孫麗娜　李川　劉洋　李德新　梁米芳

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·技術(shù)方法·

易錯PCR提高人源抗狂犬病毒單鏈抗體的親和力

孫麗娜李川劉洋李德新梁米芳

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

【摘要】目的通過易錯PCR技術(shù)提高1株人源抗狂犬病毒單鏈抗體RV08的親和力。方法 采用Agilent公司GeneMorph II Random Mutagenesis Kit對RV08輕、重鏈可變區(qū)進行易錯PCR擴增，隨機引入突變，通過單鏈抗體(Single-chain antibody fragment ScFv)噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)構(gòu)建隨機突變抗體文庫，經(jīng)狂犬病毒顆粒aG株固相富集篩選，通過ELISA和IFA鑒定陽性抗體克隆并進行序列測定。利用IgG表達載體VH/VK雙質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞實現(xiàn)IgG抗體的分泌型表達，通過非競爭ELISA測定突變抗體親和力。結(jié)果RV08隨機突變抗體庫的庫容為6×106 cfu/ml，目的基因插入率為100%。重鏈序列突變頻率約為0.95%，輕鏈序列突變頻率約為1.2%，最后獲得5株高親和力的抗體突變株，其中3株抗體HL46、HL2和HL37親和力分別為原始克隆RV08的1.79倍、1.47倍和1.23倍。結(jié)論易錯PCR技術(shù)與噬菌體抗體庫技術(shù)相結(jié)合使得抗體親和力獲得明顯提高，為抗體的體外親和力成熟提供了參考方法。

【主題詞】狂犬病毒；單鏈抗體；親和力

Fund programs: State Project For Essential Drug Research and Development(2014ZX09201041004,2013ZX09304103001006)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒引起的急性傳染病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World health organization, WHO)推薦的處理原則，III級暴露應(yīng)立即處理傷口并注射抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin，RIG)，隨后接種狂犬病疫苗[2]。由于RIG具有副反應(yīng)，產(chǎn)品成本高，供應(yīng)量有限并且存在潛在的血源性感染等缺陷，因此基因工程抗體是取代RIG用于狂犬病的暴露后預(yù)防的新方向。近年來關(guān)于人源抗狂犬病毒單克隆抗體國內(nèi)外已有很多報道，但對于抗狂犬病毒人源單抗的親和力成熟研究鮮有報道，抗體的功能特性與親和力高低密切相關(guān)，抗體親和力改造也是抗體工程需要解決和發(fā)展的重要技術(shù)之一。2012年研究組運用噬菌體表面展示技術(shù)，在國際上首次獲得5株針對狂犬病毒糖蛋白Ⅱ號抗原位點的重組人源中和單抗[3]，并在此研究基礎(chǔ)上，擴大庫容量和篩選規(guī)模，獲得了6株中和抗體[4]。本研究采用易錯PCR技術(shù)對狂犬病毒糖蛋白II號表位人源單抗RV08輕重鏈可變區(qū)進行隨機突變，通過scFv噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)構(gòu)建隨機突變抗體文庫，對RV08進行親和力改造，旨在提高抗體親和力實現(xiàn)抗狂犬病毒抗體制劑成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1材料與方法

1.1細胞、載體、病毒293T細胞、BHK-21細胞和昆蟲細胞Sf9購自美國菌種保藏中心(ATCC)。噬菌體抗體庫建庫載體為 pHAL14[5]?？袢《綼G株由中國疾控制中心病毒病所狂犬病室提供，狂犬病毒糖蛋白抗原由病毒病所出血熱室構(gòu)建表達[6]。

1.2抗體與試劑狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體RV08由本室研制[3]；對照抗體為抗?jié)h坦病毒核蛋白人源單抗H34，由本室表達并保存。易錯PCR試劑盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit購自美國Agilent公司的。胰酶、聚乙二醇(PEG)、轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI)購自美國Sigma公司。

1.3易錯PCR擴增RV08輕重鏈可變區(qū)基因根據(jù)單鏈抗體RV08重鏈序列，設(shè)計特異正向引物：5′-CCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAG-3′，根據(jù)單鏈抗體RV08輕鏈序列，設(shè)計特異反向引物：5′-TTGCGGCCGCAGAGGACGGTGGGA-3′。采用Agilent公司的易錯PCR試劑盒(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)以2 μl含有抗狂犬病毒糖蛋白單抗RV08輕重鏈基因的重組質(zhì)粒pcom3b-RV08 為模板，進行易錯PCR擴增。易錯PCR技術(shù)關(guān)鍵要控制目的基因突變頻率，根據(jù)試劑盒提供的突變頻率條件如表1：

為了獲得理想的突變效果，本研究將突變頻率控制在9～12 bp/Kb范圍內(nèi)，根據(jù)突變頻率要求，易錯PCR反應(yīng)條件如下：采用50 μl反應(yīng)體系，模板按實際擴增目的片段模板50 ng每個反應(yīng)添加，而非以整個RV08單鏈抗體質(zhì)粒的濃度計算，此外分別加入Mutazyme II reaction buffer，40 mmol/L dNTP mix (200 μmol/L each final)，正向反向引物(250 ng/ μl)，Mutazyme II DNA polymerase (2.5 U/ μl)，將反應(yīng)液混合均勻，PCR的反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃1 min，擴增30個循環(huán)，之后72 ℃延伸10 min。以此純化后的PCR產(chǎn)物作為下一輪PCR的模板，重復(fù)完成6輪易錯PCR。

表1　易錯PCR突變條件及頻率

1.4隨機突變抗體庫的構(gòu)建及驗證以pHAL4為建庫載體，與易錯PCR擴增獲得的RV08單鏈抗體基因VH-linker-VL分別經(jīng)NcoI和NotI雙酶切后，二者經(jīng)T4 DNA連接酶連接，電轉(zhuǎn)化XLI-Blue MRF感受態(tài)細胞，涂于含有氨芐青霉素的LB平皿，計菌落數(shù)，按每ml抗體庫所含的克隆數(shù)計算庫容量。隨機挑取10個克隆，測序檢測轉(zhuǎn)化效率并分析突變率，詳細建庫方法參考文獻[5,6]。

1.5隨機突變抗體庫的富集篩選及單鏈抗體的誘導(dǎo)表達用 0.1 mol/L NaHCO3(pH8.6) 溶液將狂犬病毒aG株4 ℃包被過夜，用MPBST(PBS 加入1%脫脂奶和 0.05% Tween-20)封閉包被孔室溫孵育2 h，之后用PBST洗滌3遍。向其中加入10 cfu/ml噬菌體抗體庫，室溫孵育2 h。移去上清，加100 μl 10 μg/ml的胰酶洗脫。洗脫下來的噬菌體感染新鮮的XLI-Blue菌液(OD600=0.5)，經(jīng)輔助噬菌體包裝后進行下一輪篩選，如此反復(fù)3次后，隨機挑選單克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達ScFv。具體富集方法及ScFv抗體的誘導(dǎo)表達按文獻進行[5,7]。

1.6單鏈抗體的 ELISA 檢測向包被有狂犬病毒aG顆粒的酶標(biāo)板中加入單鏈抗體原核誘導(dǎo)表達上清，37 ℃孵育1 h；PBST洗板5遍后，加入anti-myc 鼠抗體(美國 Sigma)，37 ℃孵育1 h；洗板后加入抗鼠酶標(biāo)IgG全抗，37 ℃孵育1 h后顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)后通過酶標(biāo)儀測吸光度值，判定抗狂犬病毒scFv陽性克隆。陽性克隆測序后pubmed基因庫中序列比較，獲得抗體輕重鏈型別。

1.7IgG抗體表達純化scFv抗體陽性克隆經(jīng)測序后參照V-Base 2數(shù)據(jù)庫比對分析，將獲得的scFv抗體輕重鏈基因分別克隆入VH/VK全抗體表達載體[7]，采用轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI)瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后收集上清，采用 Amersham 公司的 Protein-A 親和層析柱直接純化表達上清。

1.8非競爭ELISA法親和力測定將純化的狂犬病毒aG株顆粒按5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、0.625 μg/ml的濃度包被酶標(biāo)板，純化待測抗體從1.8 mg/L起進行2倍稀釋。具體操作和結(jié)果判定參考文獻[3,8]。

2結(jié)果

2.1隨機突變抗體庫的構(gòu)建及驗證通過DNAStar MegAlign 對RV08突變體的突變位點進行比對顯示，輕鏈序列和重鏈序列的實際的突變頻率有一些差異，輕鏈的突變頻率約為1.2%，重鏈的突變頻率約為0.95%，二者均已達到構(gòu)建突變抗體文庫的預(yù)期要求。

2.2隨機突變抗體庫的富集篩選用狂犬病毒aG株進行富集篩選，3輪富集后隨機挑取800個克隆，用狂犬病毒aG抗原ELISA檢測scFv誘導(dǎo)表達上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3輪富集篩選洗脫庫容量逐輪遞增，這表明特異性結(jié)合重組單鏈?zhǔn)删w抗體在逐步的富集。在198株通過ELISA檢測陽性的克隆中，有163株克隆通過間接免疫熒光鑒定與狂犬病毒糖蛋白反應(yīng)陽性(表2)。

2.3單鏈抗體的序列分析用 DNASTAR 序列分析軟件進行分析處理，比較 Internet V-Base 2 基因庫中的 IgG 序列，上述163株特異性結(jié)合狂犬病毒糖蛋白的人源scFv單克隆抗體，存在115株序列不同的抗體。

表2　抗狂犬病毒噬菌體抗體庫的富集篩選

2.4IgG抗體表達及ELISA檢測挑選39株抗原結(jié)合活性較高的scFv抗體，克隆到IgG全抗體表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞，通過ELISA對收獲上清進行抗人Fab和Fc片段以及抗aG抗原的檢測，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)ELISA 檢測結(jié)果，本研究挑選與抗原 結(jié)合滴度相對較高的抗體克隆進一步分析其親和力，分別是HL2、HL37、HL46、HL49、HL75。

2.5抗體親和力測定非競爭ELISA法測定RV08突變體親和力常數(shù)，結(jié)果顯示親本株RV08的親和力為2.33×10-9M；相比較而言HL75及HL49親和力略低于親本株，約為2.39X10-9M，2.69×10-9M；而HL46、HL2和HL37親和力分別為1.30×10-9M、1.56×10-9M、1.88×10-9M，均高于RV08；親和力最高的是HL46，約為RV08的1.79倍，可滿足實際應(yīng)用(圖2)。

2.6IgG抗體互補決定區(qū)基因的氨基酸序列分析利用生物軟件DNA Star對以上獲得的5株突變抗體的輕重鏈可變區(qū)序列比對顯示5株抗體重鏈和輕鏈的CDR區(qū)分別有氨基酸發(fā)生突變，而重鏈CDR3區(qū)均無突變發(fā)生。親和力最高的HL46輕鏈重鏈CDR區(qū)分別有2個氨基酸發(fā)生突變，即共有4個突變，其次HL2和HL37分別有3和4個氨基酸突變，親和力稍低的HL75和HL49分別有1個和2個氨基酸突變(表3)。

3討論

近年來關(guān)于人源抗狂犬病毒單克隆抗體國內(nèi)外已有很多報道[3,4,9]，但對于抗狂犬病毒人源單抗的親和力成熟研究鮮有報道，而抗體的功能特性與親和力高低密切相關(guān)，真正實現(xiàn)臨床應(yīng)用需要通過多種手段實現(xiàn)體外親和力成熟以提高抗體親和力。目前常用的方法有：易錯PCR、CDR區(qū)定向突變、DNA改組等。本研究采用易錯PCR技術(shù)提高狂犬病毒糖蛋白人源單抗RV08的親和力，經(jīng)固相篩選獲得了5株突變抗體，其中3株抗體HL46、HL2和HL37親和力分別為原始克隆RV08的1.79倍、1.47倍和1.23倍，表明易錯PCR突變后抗體親和力獲得明顯提高。

圖1　人源抗狂犬病毒糖蛋白IgG抗體特異性表達的ELISA檢測Fig.1　Expression of specfic human IgG antibodies against RV-G detected by ELISA

圖2　非競爭ELISA測定人源重組抗體親和力Fig.2　Measurement of human recombinant antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay

表3　抗狂犬病毒人IgG抗體互補決定區(qū)基因的氨基酸序列分析

抗體與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位存在于6個互補決定區(qū)(CDRs)，其中重鏈CDR3的多樣性變化最多，而且與抗體的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)突變抗體輕鏈和重鏈的CDR1、CDR2區(qū)分別有氨基酸發(fā)生突變，而重鏈CDR3區(qū)均沒有突變產(chǎn)生，提示雖然抗體生成過程中重鏈CDR3序列變化最為豐富，但本研究中僅通過易錯PCR的方法引入少量的堿基突變，難以得到重鏈CDR3區(qū)有意義的氨基酸突變。今后的工作將把研究重點放在CDR3區(qū)，以期獲得到親和力更高的抗體。

4參考文獻

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通信作者：梁米芳，Emai: mifangl@vip.sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.018

基金項目：重大新藥創(chuàng)制(2014ZX09201041004，2013ZX09304103001006)

(收稿日期：2016-01-22)

Affinity maturation of a single-chain antibody against rabies virus

SunLina,LiChuan,LiuYang,LiDexin,LiangMifang

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:LiangMifang,Email:mifangl@vip.sina.com

【Abstract】ObjectiveTo obtain a human single-chain antibody against rabies virus (RV) with high affinity by error-prone PCR technology. MethodsA combinatorial scFv antibody mutant library was constructed by error-prone PCR amplifying VH and VL of scFv RV08. After package by hyperphage, the scFv phage mutant library was panned by ELISA and IFA with purified RV AG. The selected mutant antibodies were converted to full human IgG antibodies with the VH and VK Express cassettes. The affinity of mutant antibodies was measured by non-competitive enzyme immunoassay. ResultsThe mutant antibody library with capacity of 6×106 cfu/ml contained target gene insertion rate of 100%. Heavy chain and light chain were sequenced with mutation frequency of about 0.95% and 1.2% respectively. Finally 5 mutant antibodies with high affinity were obtained, of which HL46, HL2 and HL37 had higher affinity with 1.79 times, 1.47 times and 1.23 times of RV08 respectively. ConclusionsIn this study, error-prone PCR technology and phage display technology combination enables to obtain significantly improved affinity of antibody.

【Key words】Rabies virus; Single-chain antibody; Affinity