夏海英，肖雯靜，薛茗月

(1.廣西師范大學電子工程學院，廣西桂林541004； 2.廣西師范大學化學與藥學學院，廣西桂林541004)

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微流控芯片下的單細胞輪廓定位與提取

夏海英1，肖雯靜1，薛茗月2

(1.廣西師范大學電子工程學院，廣西桂林541004； 2.廣西師范大學化學與藥學學院，廣西桂林541004)

摘要：微流控芯片可實現(xiàn)單細胞分析，而對單個細胞分析，能夠掌握更準確更全面的細胞信息，可以克服以往群體分析中平均結果對個別信息掩蓋的局限性，對疾病的早期預防和診斷具有重要的科學意義。本文根據(jù)早期癌癥細胞通過微流控芯片中的彎道時變形與正常細胞不同的理論，采用Grabcut和Snake相融合的單細胞圖像分割算法來精確定位和提取單細胞輪廓，實現(xiàn)單細胞的形變分析。首先，本文在圖像分割之前引入Perona-Malik模型，增強圖像邊緣的同時減弱噪聲，使定位更加準確。其次，利用Canny和Snake模型獲得Grabcut初始化矩形框。最后，通過Grabcut算法實時精確地提取單細胞輪廓。實驗結果表明：本文算法結合了Snake算法和Grabcut算法的優(yōu)點，在無人工交互的條件下，細胞輪廓平均正確分割率達到93.7%，能夠滿足醫(yī)學單細胞分析的要求。

關鍵詞：單細胞；輪廓定位與提??；Grabcut算法；Snake算法；融合

0引言

美國華盛頓大學的分析化學家NormanDovichi認為，在癌癥的發(fā)展過程中， 同種細胞之間的蛋白質(zhì)組分差異會越來越大。如果這種情況屬實的話，細胞之間的巨大差異能夠提示疾病更具有擴散的趨勢。對單個細胞進行分析可以幫助研究人員區(qū)分單一細胞系種群和具有不同蛋白組分的多細胞系種群，這種區(qū)分差異的檢測技術將對癌癥、糖尿病等疾病的研究產(chǎn)生重要影響。2012年，Jason等人通過大量的實驗分析，提出了早期癌癥細胞在通過微流控芯片彎道時，與正常細胞的變形存在不同，并給出了理論分析，即細胞發(fā)生癌變后，細胞膜變厚[1]。但細胞圖像分割具有邊界模糊(甚至無邊界信息)、內(nèi)部灰度分布極其不均、紋理復雜等特點。那么對單個細胞輪廓的準確分析就變得相當重要。國內(nèi)外的學者針對此問題也進行過很多研究。2008年Yangqihua等人提出基于Curvelet算法和Snake模型相結合的快速細胞輪廓提取算法[2]，但是算法復雜程度高，實時性差；馬競鋒等人利用偽中值雙邊濾波和水平集函數(shù)結合進行細胞分割[3]，但細胞邊緣分割效果精度較差，因為不是所有的細胞邊緣都是規(guī)則圓潤的；蘭紅等人提出分水嶺優(yōu)化的Snake模型肝臟圖像分割，適用于腹部MR圖像及肝臟圖像等一些面積較大、特征較明顯的圖像[4-5]，對細胞圖像的提取分割精度較差；Rother等提出Grabcut算法以后，國內(nèi)外學者為了得到更加精確的圖像分割又對Grabcut算法進行了一系列的研究。陳浩等提出基于Grabcut和八方向鏈碼法的藻類細胞輪廓提取算法[6]，該算法能夠屏蔽細胞內(nèi)部雜亂的紋理，較好地保留圖像邊緣信息，但是用戶交互復雜程度高，不適合細胞輪廓的實時提?。籘angchunming以遺傳算法為基礎提出植物莖細胞的精確輪廓提取[7]，提取效果和細胞原圖差異較大，不適用于醫(yī)學圖像的研究；陳林偉等人提出結合顯著性的Grabcut及在骨髓細胞中的應用[8-9]，算法能避免以往細胞分割算法，如支持向量機、K-means等參數(shù)調(diào)整問題，自動化程度顯著提高，但分割效果精確性差且運行時間很慢，不能滿足癌細胞的早期診斷要求。

考慮到當前細胞輪廓提取算法對于邊界模糊、紋理復雜的細胞圖不能夠達到精確、實時的分割效果，本文提出以微流控芯片為主要平臺，融合Snake模型的非交互Grabcut分割算法。該算法通過Snake算法快速定位單細胞的粗略位置，結合Grabcut算法實時精確提取單細胞輪廓。同時，為了消除圖片中亮點噪聲的影響，采用PM算法對原細胞圖像進行處理，進一步提高了分割精確度。

1材料與方法

本文實驗中所有樣本均由廣西師范大學化學與藥學學院重點實驗室提供。實驗樣本的獲取以微流控芯片分析儀為實驗平臺，利用了微流控芯片技術以微管道網(wǎng)絡為結構特征的特點和它在細胞學研究方面的優(yōu)越性。單細胞成像分析時，采用類似于流式細胞儀進樣方式，采樣針下探接近裝有細胞的試管底部，試管被加壓， 樣品開始流動。流動室有一方形通道，加壓的鞘液流從低部進入該通道， 從上方流出。當鞘液流通過該通道時， 樣品液被射入鞘液中間， 被鞘液流包圍， 但不相互混合。鞘液流的壓力使樣品液流聚集， 鞘液裹挾著的樣品流中的細胞排成單列， 微流控芯片的通道直徑通常在10～100μm， 與單個生物細胞在尺度上具有相似性。細胞可逐個通過微流控芯片通道，到達檢測窗口時被檢測，并采集圖片204幅，圖片格式為BMP，大小為1 024×1 256像素。對其中的一部分細胞進行熒光染色(熒光染色是指細胞在熒光染料的作用下產(chǎn)生的熒光顏色)，得到64幅染色后的圖片。圖1所示是單細胞成像分析進樣系統(tǒng)示意圖，圖2是采集得到的單細胞圖像。

圖1　單細胞成像分析進樣系統(tǒng)示意圖(流式細胞進樣)Fig.1　Single cell imaging analysis injection system diagram

圖2　微流控芯片下采集到的單細胞圖像Fig.2　Single cell image acquisition

2融合Snake的Grabcut細胞輪廓自動提取算法

首先，采用PM模型對圖像進行平滑和去噪；其次，用Canny和Snake結合的算法實現(xiàn)單細胞圖像的粗定位；最后，利用細胞輪廓的粗定位對Grabcut算法初始化，使得本方法不僅能夠得到準確的單細胞輪廓，而且滿足了實時性要求。具體算法流程如下：

目標：經(jīng)過多次迭代使得對背景和目標建模的GMM參數(shù)最優(yōu)，從而使能量E(α，k，θ，z)最小化(見公式(1))得到最優(yōu)分割效果。

E(α，k，θ，z)=U(α，k，θ，z)+v(α，z)，

(1)

式中：U為區(qū)域項；v為彩色圖像平滑項；α為不透明度，α∈[0，1]，0為背景，1為前景目標；θ為本幅圖像前景目標與背景的灰度直方圖，θ={h(z，α)，α=0，1}；z為圖像灰度值數(shù)組[8]。

Step1：自動生成初始化矩形。

①利用PM模型對原始圖像進行平滑，增強邊緣，去除噪聲。

②為了防止圖像中的噪聲點會誤導Snake朝其移動，使Snake被吸引到虛假邊緣處，對去噪后的圖像利用Canny邊緣檢測算子進行細化邊緣，生成一副與原圖像大小相同的二維灰度圖像。

③根據(jù)②中Canny得到的細化邊緣估計Snake的初始蛇點，然后依據(jù)Snake模型的原理進行迭代運算(見公式(2))，當新蛇相對于舊蛇沒有變化時，即Eint=Eimage，則停止迭代，最終得到一系列連續(xù)點組成的細胞初始輪廓線。

(2)

其中：Eint表示主動輪廓的內(nèi)部能量，用來控制Snake的能量向內(nèi)部收縮；Eimage表示外部能量，用來將Snake曲線吸引到圖像明顯的外部特征上，在分割過程中起到了重要的作用。

圖3　算法流程圖Fig.3　Algorithm flowchart

④按從上到下的順序逐行掃描，獲得③中組成初始輪廓線的所有點的坐標。經(jīng)過對比，分別找出x、y軸上坐標最小的點作為矩形框的左上角的點，同理，找出x、y軸上坐標最大的點作為矩形框的右下角的點，然后把(x.max-x.min)、(y.max-y.min)分別作為框的長和寬畫矩形。

⑤得到的矩形框匹配原來在圖像上手動選定約束矩形框可以實現(xiàn)自動標注的目的，框外的區(qū)域為背景區(qū)域Tb，框內(nèi)的區(qū)域為未知區(qū)域Tu，Tf為目標區(qū)域。

⑥Tb內(nèi)的像素點的α值為0，Tu內(nèi)的為1，Tf則設為空。

Step2：微流控芯片技術下單細胞的輪廓提取。

①通過k-means算法初始化前景與背景的GMM模型，每組高斯混合模型的高斯函數(shù)分量為5。

②把每個像素分配到合適的GMM模型中，分配原則是將每個像素代入到每個高斯分量中，最小值所在的高斯分量就是該像素對應的那個分量kn(見公式(3))。

D(αn，kn，θ，zn)=-logp(zn|αn，kn，θ)-logv(αn，kn)，

kn=argminDn(αn，kn，θ，zn)，

(3)

其中p(·)是高斯概率分布，v(·)是該高斯模型的樣本數(shù)在總樣本中的權值。

③學習優(yōu)化GMM的參數(shù)θ(見公式(4))。

θ=argminU(α，k，θ，z)。

(4)

⑤重復步驟②～④，直到收斂，GMM參數(shù)確定。

⑥采用bordermatting對分割邊界進行優(yōu)化，就可以得到目標的分割結果。

依據(jù)以上算法步驟，可以得到融合Snake的Grabcut細胞輪廓自動提取算法的流程圖(如圖3所示)。

3實驗結果及分析

為了評估本文算法的性能，將本文算法和Snake模型、Grabcut算法在2種細胞圖像集中進行對比分析。實驗一的單細胞圖像采自標準細胞圖像庫(http：//www.cellimagelibrary.org/images)，實驗二的單細胞圖像采自微流控芯片實驗平臺，實驗三是對3種算法分割效果的定量實驗分析。其中實驗一、二是在WindowsXP操作系統(tǒng)平臺上，采用VS2010工具和Opencv相結合實現(xiàn)的。實驗時將Canny算子的上下限分別設置為15、40，Grabcut算法的迭代次數(shù)均設為5。實驗三是在Matlab2011b實驗平臺下得到的仿真結果。

3.1標準細胞庫下單細胞圖像分割

我們共對標準細胞庫50幅單細胞圖片進行了性能測試，圖4是對標準細胞庫網(wǎng)站上的細胞進行測試的結果：前3列是干凈背景下的細胞圖，后2列是復雜背景下的細胞圖。

分析以上實驗結果可知，Snake算法運用在細胞輪廓提取上易受虛假邊緣的干擾，檢測精確度較低。grabcut算法容易出現(xiàn)欠分割現(xiàn)象。本文改進算法能到達到最佳分割效果(如圖4(a)、(b)、(c)、(d))。但是，在細胞圖背景極復雜且包含大量輪廓時本文算法的精確度將有所下降(如圖4(e))。

(a)為早期胚胎細胞；(b)為骨髓細胞；(c)為受精卵細胞；(d)為真核細胞；(e)為肌細胞。圖4　標準細胞庫內(nèi)單細胞輪廓提取結果對比Fig.4　Single cell of Standard cell library contour extraction results contrast

3.2微流控芯片技術下單細胞圖像分割

實驗二包括60幅單細胞圖，圖5是對在微流控芯片平臺下采集得到的細胞圖像進行測試的結果：其中30幅染色的單細胞(如圖5前3列)，30幅非染色細胞圖(如圖5后2列)，

(a)、(b)、(c)為染色單細胞，(d)、(e)為未染色單細胞。圖5　微流控芯片下單細胞輪廓提取結果對比Fig.5　Single cell contour extraction results contrast of microfluidic chips

圖5實驗結果可知，Snake模型容易出現(xiàn)細胞邊緣檢測斷裂、不能夠完整檢測出邊緣的問題，Grabcut算法需要用戶交互操作，易受到用戶主觀意思的影響分割出錯誤的細胞邊緣。本文算法能夠實現(xiàn)非交互的自動分割，分割單細胞圖像的精度大大提高(如圖5(a)、(b)、(c)、(d))。但是，當細胞圖像受到光照不均勻等問題的影響時，本文算法的分割精度將有所下降(如圖5(e))。

3.3分割算法性能評估

為了進一步評價算法分割效果，本文對標準細胞庫下采樣的30幅圖片和微流控芯片技術下采樣的30幅圖片又分別進行實驗效果分析，并通過3個指標比較分割性能。

過分割率yOR=Qp/Dp，

欠分割率yUR=Up/Dn，

總體誤差率yER=(Qp+Up)/(Dp+Dn)。

(5)

其中：Qp表示本來屬于該類但沒有分到此類的數(shù)據(jù)點；Dp表示屬于此類的數(shù)據(jù)點數(shù)；Dn表示不屬于此類的數(shù)據(jù)點數(shù)；Up表示本來不屬于該類但錯誤地分到此類的數(shù)據(jù)點數(shù)。把30幅圖像用4個方法進行分割后的效果進行定量分析，其過分割率、欠分割率、總體誤差率對比結果見圖6。

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，對大部分標準細胞圖(尤其是干凈背景的單細胞圖)而言，本文算法和Grabcut算法分割效果相當，都能夠得到較好的實驗效果，但對于背景復雜和微流控芯片下采集到的單細胞圖而言，本文算法和Snake算法相比，3個指標都顯著降低；和Grabcut算法相比，其過分割率相當，但在欠分割率上本文算法明顯低于Grabcut算法。由以上數(shù)據(jù)綜合分析可知本文算法的平均總體正確率達到93.7%，在4種算法中最高效果最好，能夠達到醫(yī)學圖像分析的要求。

圖6　3種分割算法的定量分析對比圖Fig.6　Quantitative analysis of three kinds of segmentation algorithm comparison chart

4結論

本文以微流控芯片為研究平臺，以實時獲取單細胞輪廓為研究目的，提出了融合Snake的Grabcut細胞輪廓自動提取算法。此算法改進了傳統(tǒng)的Grabcut算法在單細胞輪廓提取中自動化程度低、分割結果易受亮點噪聲影響等缺點。首先采用Perona-Malik[10]算法對單細胞圖像進行平滑的同時增強細胞邊緣，然后利用Canny和Snake模型逼近細胞邊緣獲得Grabcut初始化矩形框。大量的實驗結果表明：本文算法分割精確度顯著提高，尤其對于在微流控芯片分析儀下采集得到的細胞圖效果更加明顯。所以，能夠滿足單細胞醫(yī)學圖像分析。但是如果單細胞圖像光照不均勻、背景非常復雜且有大量輪廓時，本文算法效果將有所下降，還需要更深入的研究。

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(責任編輯馬殷華)

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.02.008

收稿日期：2015-12-15

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21327007)；廣西自動檢測技術與儀器重點實驗室基金項目(YQ1402)；廣西高等學校科研資助項目；廣西師范大學博士啟動基金資助項目

中圖分類號：TP39

文獻標志碼：A

文章編號：1001-6600(2016)02-0054-07

SingleCellContourLocalizationandExtractionunderMicrofluidicChip

XIAHaiying1，XIAOWenjing1，XUEMingyue2

(1.CollegeofElectronicEnginneering，GuangxiNormalUniversity，GuilinGuangxi541004，China；2.SchoolofChemistryandPharmacenticalSciences,GuangxiNormalUniversity,GuilinGuangxi541004,China)

Abstract:The single-cell analysis， achieved on the microfluidic chip， is able to grasp more accurate and comprehensive cells information， has important scientific significance for the prevention and early disease diagnosis. Based on the theories that the deformability of the early cancer cells are different from normal cells when they go around a curve in the microfluidic chip. So a new cell segmentation algorithm， which fuses classical grabcut algorithm with snake algorithm， is proposed to accurately extract a single cell outline， and achieve the deformation analysis of a single cell. Firstly， the morphological operators are used to eliminate small bright spot noise. Secondly， canny and snake algorithm are utilized to get the position of one cell， which can be regarded as the initialization of the grabcut algorithm. Finally， accurate cell contour are extracted by grabcut algorithm. Experimental results show that the proposed algorithm combines the advantages of snake algorithm and grabcut algorithm. In the absence of human interaction， the average correct segmentation rate is up to 93.7%， can meet the medical requirements of single cell analysis.

Keywords:unicellular； contour localization and extraction； Grabcut algorithm； Snake algorithm； fuse

通信聯(lián)系人：夏海英(1983—)，女，山東聊城人，廣西師范大學副教授，博士。E-mail：xhyhust@gmail.com