biology techniques and titers of virus antibodies in pigs and cattles serum samples were tested by VN. Results8 300 short tarsal Culicoides(8 300/18 160) and 7 100 Ryukyu Culicoides (7 100/18 160) were identified among 18 160 Culicoides specimens. Two suspected virus strains were isolated and designated as SC093 and SC233. The nucleotide sequence homology of VP2, VP4 and VP8 sequences with Banna virus Chinese strain (Accession number: AF134526) is up to 99%. 1 out of 200(1/200) cattle serum samples was antibody positive against Banna virus with 0.5% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive cattle serum were 160 and 40.10 out of 535(10/535) pig serum samples were antibody positive against Banna virus with 1.7% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive pig serum samples were 80-320 and 20-80 respectively. ConclusionsThe SC093 and SC233 virus strains isolated from Shizong were identified to be Banna virus and it could cause infection in pigs and cattles. This is the first report that Banna virus was isolated from Culicoides.

【Key words】Culicoides; Banna virus; Isolation; Identification