董偉，劉福晨，倪俊聲，李鵬鵬，郭興剛，劉輝

（第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 肝外三科，上海 200438）

氟尿嘧啶聯(lián)合姜黃素納米劑型抑制肝癌細胞的研究*

董偉，劉福晨，倪俊聲，李鵬鵬，郭興剛，劉輝

（第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 肝外三科，上海 200438）

目的探究納米層狀雙氫氧化物（LDH）共載氟尿嘧啶（Fu）姜黃素（Cur）混合劑型對肝癌細胞的抑制作用。方法通過共沉淀法合成納米LDH混合劑型，并對其進行詳細表征，如電鏡（TEM）、X射線衍射（XRD）及動態(tài)光散射技術(shù)（DLS）檢測，細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）測定Fu組、Fu+Cur組及納米劑型組對7721、Hep G2和LM3細胞的增殖抑制作用，同時凋亡試劑盒檢測各組對7721細胞的凋亡效應(yīng)，Western blot檢測各組對細胞抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2蛋白的表達及下游Caspase的活化情況。結(jié)果合成的納米LDH混合劑型具有較好的均一性，DLS檢測提示其粒徑約為400nm，XRD提示Fu及Cur通過水平方式插入LDH層間；CCK8結(jié)果提示，相對于單純的Fu組、Fu+Cur組和LDH-Fu組，LDH-Fu-Cur組對LM3、Hep G2和7721細胞具有更強的增殖抑制作用（P＜0.05）。相對于單純的Fu組、Fu+Cur組和LDH-Fu組，LDH-Fu-Cur組對LM3、Hep G2和7721細胞具有更強的促凋亡效應(yīng)作用（P＜0.05），35μg/ml濃度的Fu納米混合劑型組凋亡率高達（87.0±4.7）%，而單純Fu僅為（23.0±2.3）%；Western blot檢測結(jié)果顯示，納米混合劑型能夠下調(diào)7721細胞Bcl-2水平。結(jié)論納米LDH混合劑型具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，其機制可能為下調(diào)腫瘤抗凋亡基因Bcl-2從而引起下游Caspase活化。

層狀雙氫氧化物；肝細胞癌；氟尿嘧啶；姜黃素；細胞凋亡

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位于腫瘤發(fā)病率的第5位，其死亡率在腫瘤中居第3位［1］。早期HCC患者的最佳治療措施是手術(shù)切除，然而HCC起病隱匿，確診時多屬晚期，已喪失手術(shù)機會。有數(shù)據(jù)顯示，早期進行手術(shù)切除的腫瘤患者，其術(shù)后也具有較高的復(fù)發(fā)率［2］，因此臨床上化學(xué)治療對于上述患者具有重要的治療意義。

單一化療藥物，如氟尿嘧啶（Fluorouracil，F(xiàn)u），存在治療窗口窄、毒副作用大等缺點。臨床上常采取的多種化療藥物聯(lián)用治療也存在不足，如多種藥物之間可能存在相互作用，多種藥物副作用的疊加效應(yīng)等［3-5］。近年來，傳統(tǒng)中藥的抑制腫瘤作用越來越受到關(guān)注，中藥輔助臨床常用的化療藥物不僅存在經(jīng)濟上的優(yōu)勢，還因中藥的毒副作用小而具有相對安全性。姜黃素（Curcumin，Cur）是來源于食物的天然藥物，具有廉價、安全等諸多優(yōu)點。研究表明，大劑量的姜黃素對于人體沒有明顯的毒副作用，基礎(chǔ)實驗也證實姜黃素具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多重作用［6］。同時文獻報道顯示，聯(lián)合化療藥物與姜黃素能夠抑制腫瘤生長［7］。但是姜黃素具有水溶性差、體內(nèi)代謝快等不足，如何充分發(fā)揮姜黃素的強大功能值得探究。

納米技術(shù)的發(fā)展為腫瘤藥物劑型提供新方向，納米技術(shù)具有諸多優(yōu)點：納米載體的pH敏感性、溫度敏感性，以及修飾的不同配體可以實現(xiàn)主動及被動靶向至腫瘤部位，基于納米技術(shù)的聯(lián)合用藥不僅局限于兩種藥物機械混合使用，還可以實現(xiàn)化療藥物的時序性、協(xié)同性作用［8-9］。層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）是一類具有雙層板狀結(jié)構(gòu)的陰離子型黏土，因具有無毒、高載藥量和pH敏感性等優(yōu)點，而受到廣泛關(guān)注。LDH板間帶負電荷，可用于陰離子物質(zhì)交換，可附載電離為陰離子的藥物及小分子的核酸，如LI等［10］采用LDH附載尿嘧啶和siRNA可用于腫瘤的藥物、基因聯(lián)合療法，為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供新思路。

基于文獻報道以及前期的實驗結(jié)果，本實驗利用LDH附載氟尿嘧啶、姜黃素納米混合劑型，并對其進行一系列的表征，采用7721、LM3和Hep G2細胞為模型，研究納米劑型對肝癌多細胞系的抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。

1　材料與方法

1.1實驗材料

六水硝酸鎂［Mg（NO3）2·6H2O，分析純］、九水硝酸鋁［Al（NO3）3·9H2O，分析純］、氫氧化鈉（NaOH，分析純）及二甲基亞砜［（dimethyl sulfoxide，DMSO），分析純］購自上?；瘜W(xué)試劑公司，高純氮購自上海比歐西氣體工業(yè)有限公司，1640培養(yǎng)液、小牛血清、胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、活細胞計數(shù)法試劑盒（cell counting kit 8，CCK8）及凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，氟尿嘧啶購自大連美侖生物有限公司，姜黃素購自阿拉丁試劑，7721、LM3、Hep G2和LO2細胞株購自中科院上海細胞庫，同濟大學(xué)生命科學(xué)院冷凍保存，所有抗體均購自美國Cell Signaling Technology （CST）公司。

1.2納米材料的合成

LDH的合成依據(jù)實驗室前期基礎(chǔ)。稱取NaOH 0.272 g溶于40 ml除二氧化碳CO2去離子水，于三口燒瓶中氮氣氛圍下充分攪拌5 min，10 ml溶解0.796 g Mg（NO3）2·6H2O和0.372 g Al（NO3）3·9H2O快速加入三口燒瓶中，60℃水浴快速攪拌，1 h后離心收集，除二氧化碳CO2去離子水清洗3遍。用40ml 0.15 mol NaOH溶液，其中溶解氟尿嘧啶或氟尿嘧啶加姜黃素，重懸上述離心收集的漿液。三口燒瓶60℃水浴快速攪拌1 h后，除CO2去離子水清洗3遍，70 ml除CO2去離子水重懸，放置于水熱釜中100℃、16 h后室溫冷卻，去離子水清洗3次即得LDH-Fu（LF）和LDH-Fu-Cur（LFC）。

1.3納米材料的表征

通過電鏡觀察LF和LFC的形貌，動態(tài)激光散射儀測定其粒徑，X射線衍射觀察其晶型結(jié)構(gòu)。紫外分光光度測定納米材料的載藥量。分別測定氟尿嘧啶在265 nm處及姜黃素在425 nm處的藥物標準曲線，根據(jù)標準曲線和待測樣品紫外吸收光密度（optical density，OD）值計算其相對應(yīng)的濃度。

1.4細胞培養(yǎng)

7721、LM3、Hep G2及LO2細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，細胞的傳代消化選用含EDTA的胰酶。

1.5增殖抑制試驗

7721、LM3和Hep G2細胞消化后重懸，接種于96孔板，接種數(shù)目約為每孔5 000個。待細胞增殖至約板底50%時，加入不同F(xiàn)u濃度的Fu、LF、LFC及Fu+Cur組，每孔100μl（Fu濃度分別為15、20、25、30和35μg/mL）。37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸去上清液培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗細胞2次后加入含10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基。37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，孵育適當時間，用酶標儀450nm測定OD值。根據(jù)對照組計算細胞存活率，每組3個復(fù)孔。LDH安全性評價采取不同濃度的LDH懸液作用于正常LO2肝臟細胞，步驟同上。

1.6凋亡實驗

7721細胞消化后重懸，接種于12孔板，計數(shù)約為10萬個/孔。待細胞長至板底約60%時，換1 ml新鮮培養(yǎng)基，設(shè)分別包含不同F(xiàn)u濃度的Fu、LF、LFC 及Fu+Cur組（Fu濃度分別為25、30和35μg/ml，LDH采取最高LFC對應(yīng)的LDH濃度評價LDH的促凋亡效應(yīng)），24 h后消化收集細胞，用無菌PBS清洗細胞2次，細胞凋亡雙染試劑盒膜聯(lián)蛋白-別藻藍素/7-氨基放線菌素D（annexin V-allophycocyanin/ 7-amino-actinomycinD，AnnexinVAPC/7-AAD）固定液500μl重懸，依次加入5μl APC和5μl 7-AAD，于流式細胞儀檢測。

1.7Western blot檢測

7721細胞消化離心后接種于6孔板，約15萬個/孔。分別加入LDH、Fu、LF、LFC及Fu+Cur（各組Fu為25μg/ml，LDH為LFC相對應(yīng)的LDH濃度），蛋白提取試劑盒提取全蛋白后采取二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量，分組點樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)膜后加封閉液室溫封閉1 h，分別加入Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗4℃孵育過夜后加入二抗，室溫輕搖1 h，加入增強化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光劑，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果，并拍照記錄。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，雙因素多水平方差分析，兩兩比較用SNK（Student-Newman-Keuls）法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1納米材料的表征

根據(jù)實驗室前期基礎(chǔ)，成功制備LF和LFC，結(jié)果顯示，LF具有較為均一的正六面體形貌（見圖1A），而LFC出現(xiàn)顯著的形貌變化（見圖1B）；XRD檢測用于評估氟尿嘧啶和姜黃素載入LDH的方式，各組材料均出現(xiàn)003和006特征峰（見圖1C）；動態(tài)激光散射測定LF平均半徑為（94.0±5.5）nm，LFC平均半徑為（200.0±6.4）nm（見圖1D），提示LDH具有良好的晶體結(jié)構(gòu)。LF的2θ角（003）發(fā)生在11.28°，晶面間距d為0.78 nm；LFC的2θ角（003）發(fā)生在10.64°，晶面間距d為0.84 nm，減去LDH板層的0.48 nm，剩余間距均非常接近氟尿嘧啶和姜黃素的層面高度，分別為0.34和0.32 nm，提示兩者是水平被插入LDH層間。另外結(jié)果還顯示，LFC特征峰顯著變?nèi)踝儗?，提示姜黃素晶體結(jié)構(gòu)差，有利于藥物的釋放；LF中Fu的載藥量為（19.56±0.32）%，LFC 中Fu和Cur的載藥量分別為（18.32±0.27）%和（15.64±0.25）%。

2.2肝癌細胞的增殖抑制試驗

增殖抑制結(jié)果顯示，各濃度下單純的LDH對正常肝臟細胞LO2的細胞存活率＞80%，提示LDH生物安全性良好（見圖2A）。相對于單純的Fu組，納米劑型對LM3、Hep G2和7721不同肝癌細胞系均有不同程度的增殖抑制效應(yīng)（見圖2B～D），從柱狀圖可以看出LFC各濃度下細胞存活率均小于Fu組，且在最高濃度下（Fu濃度為35μg/ml），LFC組7721細胞的存活率＜10%（見圖2D），LF及LFC組細胞存活率隨著藥物濃度的增加而下降。采取析因設(shè)計資料的方差分析比較濃度（檢驗值和P值為F1，P1）、組別（檢驗值和P值為F2，P2）對LM3、Hep G2、7721細胞存活率差異的影響，結(jié)果顯示，在給定的5%顯著性水平下，組別和濃度對LM3（F1=732.12，P1=0.000；P2=460.09，P2=0.000）、Hep G2（F1=604.87，P1=0.000；F2=1487.48，P2=0.000）和7721（F1=3401.73，P1=0.000；F2=4497.85，P2=0.000）細胞存活率的抑制作用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且組別與濃度間存在交差效應(yīng)（LM3：F=119.75，P=0.000；Hep G2：F=110.61，P= 0.000；7721：F=651.89，P=0.000）。各濃度間LM3、Hep G2和7721細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SNK多重比較結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的提高，細胞致死率明顯增加，35μg/ml組藥物處理后，細胞存活率低于其他組；SNK多重比較分別對LM3、Hep G2和7721細胞存活率差異進行組間兩兩比較，結(jié)果提示，3種細胞中Fu+Cur與Fu、LF與Fu、LFC與Fu、LF與Fu+Cur、LFC與Fu+Cur、LFC與LF兩組間細胞存活率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明Fu+Cur、LF、LFC較Fu均能降低LM3、Hep G2 及7721細胞存活率，而LFC組最強，即LFC組較其他組對于LM3、Hep G2和7721細胞具有明顯的增殖抑制作用。筆者采取7721細胞進行下一步實驗。

圖1LF及LFC的表征

2.3凋亡實驗

從流式凋亡結(jié)果圖可以看出，最高LFC濃度組的LDH濃度對于7721細胞的誘導(dǎo)凋亡率低，僅約為9%，提示LDH生物安全性良好。LFC組各濃度下的細胞凋亡率均高于單純Fu組，F(xiàn)u濃度為35μg/ml時Fu、Fu+Cur、LF及LFC對應(yīng)的凋亡率分別為（23.5±2.3）%、（40.0±3.5）%、（74.0±2.5）%和（87.0±4.7）%（見圖3）。采取析因設(shè)計資料的方差分析比較濃度、組別對7721細胞凋亡率差異的影響，結(jié)果提示，不同處理濃度對7721細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.27，P=0.000），說明各濃度藥物處理后誘導(dǎo)細胞的凋亡率存在差異，經(jīng)SNK法比較，得出35μg/ml組促進細胞凋亡率最明顯（P＜0.05）。不同組別處理7721細胞后細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=52.56，P=0.000），提示各組間細胞的凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，組間和濃度間無交差效應(yīng)。進一步采用SNK法對7721細胞進行組間兩兩比較，結(jié)果提示，F(xiàn)u+Cur與Fu、LF 與Fu、LFC與Fu、LF與Fu+Cur、LFC與Fu+Cur、LFC 與LF兩組間7721細胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)

意義（P＜0.05），兩組間7721細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Fu+Cur、LF、LFC較Fu都能促進7721細胞凋亡，而LFC組促凋亡率最高，即LFC較其他組對于7721細胞具有明顯的促凋亡效應(yīng)。

圖2　細胞增殖抑制試驗

圖3　7721細胞凋亡實驗

2.4Western Blot檢測

Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要基因，在細胞發(fā)生損傷時，可以使細胞逃逸死亡，下調(diào)Bcl-2可以引起下游Caspase活化，有效誘導(dǎo)細胞凋亡。Western blot檢測結(jié)果顯示，LFC組Bcl-2較其他組明顯下調(diào)，同時Caspase-3、Caspase-9較其他組明顯上調(diào)（見圖4），提示LFC具有較強的促凋亡效應(yīng)。

圖4　Western blot檢測

3　討論

肝癌起病隱匿且惡性程度高，發(fā)現(xiàn)多屬晚期，化學(xué)藥物在肝癌治療中必不可少，然而化療藥物的毒副作用常導(dǎo)致劑量降低或患者放棄治療，臨床上常采取的多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用也存在諸多不確定因素［3，5］。傳統(tǒng)中藥具有較強的抗腫瘤效果，且安全性高，卻存在生物利用度低等缺陷，本實驗成功制備LDH附載氟尿嘧啶和姜黃素的混合劑型，改善姜黃素水溶性差、生物利用度低等缺陷，充分發(fā)揮其抗腫瘤效果。

LDH是一類具有pH敏感性的雙層片狀結(jié)構(gòu)的納米載體，因其具有低毒、高細胞攝取率及高載藥量而被廣泛關(guān)注［11］，與本實驗結(jié)果相一致。實驗中LFC 中Fu和Cur的載藥量分別高達18.32%和15.64%，同時250μg/ml LDH對于正常肝臟LO2細胞沒有明顯的抑制作用，顯示其優(yōu)越的生物安全性。課題組前期報道顯示，LDH很容易被MDDCs細胞攝取，歸因于其Zeta電位為正電，容易被帶負電的腫瘤細胞獲?。?2］。

有文獻報道，聯(lián)合應(yīng)用氟尿嘧啶和姜黃素能夠?qū)崿F(xiàn)更好地抗腫瘤效果［13］。而本實驗中，單純的氟尿嘧啶及氟尿嘧啶和姜黃素的機械混合劑型對于7721細胞無明顯的增殖抑制效果，而LF和LFC均有明顯的增殖抑制效果，且LFC明顯強于LF，可能歸結(jié)于LDH的特殊作用。有文獻報道指出，納米材料能更大程度的被腫瘤細胞攝取，而納米載體本身具有緩釋性能，同時不易被細胞泵出，從而實現(xiàn)藥物在腫瘤內(nèi)的聚集，達到更好的抗腫瘤效應(yīng)［14］。

凋亡結(jié)果提示，低濃度的氟尿嘧啶、氟尿嘧啶和姜黃素機械混合劑型均表現(xiàn)出有限的誘導(dǎo)細胞凋亡率。而引入LDH后的LF及LFC均對照組有明顯的促凋亡效果，且LFC明顯強于LF，這不僅從另一方面顯示LDH的特殊作用，還可能與姜黃素相關(guān)。姜黃素是一類植物提取的天然性藥物，具有多重藥理活性［15］。文獻報道顯示，姜黃素能夠顯著下調(diào)Bcl-2水平，而Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要基因，在細胞發(fā)生損傷時，可以使細胞逃逸死亡，下調(diào)Bcl-2可以有效誘導(dǎo)細胞凋亡［16-18］。在本實驗中，Western Blot檢測結(jié)果顯示，LFC能夠顯著下調(diào)Bcl-2，從而激活Caspase信號通路，進而促進細胞凋亡。

綜上所述，筆者合成共載氟尿嘧啶及姜黃素的層狀雙氫氧化物納米劑型，增殖抑制及凋亡結(jié)果顯示其優(yōu)越的抗肝癌效果，其機制可能與LDH納米材料的特殊性能及姜黃素的多重藥理活性相關(guān)，其重要機制可能是下調(diào)Bcl-2水平促進細胞凋亡。層狀雙氫氧化物共載氟尿嘧啶姜黃素實現(xiàn)傳統(tǒng)中藥的老藥新用及中、西藥的聯(lián)用，為肝癌的化學(xué)治療提供新思路。

［1］JEMAL A，SIEGEL R，WARD E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2009，59（4）：225-249.

［2］MANCUSO A，PERRICONE G.Hepatocellular carcinoma and liver transplantation：state of the art［J］.Journal of clinical and translational hepatology，2014，2（3）：176-181.

［3］SHAKADO S，IWATA K，TSUCHIYA N，et al.Pilot study of hepatic arterial infusion chemotherapy with Interferon-beta and 5-fluorouracil：a new chemotherapy for patients with advanced hepatocellular carcinoma［J］.Hepato-gastroenterology，2014，61（131）：557-562.

［4］SONG M J，BAE S H，CHUN H J，et al.A randomized study of cisplatin and 5-Fu hepatic arterial infusion chemotherapy with or without adriamycin for advanced hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2015，75（4）：739-746.

［5］喬彬彬，虞希祥，王舒婷，等.TACE術(shù)中灌注氟尿嘧啶、奧沙利鉑及吡柔比星治療原發(fā)性肝癌的臨床效果分析 ［J］.介入放射學(xué)雜志，2015，24（4）：349-353.

［6］HEGER M，VAN GOLEN R F，BROEKGAARDEN M，et al. The molecular basis for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin and its metabolites in relation to cancer［J］. Pharmacological Reviews，2014，66（1）：222-307.

［7］張莉鑫.姜黃素聯(lián)用5-Fu對人結(jié)腸癌細胞凋亡的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（15）：2298-2301.

［8］YOKOYAMA M.Polymeric micelles as drug carriers：their lights and shadows［J］.Journal of Drug Targeting，2014，22（7）：576-583. ［9］ZHU Y，WU Y，ZHANG H，et al.Enhanced anti-metastatic activity of etoposide using layered double hydroxide nano particles［J］. Journal of Biomedical Nanotechnology，2015，11（12）：2158-2168.

［10］LI L，GU W，CHEN J，et al.Co-delivery of siRNAs and anti-cancer drugs using layered double hydroxide nanoparticles［J］. Biomaterials，2014，35（10）：3331-3339.

［11］RIAZ U，ASHRAF S M.Double layered hydroxides as potential anti-cancer drug delivery agents［J］.Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2013，13（4）：522-529.

［12］WANG J，ZHU R，GAO B，et al.The enhanced immune response of hepatitis B virus DNA vaccine using SiO2 LDH nanoparticles as an adjuvant［J］.Biomaterials，2014，35（1）：466-478.

［13］SADZUKA Y，NAGAMINE M，TOYOOKA T，et al.Beneficial effects of curcumin on antitumor activity and adverse reactions of doxorubicin［J］.International Journal of Pharmaceutics，2012，432（1/2）：42-49.

［14］CHEN Y，CHEN H，SHI J.Inorganic nanoparticle-based drug codelivery nanosystems to overcome the multidrug resistance of cancer cells［J］.Molecular Pharmaceutics，2014，11（8）：2495-2510.

［15］劉紅艷，王海燕，葉松，等.姜黃素藥理作用及其機制研究進展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（6）：48-51.

［16］董偉，劉輝.姜黃素抗腫瘤新劑型研究進展［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2015，36（7）：771-775.

［17］YANG J，NING J，PENG L，et al.Effect of curcumin on Bcl-2 and Bax expression in nude mice prostate cancer［J］.International Journal of Clinical and Experimental Pathology，2015，8 （8）：9272-9278.

［18］WENG Q，F(xiàn)U L，CHEN G，et al.Design，synthesis，and anticancer evaluation of long-chain alkoxylated mono-carbonyl analogues of curcumin［J］.European Journal of Medicinal Chemistry，2015，103（20）：44-55.

（童穎丹 編輯）

Co-delivery of fluorouracil and curcumin by nano-layered double hydroxide for inhibition of hepatocellular carcinoma cellsin vitro*

Wei Dong，F(xiàn)u-chen Liu，Jun-sheng Ni，Peng-peng Li，Xing-gang Guo，Hui Liu
（The Third Department of Hepatic Surgery，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai 200438，China）

Objective To evaluate the effects of fluorouracil and curcumin co-loaded nano-layered double hydroxide（NLDH）on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cell lines.Methods NLDH was synthesized by co-precipitation method.Detailed characterizations of NLDH such as its morphology，structure and particle size were performed by electron microscopy，X-ray diffraction（XRD）and dynamic light scattering technique（DLS）.The function of pure fluorouracil，fluorouracil and curcumin，fluorouracil loaded NLDH （LDH-Fu），fluorouracil and curcumin co-loaded NLDH（LDH-Fu-Cur）on cell viability of 7721，LM3 and Hep G2 cell lines was measured by CCK-8 kit.Meanwhile，apoptosis kit was applied to detect apoptosis of 7721 cells in the aforementioned groups.In order to explore the mechanism of apoptosis induced by fluorouracil and curcumin co-delivered NLDH，Western blot was used to detect the expression levels of apoptotic proteins such as Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9.Results NLDH，with a size of 400 nm，presented a good uniformity under electron microscope.XRD results indicated that fluorouracil and curcumin were horizontally inserted intothe interlayer of NLDH.CCK8 results indicated that LDH-Fu-Cur more efficiently inhibited the growth of 7721，LM3 and Hep G2 cell lines compared with pure fluorouracil，fluorouracil plus curcumin，and LDH-Fu （P＜0.05）.Similarly，LDH-Fu-Cur was more effective in promoting apoptosis than pure fluorouracil，fluorouracil plus curcumin，and LDH-Fu，as was evidenced by the apoptosis rate of LDH-Fu-Cur which was（87.0± 4.7）%with the fluorouracil concentration of 35 μg/ml while the apoptosis rate of pure fluorouracil was only （23.0±2.3）%with that concentration（P＜0.05）.Western blot results showed that NLDH could significantly down-regulate the Bcl-2 gene expression of 7721 cells and induce cell apoptosis by activating Caspase-3 and Caspase-9.Conclusions NLDH presents as a good carrier for anti-cancer drugs such as fluorouracil and curcumin and exhibits a potent anti-tumor effect，which make it a promising candicate for cancer therapy.

nano-layered double hydroxide；hepatocellular carcinoma；curcumin；fluorouracil；cell apoptosis

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.004

1005-8982（2016）09-0016-07

2015-11-26
*

國家自然科學(xué)基金面上項目（No：NSFC81271694）；科技部國際合作專項（No：010S2012ZR0058、2011DFA32980）

劉輝，E-mail：happyehbh@163.com；Tel：021-81875524