張國強，高榮榮，張愛梅，林新宇，張立明

（1.濰坊醫(yī)學院 兒科學教研室，山東 濰坊 261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 新生兒科，山東 濰坊 261041）

依達拉奉對高氧損傷小鼠肺組織中白介素-4、干擾素-γ、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響

張國強1，高榮榮1，張愛梅2，林新宇2，張立明2

（1.濰坊醫(yī)學院 兒科學教研室，山東 濰坊 261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 新生兒科，山東 濰坊 261041）

目的探討依達拉奉對新生小鼠高氧肺損傷的治療作用，為臨床防治新生兒高氧肺損傷提供理論依據(jù)。方法將新生小鼠隨機分為空氣+生理鹽水組、空氣+依達拉奉組、高氧+生理鹽水組、高氧+依達拉奉組，于實驗第3、7、10、14和21天取材，測定肺組織中白介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達的變化。結(jié)果隨著吸氧時間的延長，高氧組IL-4、IFN-γ含量均高于空氣組且比例失衡，TGF-β1表達越多并肺組織結(jié)構(gòu)紊亂；依達拉奉治療組IFN-γ含量顯著增高，IL-4含量明顯降低，IFN-γ/IL-4比值更接近正常組，TGF-β1表達降低，肺組織結(jié)構(gòu)較高氧組好轉(zhuǎn)。結(jié)論高氧可導致新生小鼠急性肺損傷；依達拉奉可調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-4的含量及比例，降低TGF-β1的表達，發(fā)揮對高氧肺損傷的防治作用。

依達拉奉；肺損傷；高氧；白介素-4；干擾素-γ；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；新生小鼠

氧療是新生兒缺氧性疾病重要的治療方式之一，過去的研究十分注重高氧對視網(wǎng)膜的影響，忽視了對視網(wǎng)膜以外重要器官的作用。干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的抗纖維化與白介素-4（Inter-leukin-4，IL-4）的促纖維化在高氧肺損傷中起重要作用。本實驗利用高氧致新生小鼠肺損傷動物模型，應用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫組織化學法測定IL-4、IFN-γ及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）在小鼠肺組織中的表達變化，探討自由基清除劑依達拉奉對高氧肺損傷的治療作用，為新生兒高氧肺損傷的臨床防治提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1動物材料

昆明小鼠由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供［許可證號：SCXK（魯）20140007］，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2試劑與設備

依達拉奉購自國瑞藥業(yè)，小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、TGF-β1抗體購自博士德生物工程有限公司（編號：EK0375、BA0290），IL-4 ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司（產(chǎn)品目錄號：EMC003. 96），放射免疫分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）購自碧云天生物技術研究所（編號P0013B、ST506），其余生化試劑均為國藥分析純。DYC-Ⅰ型動物常壓高氧實驗艙、ML-Y數(shù)字智能測氧儀、Dapex氣體分析儀、Eppendorf排槍、酶標儀、精密天平、高速離心機等。

1.3實驗方法

1.3.1建立高氧肺損傷模型200只自然分娩的昆明小鼠隨機分為空氣+生理鹽水組（Ⅰ組）、空氣+依達拉奉組（Ⅱ組）、高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）、高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）4組，每組50只。每組又隨機分為3、7、10、14和21 d 5個亞組，每個亞組10只。Ⅰ組、Ⅱ組在空氣中飼養(yǎng)；Ⅲ組、Ⅳ組于生后12 h內(nèi)置于氧艙中，維持氧濃度90%～95%；鈉石灰吸收二氧化碳CO2，使其濃度＜0.5%，以變色硅膠保持濕度60%～70%。隔日更換墊料、干燥劑，并將各組母鼠互換，防止母鼠氧中毒并保持哺乳條件一致，給予依達拉奉（5 mg/kg）或等量生理鹽水腹腔注射，1次/ 12 h，保持室溫25～26℃。

1.3.2組織取材與檢測分別于實驗第3、7、10、14 和21天取材。ELISA如下：將小鼠斷頭放血，迅速剪開胸腔，取出雙肺，吸水紙拭去表面血跡，稱重，放入置于冰上的研缽中，倒入適量液氮，快速將其研成均勻粉末狀，加入其9倍重量的含蛋白抑制劑PMSF的RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），5 min研磨1次，裂解30 min后將勻漿移入離心管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液移入Eppendorf管中，置入-20℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測。IFN-γ濃度檢測步驟如下：將標準品、樣品分別加入酶標板孔中，37℃（下同）孵育90 min，甩去液體后加入生物素標記的抗小鼠IFN-γ抗體工作液，反應60 min，洗板后加入親和素-生物素-過氧化物酶復合物工作液，反應30 min，洗板后加入3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色液，避光反應20 min后加入終止液顯色，于450nm處測定光密度值，用標準品計算出曲線后，進一步得出樣品濃度；IL-4濃度檢測方法大致相同。免疫組織化學法如下：小鼠麻醉后，采取肺/體循環(huán)雙重灌注后將肺組織迅速浸泡于10%中性甲醛液中，石蠟包埋、切片、脫蠟至水、抗原修復、封閉后采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術顯色，復染，封片，于400倍下每張切片隨機選10個視野，用Image-pro plus 6.0進行圖像分析，細胞核和/或胞漿呈棕黃色為陽性細胞，陽性細胞越多，顏色越深，平均光密度越大。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組肺組織中IL-4的含量變化

高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）肺組織中IL-4含量較空氣+生理鹽水組（Ⅰ組）增加；給予依達拉奉治療后，高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）IL-4含量較高氧+生理鹽水組下降，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2各組肺組織中IFN-γ的含量變化

高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）肺組織中IFN-γ含量與空氣+生理鹽水組（Ⅰ組）比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，Ⅲ組 IFN-γ含量較Ⅰ組增加；給予依達拉奉治療后，IFN-γ含量與Ⅲ組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，其含量繼續(xù)增加，7 d起增加更明顯。見表2。

2.3各組肺組織中IFN-γ/IL-4比值的變化

高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）IFN-γ/IL-4明顯低于空氣+生理鹽水組（Ⅰ組），給予依達拉奉治療后，IFN-γ/IL-4比值更接近于Ⅰ組。見圖1。

表1　肺組織中IL-4的含量變化 （n=10，pg/ml，±s）

表1　肺組織中IL-4的含量變化 （n=10，pg/ml，±s）

組別21 d空氣+生理鹽水（Ⅰ組）　117.69±4.91　126.85±7.69　123.82±9.25　142.27±7.47　130.01±12.62空氣+依達拉組（Ⅱ組）　115.93±6.38　130.58±4.52　125.87±5.84　140.31±5.86　135.05±9.36高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）　211.53±8.21　283.53±9.18　294.49±13.73　330.47±8.63　324.37±13.74高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）　130.63±8.64　154.85±9.56　161.21±7.31　183.23±9.37　175.65±12.83 t值（Ⅰ組vsⅢ組）　22.933　40.142　30.530　58.342　44.374 P值（Ⅰ組vsⅢ組）　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000 t值（Ⅲ組vsⅣ組）　16.142　29.371　25.683　45.632　27.853 P值（Ⅲ組vsⅣ組）　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000 3 d 7 d 10 d 14 d

2.4肺組織形態(tài)及TGF-β1的表達

隨著吸氧時間延長，高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）肺組織水腫、充血及血管擴張，炎癥細胞浸潤逐漸加重，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂；而高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）肺組織結(jié)構(gòu)較Ⅲ組明顯好轉(zhuǎn)。正常新生小鼠肺組織內(nèi)TGF-β1含量微弱；高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）TGF-β1含量逐漸增加，高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）較空氣+生理鹽水組（Ⅰ組）TGF-β1含量增加，但較Ⅲ組表達減少，差異有統(tǒng)計學意義。見表3和圖2。

圖1　肺組織中IFN-γ/IL-4比值的變化

表2　肺組織中IFN-γ的含量變化 （n=10，pg/ml，±s）

表2　肺組織中IFN-γ的含量變化 （n=10，pg/ml，±s）

組別21 d空氣+生理鹽水（Ⅰ組）　74.78±4.71　80.76±4.72　98.12±9.70　106.26±8.63　99.89±11.63空氣+依達拉組（Ⅱ組）　69.47±5.25　82.32±4.28　96.38±7.48　110.36±10.32　102.25±9.46高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）　92.32±4.74　101.73±8.78　113.44±10.67　138.42±11.31　132.96±12.92高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）　97.82±7.35　111.94±7.25　133.80±9.48　149.42±7.50　143.71±10.56 t值（Ⅰ組vsⅢ組）　6.492　6.383　9.462　18.322　16.454 P值（Ⅰ組vsⅢ組）　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000 t值（Ⅲ組vsⅣ組）　1.431　2.240　7.632　12.364　5.472 P值（Ⅲ組vsⅣ組）　0.176　0.042　0.000　0.000　0.000 3 d 7 d 10 d 14 d

表3　肺組織中TGF-β1的平均光密度 （±s）

表3　肺組織中TGF-β1的平均光密度 （±s）

3 d組別21 d空氣+生理鹽水（Ⅰ組）　0.15±0.02　0.13±0.05　0.21±0.03　0.22±0.06　0.29±0.05空氣+依達拉組（Ⅱ組）　0.16±0.05　0.14±0.03　0.20±0.02　0.24±0.04　0.27±0.06高氧+生理鹽水組（Ⅲ組）　0.42±0.06　0.54±0.05　0.71±0.07　0.72±0.02　0.89±0.02高氧+依達拉奉組（Ⅳ組）　0.28±0.03　0.47±0.02　0.49±0.08　0.53±0.07　0.65±0.06 t值（Ⅰ組vsⅢ組）　21.021　32.252　47.544　40.593　65.514 P值（Ⅰ組vsⅢ組）　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000 t值（Ⅲ組vsⅣ組）　9.483　6.952　15.762　17.431　18.762 P值（Ⅲ組vsⅣ組）　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000 7 d 10 d 14 d

圖2　各組肺組織中TGF-β1含量比較 （免疫組織化學法染色×400）

3　討論

文獻報道，給予90%氧3 d即可誘發(fā)小鼠急性肺損傷，損傷程度與暴露時間成正比［1］。高氧所造成的肺損傷機制尚不完全明確，但活性氧具有的細胞毒性作用、炎癥因子誘導等作用，會促進肺內(nèi)相關炎癥細胞因子的分泌，損傷肺泡上皮、血管內(nèi)皮等生物膜系統(tǒng)，導致肺水腫及肺內(nèi)結(jié)構(gòu)性改變［2］。因此，增加抗氧化物質(zhì)，以拮抗活性氧的負面作用，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡，理論上可以防治高氧性損傷［3］。

依達拉奉是強效自由基清除劑，臨床主要用于治療急性缺血性腦梗死［4-5］。文獻報道，依達拉奉可以減輕大鼠的急性肺損傷［6-7］，減輕高氧狀態(tài)下細胞的損傷［8］，保護肝缺血再灌注后引起的肺損傷［9］，與其他藥物聯(lián)合應用可治療急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征［10］。

小鼠肺組織發(fā)育經(jīng)歷假腺期、小管期、原始肺泡期、肺泡期4個階段，在時序上與人類相似。不同之處在于：新生小鼠肺只發(fā)育至大體形態(tài)，近似于人類28周胎齡肺結(jié)構(gòu)，生后3 d肺泡開始形成［11］。3 d齡以前給予高氧吸入會導致肺泡的發(fā)育及成熟受到阻礙［12］，這與早產(chǎn)兒高氧肺損傷相似。本研究用生后12 h新生小鼠模仿新生兒出生后因各種原因，特別是危重患兒在呼吸機輔助通氣下吸入高濃度氧后造成的肺損傷。

IL-4是Th2類細胞因子，可以刺激肺內(nèi)成纖維細胞增生，同時促進其他Th2型細胞因子，抑制Th1型細胞因子的生成，使Th1/Th2平衡向Th2優(yōu)勢方向發(fā)展，引起肺纖維化［13］。IFN-γ是Th1類細胞因子，可以抗感染，抗增殖，調(diào)節(jié)免疫，拮抗IL-4［14］，已有吸入IFN-γ治療肺纖維化的報道［15］。

TGF-β1可以促進多種炎癥細胞的表達，而聚集的炎癥細胞又能釋放TGF-β1，形成交互放大效應；在肺纖維化過程中TGF-β1與結(jié)締組織生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等密切相關［16］。本實驗將TGF-β1作為觀察肺組織損傷的形態(tài)學指標。

本實驗中高氧組肺組織中IL-4、IFN-γ含量均高于空氣組且比例失衡，肺組織中TGF-β1明顯增多，肺組織損傷漸加重；給予依達拉奉治療后IFN-γ上升明顯（7 d起兩組比較差異有統(tǒng)計學意義），IL-4含量明顯降低，IFN-γ/IL-4比例更接近于高氧+生理鹽水組，TGF-β1表達減少，肺損傷減輕。提示依達拉奉對高氧誘導的新生小鼠急性肺損傷具有保護作用。作為自由基清除劑，依達拉奉可以直接轉(zhuǎn)移電子給氧自由基進而將其直接清除。另有研究證實，依達拉奉可以增強抗氧化酶的活性［17］，抑制活性氧的產(chǎn)生［18］，減輕甚至消除氧化基團對細胞的破壞，刺激前列環(huán)素生成，減少炎癥介質(zhì)的表達［19-20］；參與血紅素加氧酶-1和PI3K/Akt途徑，上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達，減輕細胞脂質(zhì)過氧化反應和DNA氧化損傷［21］。

綜上所述，依達拉奉對新生小鼠高氧肺損傷具有保護作用，為臨床防治新生兒高氧肺損傷提供新思路。

［1］馬麗亞，常立文.L-NAME對新生大鼠高氧肺損傷的影響［J］.同濟醫(yī)科大學學報，2000，29（2）：157-159.

［2］DUTKA T L，VERBURG E，LARKINS N，et al.ROS-mediated decline in maximum Ca2+-activated force in rat skeletal muscle fibers following in vitro and in vivo stimulation［J］.PLoS One，2012，7（5）：e35226.DOI：10.1371/journal.pone.0035226.

［3］SCHOELERM，LOETSCHERP D，ROSSAINTR，etal. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury［J］.Bmc Neurology，2012，12（1）：1-7.

［4］KIKUCHI K，KAWAHARA KI，UCHIKADO H，et al.Potential of edaravone for neuroprotection in neurologic diseases that do not involve cerebral infarction（Review）［J］.Experimental Therapeutic Medicine，2011，2（5）：771-775.

［5］李平，汪波.依達拉奉聯(lián)合溶栓治療急性腦梗死的療效及對氧自由基清除效果的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2015，25（28）：49-52.

［6］YANG T，ZHANG J，SUN L，et al.Combined effects of a neutrophil elastase inhibitor（sivelestat sodium）and a free radical scavenger（edaravone）on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats［J］.Agents Actions，2012，61（6）：563-569.

［7］施夢，王宜青，龐烈文，等.依達拉奉對大鼠急性肺損傷的干預作用［J］.中華胸心血管外科雜志，2009，25（6）：402-405.

［8］ZHANG G L，ZHANG W G，DU Y，et al.Edaravone ameliorates oxidative damage associated with Aβ25-35 treatment in PC12 cells［J］.Journal of Molecular Neuroscience，2013，50（3）：494-503.

［9］UCHIYAMA M，TOJO K，YAZAWA T，et al.Edaravone prevents lung injury induced by hepatic ischemia-reperfusion［J］. Journal of Surgical Research，2015，194（2）：551-557.

［10］WANG Z，LI R，LIU Y，et al.Protective effects of edaravone combined puerarin on inhalation lung injury induced by black gunpowder smog［J］.International Immunopharmacology，2015，26（1）：125-132.

［11］MUND S，STAMPANONI M J.Developmental alveolarization of the mouse lung［J］.Developmental Dynamics，2008，237（8）：2108-2116.

［12］NICHOLAS F，INGRID B，PHILIP H，et al.Disruption of the interactionbetweentherieskeiron-sulfurproteinandcytochrome B in the yeast bc1 complex owing to a human disease-associatedmutationwithincytochromeB［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271（7）：1292-1298.

［13］VASAKOVA M，STERCLOVA M，MATEJ R，et al.IL-4 polymorphisms，HRCT score and lung tissue markers in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Human Immunology，2013，74（10）：1346-1351.

［14］KLINGSBERG R C，MUTSAERS S E，LASKY J A.Current clinical trials for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Respirology，2010，15（1）：19-31.

［15］FUSIAK T，SMALDONE G C，CONDOS R.Pulmonary fibrosis treated with inhaled interferon-gamma（IFN-γ）［J］.Journal of Aerosol Medicine Pulmonary Drug Delivery，2015，28（5）：406-410.

［16］LONG X，SHANSHAN X，RENFENG G，et al.Transforming growth factor β3 attenuates the development of radiation-induced pulmonary fibrosis in mice by decreasing fibrocyte recruitment and regulating IFN-γ/IL-4 balance［J］.Immunology Letters，2014，162（1）：27-33.

［17］REYES Y A B，TAKEHIKO S，HIDEKI A，et al.MCI-186 （edaravone），a free radical scavenger，attenuates ischemia-reperfusion injury and activation of phospholipase A（2）in an isolated rat lung model after 18 h of cold preservation［J］.European Journal of Cardio-Thoracic Surgery，2006，29（3）：304-311.

［18］ZHAO Z Y，LUAN P，HUANG S X，et al.Edaravone protects HT22 neurons from H（2）O（2）-induced apoptosis by inhibiting the MAPK signaling pathway［J］.Cns Neuroscience Therapeutics，2012，19（3）：163-169.

［19］CHEN W，ZHOUHENG Y，JUAN Z，et al.Targeting reactive oxygen species by edaravone inhalation in a rat hyperoxic lung injury model：role of inflammasome［J］.Undersea and Hyperbaric Medicine，2013，40（6）：505-511.

［20］ZHANG W，GUO Y，YU S，et al.Effects of edaravone on the expression of β-defensin-2 mRNA in lung tissue of rats with myocardial ischemia reperfusion［J］.Molecular Medicine Reports，2013，7（5）：1683-1687.

［21］CAO H，F(xiàn)ENG Y，NING Y，et al.Edaravone protects rats and human pulmonary alveolar epithelial cells against hyperoxia in jury：heme oxygenase-1 and PI3K/Akt pathway may be involved［J］. Experimental Lung Research，2015，41（7）：404-414.

（申海菊 編輯）

Impact of Edaravone on hyperoxic lung injury in neonatal mice

Guo-qiang Zhang1，Rong-rong Gao1，Ai-mei Zhang2，Xin-yu Lin2，Li-ming Zhang2
（1.Department of Pediatrics，Weifang Medical College，Weifang，Shandong 261053，China；2.Department of Neonatal Medicine，Weifang People's Hospital，Weifang，Shandong 261041，China）

Objective To explore the effects of Edaravone in hyperoxic lung injury in neonatal mice so as to provide experimental and theoretical evidences for controlling hyperoxic lung injury in neonate.Methods Neonatal mice were randomly divided into air+normal saline，air+Edaravone，hyperoxia+normal saline，hyperoxia+Edaravone groups.At the end of exposure（on the 3rd，7th，10th，14th and 21st day），IL-4 and IFN-γ in lung homogenate were evaluated by ELISA，and TGF-β1and optical density（OD）in lung slices were determined using immunohistochemical stain and computerized graphic analysis techniques.Results With the increasing time of exposure，IL-4，IFN-γ and TGF-β1of the hyperoxic group were increasing and higher than those in the air group，lung injury also aggravated.Compared to the hyperoxic group，the treatment group showed increased IFN-γ and decreased IL-4 and TGF-β1；histopathological changes were alleviated as well.Conclusions Hyperoxia can result in acute lung injury in neonatal mice.Edaravone can regulate the content and ratio of IFN-γ and IL-4，decrease the expression of TGF-β1，thus play a role in prevention and treatment of hyperoxic lung injury.

Edaravone；lung injury；hyperoxia；IL-4；IFN-γ；TGF-β1；neonatal mouse

R363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.006

1005-8982（2016）09-0029-05

2015-11-20

張立明，E-mail：13963659081@163.com