汪明星，劉　松，劉　龍*，堵國(guó)成，陳　堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

融合短肽促進(jìn)堿性果膠酶的高效表達(dá)

汪明星1，2，劉松1，2，劉龍*1，2，堵國(guó)成1，2，陳堅(jiān)1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

堿性果膠酶（PGL）是一種重要的工業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于食品、紡織和造紙等行業(yè)。作者將6種雙親短肽（SAP）融合至PGL N端，以期提高PGL在大腸桿菌中的分泌表達(dá)效率。得到一株高產(chǎn)菌株P(guān)GL-S1，胞外酶活由129.65 U/mL提高到535.47 U/mL，其他5種短肽則酶活降低。通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PGL-S1的表達(dá)量并沒有多大變化，推測(cè)可能是催化效率提高引起酶活提高。分析雙親短肽的疏水性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，SAP1的疏水性不同于其他短肽，疏水性是蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的主要作用力，能夠固定N、C末端，加強(qiáng)與底物的相互作用。推測(cè)PGL-S1融合蛋白的表面疏水性提高，促進(jìn)了對(duì)底物的催化效率，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

堿性果膠酶；雙親短肽；高效表達(dá)；疏水性指數(shù)；催化效率

果膠酶是能夠分解果膠質(zhì)的酶的總稱，廣泛存在于各種微生物中，細(xì)菌、真菌和放線菌都能產(chǎn)生相關(guān)酶類。根據(jù)不同底物，果膠酶可以分成以下幾類：多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠酸裂解酶（PL）和果膠酯酶 （PE）［1］。堿性果膠酶 （E.C.4.2.2.2，簡(jiǎn)稱PGL），全稱聚半乳糖醛酸裂解酶，其可以在堿性條件下，將果膠質(zhì)分解為不飽和的寡聚半乳糖醛酸。果膠酶在食品加工、飼料加工、紡織、造紙、環(huán)境保護(hù)等方面應(yīng)用廣泛［2-3］。尤其在紡織行業(yè)中，由于傳統(tǒng)精煉工藝能耗大污染嚴(yán)重，堿性果膠酶作為一種生物制劑，順應(yīng)了綠色生產(chǎn)加工和可持續(xù)發(fā)展的要求，慢慢取代了傳統(tǒng)工藝。隨著堿性果膠酯裂解酶新用途的不斷出現(xiàn)，對(duì)該酶的需求量越來越大，因此提高堿性果膠酶的產(chǎn)量受人關(guān)注。

促進(jìn)酶的高效表達(dá)有很多方法，例如異源表達(dá)［4］、發(fā)酵優(yōu)化［5］，諸葛斌等人成功地將來源于枯草芽孢桿菌 WSHB04-02的 PGL基因在 P.pastoris GS115中實(shí)現(xiàn)整合分泌表達(dá)，優(yōu)化后現(xiàn)PGL胞外表達(dá)量已為全球領(lǐng)先［6-7］。然而，畢赤酵母表達(dá)體系存在很多難以克服的問題，比如發(fā)酵周期長(zhǎng)、過程控制復(fù)雜和低溫誘導(dǎo)能耗高等。解決這些問題的最有效方法是建立并深化原核表達(dá)體系，以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵周期短、過程簡(jiǎn)便、低能耗的PGL高效表達(dá)。

據(jù)報(bào)道，雙親短肽 （SAPs）與蛋白末端融合，SAPs形成的水凝膠能夠?qū)γ阜肿舆M(jìn)行固定化，提高酶的催化效率和穩(wěn)定性，從而提高酶活。楊海泉等將雙親短肽與堿性淀粉酶N端融合，得到酶活提高3.2倍的重組堿性淀粉酶［8］。

作者對(duì)6種不同性質(zhì)的SAPs分析，將其與PGL N端融合，發(fā)酵測(cè)PGL酶活。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒E.coli JM109，E.coli BL21 （DE3），Bacillus sp.WSHB04-02和pET-22b（+）：作者所在實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2雙親短肽SAPs清華大學(xué)林章凜教授的研究發(fā)現(xiàn)，融合強(qiáng)疏水性的雙親短肽會(huì)使重組酶以有活性的包涵體形式出現(xiàn)在胞內(nèi)［8］。為避免融合蛋白形成包涵體，作者選擇了親水性較強(qiáng)雙親短肽作為研究對(duì)象。編碼6個(gè)短肽的基因，以及在其N端的6×His-tag和 C端的 PT linker（PTPPTTPTPPTTPT PT）基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。隨后與質(zhì)粒pET-22b（+）連接，詳細(xì)的SAPs信息見表1。

表1　　雙親短肽的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 1　Sequence，character and scoure of SAPs

1.1.3培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0。

2）種子培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，葡萄糖20 g/L；pH 7.0。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（TB）：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L。

1.2方法

1.2.1PGL基因擴(kuò)增用表2中引物PCR擴(kuò)增PGL基因片段，在上下游分別加上NcoI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。

表2　　引物序列Table 2　Primer Sequence

1.2.2膠回收詳見 TAKARA公司膠回收試劑盒的產(chǎn)品說明書。

1.2.3連接使用TAKARA公司連接試劑盒分別將雙親短肽，PGL基因依次與整合好的 pET-22b （+）連接。

1.2.4轉(zhuǎn)化將連接好的pET-22b（+）/pgl-S轉(zhuǎn)進(jìn)JM109，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)進(jìn)E.coli BL21（DE3）。

1.2.5培養(yǎng)方法

1）種子培養(yǎng)：從甘油管中將重組菌E.coli BL21 （DE3）（pET-22b（+）/pgl-S）接種于含有100滋g/mL氨芐青霉素和 2 g/dL葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，裝液量為20 mL/250 mL。培養(yǎng)溫度 37℃，200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10 h。

2）搖瓶發(fā)酵：將培養(yǎng)10 h的種子液以3%的接種體積分?jǐn)?shù)接入含有 100滋g/mL氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基TB中，裝液量為20 mL/250 mL，于37℃、200 r/min培養(yǎng)。菌體生長(zhǎng)到一定階段（OD600=0.6），加入終濃度0.04 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)將溫度調(diào)整為30℃，誘導(dǎo)48 h。

1.2.6PGL酶活測(cè)定堿性果膠酶酶活力檢測(cè)：取一定量發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，胞外堿性果膠酶即包含于發(fā)酵上清液中。堿性果膠酶反應(yīng)體系為：酶稀釋液 20滋L，含 0.2%PGA的甘氨酸-NaOH緩沖液 （0.2 mol/L，0.44 mmol/L的 CaCl2，pH 9.4）2 mL，無活性的酶液為空白對(duì)照。堿性果膠酶反應(yīng)條件為：45℃水浴 15 min，使用 3 mL磷酸溶液（0.03 mol/L）終止反應(yīng)，235 nm處測(cè)定反應(yīng)物吸光度值。

2結(jié)果與討論

2.1PGL重組菌的構(gòu)建

重組載體pET-22b（+）/pgl-S的構(gòu)建流程見圖1。將合成短肽整合到pET-22b（+）載體上，隨后再將擴(kuò)增的pgl連接到帶有SAP的載體上。

將上海生工合成的雙親短肽基因通過NcoI與NdeI酶切位點(diǎn)與pET-22b（+）連接，得到6個(gè)重組質(zhì)粒pET-22b（+）/S1，pET-22b（+）/S2，pET-22b（+）/ S3，pET-22b（+）/S4，pET-22b（+）/S5和pET-22b（+）/S6。膠回收后，電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖2，條帶大小與預(yù)期5.6 kb上下吻合。

圖1　pET-22b（+）/pgl-S質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1　Construction of pET-22b（+）/pgl-S

圖2　pET-22b（+）/S構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of pET-22b（+）/S

以Bacillus sp.WSHB04-02為模板，利用高保真聚合酶Primer Star PCR擴(kuò)增得到不含自身信號(hào)肽的PGL基因pgl。凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)為正確長(zhǎng)度1.2 kb左右，見圖3。

圖3　PGL基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PGL gene

將pgl與重組質(zhì)粒pET-22b（+）/（S1-S6）通過NcoI，XhoI連接，得到PGL基因與雙親短肽SAP連接得到最終的重組載體pET-22b（+）/pgl-S1，pET-22b（+）/pgl-S2，pET-22b（+）/pgl-S3，pET-22b（+）/ pgl-S4，pET-22b（+）/pgl-S5和pET-22b（+）/pgl-S6。整合后的雙親短肽SAP與PGL的N端連接。之所以選擇N端連接，是因?yàn)橹盀榱吮阌诩兓?，將PGL的C端融合His-Tag，由于改造后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使催化殘基結(jié)構(gòu)受到影響，導(dǎo)致表達(dá)后的PGL活性降低50%［10］。而N端結(jié)果就相對(duì)穩(wěn)定。原始PGL中N端有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，信號(hào)肽在合成后，將蛋白質(zhì)攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上后被切割，為了使雙親短肽不會(huì)因此被切割，去除原始PGL中N端的信號(hào)肽，與雙親短肽SAP直接相連。對(duì)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109，提質(zhì)粒，將測(cè)序正確的重組載體跑膠見圖4。

圖4　pET-22b（+）/pgl-S構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4　Agarose gel electrophoresis of pET-22b（+）/pgl-S

2.2重組PGL的表達(dá)

將測(cè)序正確的pET-22b（+）/pgl-S轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli BL21（DE3），種子生長(zhǎng)10 h后以3%的接種體積分?jǐn)?shù)加入到發(fā)酵培養(yǎng)基TB中，發(fā)酵48 h后離心取上清液，將發(fā)酵上清液組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，見圖5。并檢測(cè)PGL酶活，見圖6。由于加入SAPs的相對(duì)分子質(zhì)量不同，融合之后的蛋白質(zhì)大小由 43 400依次變?yōu)?48 200，51 400，51 600，51 300，51 700和51 500。由圖5可知，其中PGLS1、PGL-S2、PGL-S4分泌表達(dá)量與改造之前的PGL相比變化不大，PGL-S3、PGL-S5、PGL-S6分泌表達(dá)量下降明顯。

圖5　E.coli BL21（DE3）（pET-22b（+）/pgl-S）發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of E.coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/pgl-S）in supernatant

圖6　　重組蛋白質(zhì)發(fā)酵上清酶活Fig.6　Enzyme　activity　of　recombinantPGL　in supernatant

由于PGL已經(jīng)工業(yè)化，在工業(yè)應(yīng)用中為了減少工藝流程降低成本，只提取胞外分泌的PGL。所以本研究主要集中在PGL的胞外分泌表達(dá)量。改造后，PGL-S1搖瓶發(fā)酵的胞外酶活由129.65 U/mL提高到535.47 U/mL，胞外酶活提高至PGL的4.13倍。雖然之前PGL的罐上產(chǎn)量已達(dá)到1 593 U/mL，卻是總酶活，其中胞內(nèi)酶活占了相當(dāng)大比例［6-7］。再者，畢赤酵母作為單細(xì)胞真核生物，具有較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的修飾能力，非常有利于真核基因的表達(dá)，但是PGL基因是來源于原核細(xì)胞Bacillus sp.WSHB04-02，不需要畢赤酵母強(qiáng)大的產(chǎn)物修飾能力，加上畢赤酵母表達(dá)體系仍存在很多難以克服的問題，比如過程控制復(fù)雜，低溫誘導(dǎo)耗能高和發(fā)酵周期長(zhǎng)等，如果能在工藝簡(jiǎn)單周期短生產(chǎn)成本低的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到高效表達(dá)，則能從根本上將PGL的工業(yè)化推進(jìn)一步。

PGL在畢赤酵母中的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到220 U/mL，3 L罐上優(yōu)化后提高至1 593 U/mL。PGL在大腸桿菌中罐上優(yōu)化的胞外酶活為257.8 U/mL，相比搖瓶水平提高了一倍。將改造后的PGL-S1在罐上做擴(kuò)大培養(yǎng)，其單位酶活很有可能超過之前，潛力巨大。

2.3S1提高胞外PGL酶活水平的機(jī)制解析

融合SAP之后PGL-S的酶活有了不同程度的變化。其中以PGL-S1的酶活提高最為顯著。但是SDS-PAGE檢測(cè)分析，卻發(fā)現(xiàn)PGL-S1的蛋白質(zhì)表達(dá)量反而比之前略有降低，表達(dá)量變化不大而酶活卻提高了3倍多，由此推出改造后的PGL-S1催化效率大幅提高，即改造后的比酶活提高。利用在線軟件（http：//www.expasy.org）計(jì)算自組裝雙親短肽的疏水性指數(shù)（Gravy value）。Gravy value越小表明親水性越強(qiáng)，反之則說明疏水性越強(qiáng)。自組裝雙親結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有短肽的Gravy value都呈現(xiàn)負(fù)值，表明這些短肽總體體現(xiàn)親水性。SAP1的疏水性性明顯高于其他雙親短肽，。已有的研究表明［11］，疏水性是蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的主要作用力。大量研究表明［12-13］，寡聚能夠加強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用，固定N、C末端，加強(qiáng)與底物的相互作用，推測(cè)由于PGL-S1融合蛋白的表面疏水性得到了提高，因而加強(qiáng)了其與底物聚半乳糖醛酸的相互作用，進(jìn)而提高了其比酶活。

表2　　雙親短肽疏水性指數(shù)Table 2　Gravy value of SAPs

3結(jié)語

引入雙親短肽，可改變蛋白質(zhì)的表面疏水性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)催化效率，促進(jìn)高效表達(dá)。作者通過將6條不同性質(zhì)的雙親短肽SAP與堿性果膠酶的N端進(jìn)行融合表達(dá)，得到一株高效表達(dá)菌株。PGL-S1的酶活大幅提高，僅僅搖瓶產(chǎn)量就提高至出發(fā)菌株P(guān)GL的4.13倍，達(dá)到535.47 U/mL，進(jìn)一步證明了該策略的高效性。SAP1與堿性果膠酶的融合表達(dá)大大提高了酶的催化效率，從而使得堿性果膠酶高效表達(dá)。通過進(jìn)一步的發(fā)酵優(yōu)化，并最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化有良好前景，可以極大的避免長(zhǎng)期以來在工業(yè)應(yīng)用中畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的各種弊端，降低工業(yè)成本。

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Fusions of Amphipathic Peptide to the Alkaline Polygalacturonate Lyase from Bacillus sp.WSHB04-02 Improves the Production

WANG Mingxing1，2，LIU Song1，2，LIU Long*1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alkaline polygalacturonatelyase（PGL）is one of important industrial enzymes，which was widely used in food，textile and paper industries.In this study，we constructed and expressed six Self-assembling amphipathic peptides（SAPs），whihch were attached to the N terminus of the PGL，to improve the secretory expression of PGL in E.coli.Finally PGL-S1 stood out with enzyme activity improving from 129.65 U/mL to 535.47 U/mL，while the otherenzyme activity weredecreased.There was no obvious change in the extracellular yield of PGL by SDS-PAGE analysis.It indicated that the high enzyme activity was caused by the improving catalytic efficiency.The Grave Value showed that the hydrophobicity of SAP1 was different with the others，which was the main interaction for the accumulation of protein to enhance the interaction between protein and substrate.It was conferred that the improving surface hydrophobicity made a big effect on the catalytic efficiency.PGL-S1has huge potential use for industrial application.

alkalinepolygalacturonatelyase，self-assemblingamphipathicpeptides，efficient secretory overexpression，grave value，catalytic efficiency

TQ 925

A

1673—1689（2016）05—0504—06

2014-09-03

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022202）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130132）。
*

劉龍（1980—），男，山東諸城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物系統(tǒng)代謝工程及工業(yè)酶的分子定向修飾方面的研究。E-mail：longliu@jiangnan.edu.cn