張 倫,胡小安,高順玉,徐成東

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

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元謀巨峰葡萄種子縮合單寧抗氧化性的研究*

張 倫,胡小安,高順玉,徐成東

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

縮合單寧是最有效的自由基清除劑之一，具有非常強(qiáng)的清除自由基和抗氧化的能力。論文以楚雄元謀地區(qū)巨峰葡萄籽為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探究了種子中縮合單寧的提取工藝及抗氧化活性。結(jié)果表明：縮合單寧提取的最佳條件是料液比為1∶6，乙醇濃度為70%，提取溫度50℃，提取時(shí)間定為30min，清除DPPH·(二苯基苦基肼)自由基的能力最佳的縮合單寧濃度為120ug/ml，清除率最高為85.98%。

巨峰葡萄；縮合單寧；抗氧化性

葡萄是世界上很受人們歡迎的水果，它的種植面積和產(chǎn)量在水果中都排世界第一位[1]。在葡萄籽眾多提取成分里，縮合單寧是葡萄多酚類(lèi)化合物，由于其擁有天然抗氧化性，并且能防止動(dòng)脈粥樣硬化，具有清除特定自由基、抗凝血、抗癌抗腫瘤、防治糖尿病等多種功效，因而倍受人們的青睞[2—4]。本研究以云南楚雄永仁地區(qū)種植的巨峰葡萄籽為實(shí)驗(yàn)材料，尋求最佳提取縮合單寧工藝，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為楚雄地區(qū)巨峰葡萄的種植和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料與儀器

巨峰葡萄采自楚雄元謀葡萄園，葡萄籽50—60℃的恒溫箱中烘干，粉碎，過(guò)篩(30—60)目，備用；無(wú)水乙醇、濃硫酸、香草醛、二苯基苦基肼、兒茶素均為分析純。

電子分析天平、DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)、KB5200型超聲波清洗器、HH-S2恒溫水浴鍋、SHZ-A循環(huán)水式真空泵、Alpha-1502紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司制造)。

1.2提取工藝流程

干燥的葡萄籽粉末→乙醇提取(超聲波輔助提取)→抽濾→烘干至恒重(50 ℃)→刮下粉末稱(chēng)重(分析天平)→配成溶液測(cè)吸光度

1.3縮合單寧含量的測(cè)定

香草醛-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。以?xún)翰杷貫闃?biāo)樣，配置1mg/ml的兒茶素/甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；配成0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml濃度；準(zhǔn)確配置3%的香草醛-甲醇溶液與30%的硫酸-甲醇溶液；在反應(yīng)體系0.5ml標(biāo)樣+2.5mlA3%香草醛+2.5mlB30%硫酸；溫度為30℃下避光反應(yīng)30min，后測(cè)其在500nm處的紫外吸收值，空白樣為0.5ml的甲醇。

1.4縮合單寧的測(cè)定

以香草醛-硫酸法測(cè)定縮合單寧的含量，具體實(shí)驗(yàn)法案如下：

用甲醇將提取出來(lái)的縮合單寧樣品配制成0.3mg/ml的待測(cè)樣品溶液。

空白：0.5 ml甲醇+2.5 ml3%香草醛+2.5 ml 30 %硫酸

樣品測(cè)定：0.5 ml樣品/甲醇+2.5 ml 3 %香草醛+2.5 ml 30 %硫酸,30 ℃避光反應(yīng)20min后測(cè)定 500 nm處的吸光值。

依據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的如下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(以?xún)翰杷貫闃?biāo)準(zhǔn))進(jìn)行代入法計(jì)算縮合單寧含量。

1.5葡萄籽粉末的含水率測(cè)定

稱(chēng)取2g葡萄籽粉末包好，放到烘干箱烘12h，取出稱(chēng)質(zhì)量。計(jì)算葡萄子粉末的含水率W。

W=烘干前-烘干后(g)/ 烘干前(g)

1.6縮合單寧抗氧化活性測(cè)定

清除二苯基苦基肼自由基(DPPH，2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl)法。DPPH·自由基清除率的測(cè)定公式：

IP%=Ac-(Ai -Aa)×100/Ac

其中：Ai—樣品對(duì)DPPH·作用后的吸光度數(shù)值；

Aa—反映樣品本身對(duì)吸光度的貢獻(xiàn)；

Ac—為DPPH·本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收。

通過(guò)計(jì)算IC50來(lái)展現(xiàn)出乙醇溶劑提取出的縮合單寧清除DPPH·自由基能力的大小。

IC50的計(jì)算試為：

1.7 數(shù)據(jù)處理

Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖

2.結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)方法所繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如下圖1所示：

圖1 兒茶素標(biāo)樣吸光度

根據(jù)兒茶素/甲醇標(biāo)樣測(cè)出吸光度后做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式是Y=3.516x+0.117,R2=0.993。我們測(cè)出縮合單寧樣液的吸光度后，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、提取率的公式計(jì)算出縮合單寧的提取率，最后根據(jù)提取率的柱狀圖挑選出最佳提取條件。

2.2葡萄籽含水率測(cè)定結(jié)果

表1 葡萄籽粉末含水率測(cè)定

由上表可以看出葡萄籽中含有的水分很少，烘干前后質(zhì)量基本無(wú)變化。

2.3粉碎粒度對(duì)提取率的影響

使用過(guò)篩后且粉碎粒度分別是30—60目的葡萄籽原料，在添加量固液比是1∶6，乙醇濃度是60%，溫度是40℃，提取時(shí)間是30min的條件下，來(lái)考察粉碎粒度對(duì)縮合單寧提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 粉碎粒度對(duì)縮合單寧提取效果的影響

在試驗(yàn)中，試驗(yàn)原料的表面積越大，即原料越細(xì)，得率就越高。如上圖2所示，葡萄籽粉碎粒度從30—60目，提取率一直上升，60目篩下的葡萄籽粉末縮合單寧的提取率達(dá)到最高。所以后文中的單因素、正交試驗(yàn)及縮合單寧的抗氧化性測(cè)定采用粉碎粒度為60目的葡萄籽粉末進(jìn)行。

2.4超聲波輔助提取法的單因素試驗(yàn)

2.4.1.料液比對(duì)縮合單寧提取效果的影響

本試驗(yàn)用粉碎粒度為60目下的葡萄籽粉末(以下試驗(yàn)都用60目)，以50%的乙醇作為提取溶劑，超聲波內(nèi)水溫是30℃，提取時(shí)間是30min，反映出的是不同料液比(1∶5,1∶6,1∶7,1∶8)對(duì)縮合單寧提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)縮合單寧提取效果的影響

縮合單寧是具有無(wú)毒、無(wú)過(guò)敏、安全性好的特性，縮合單寧在水中微溶，但在乙醇中能溶解得很好，固液比對(duì)葡萄種子中縮合單寧的提取效果影響較大，在一定范圍內(nèi)添加乙醇溶劑的用量可提高縮合單寧的得率，但不管什么條件都有一個(gè)最適的點(diǎn)，由上圖3可知當(dāng)料液比在1∶6以前時(shí)隨著提取溶劑的添加量的增大，縮合單寧的得率是呈上升的趨勢(shì)，料液比為1∶6時(shí)縮合單寧的得率達(dá)到最大，固液比為1∶6以后，增大固液比，縮合單寧的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象是由于乙醇水溶液的用量達(dá)到一定的量后，葡萄籽中含有的縮合單寧已經(jīng)全部被溶出，再增加乙醇水溶液的用量，不但提取率不會(huì)上升，而且提取得率有下降趨勢(shì)(如上圖所示)，還可能導(dǎo)致試驗(yàn)資源的浪費(fèi)，所以由上圖所示超聲波輔助提取法的最佳料液比定為1∶6。

2.4.2溫度對(duì)縮合單寧提取效果的影響

根據(jù)固液比的單因素試驗(yàn)，本試驗(yàn)將固液比定為1∶6(g/ml)、乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為30min的條件下，反映出的是不同超聲波水溫(30—60℃)對(duì)縮合單寧提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)縮合單寧提取效果的影響

由圖4可知，溫度在40℃以下時(shí)，跟隨試驗(yàn)中控溫的升高縮合單寧的得率也不斷增大。超聲波水溫在40℃以后，跟隨超聲波水溫的加大，縮合單寧的得率反而減小了，從上圖看出縮合單寧的最佳溫度是40℃。上圖反應(yīng)出提取溫度對(duì)縮合單寧的得率有一定的影響，超聲的熱效應(yīng)及空化作用會(huì)使局部產(chǎn)生高壓高溫，低溫不利于縮合單寧的提取，高溫則會(huì)加劇縮合單寧的分解，影響縮合單寧的提取率，因此在縮合單寧的最佳提取溫度40℃以后，跟隨超聲波水溫度的增加縮合單寧的得率減小了。

2.4.3乙醇濃度對(duì)縮合單寧提取效果的影響

根據(jù)以上固液比、溫度為變量所做試驗(yàn)，本試驗(yàn)在固液比為1∶6(g/ml)，超聲波水溫是40℃，時(shí)間是30min的條件下，考察了以下幾個(gè)乙醇體積分?jǐn)?shù)(50—80%)對(duì)縮合單寧提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對(duì)縮合單寧提取效果的影響

從上圖5可以看出，乙醇水溶液濃度在60%以前，跟隨乙醇水溶液濃度的升高，縮合單寧的得率有一個(gè)上升的趨勢(shì)，而乙醇水溶液的濃度在60%之后，跟隨乙醇水溶液濃度的加大，縮合單寧的提取得率在不斷減小。原因是縮合單寧是屬于極性物質(zhì)，在提取的過(guò)程中，乙醇濃度的改變會(huì)使提取溶劑的極性受影響而有所變化，進(jìn)而會(huì)使縮合單寧的溶解度和選擇性也受到影響，試驗(yàn)中根據(jù)相似相容的原理來(lái)調(diào)節(jié)乙醇和水的配比，從而使乙醇溶劑的極性有所改變，對(duì)縮合單寧的得率有較大的影響。在合適乙醇溶劑濃度下，應(yīng)該可以在得到比較大的縮合單寧得率的同時(shí)使提取物中蛋白的含有量盡量的少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明60%的乙醇溶液對(duì)葡萄籽中含有的縮合單寧的提取效果是最好的。所以縮合單寧最佳提取的乙醇水溶液的濃度是60%。

2.5正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件

2.5.1正交試驗(yàn)

在以上單因素的基礎(chǔ)上，選取超聲提取溫度、乙醇濃度、料液比作為因素變量，主要用縮合單寧的得率作為衡量尺度，采用L9(33)的正交表進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)[5]，因素水平如表2所示。

表2 試驗(yàn)因素水平L9(33)表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

由上表結(jié)果表明，超聲溫度、乙醇濃度、料液比三個(gè)變量因素對(duì)縮合單寧得率的影響的大小排序?yàn)椋毫弦罕?C)>乙醇濃度(B)>提取溫度(A)，并且由正交試驗(yàn)得出縮合單寧超聲波獲取的最優(yōu)工藝條件是:A3B3C2,即50℃、70%、1∶6。

綜合單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果，可以得出用超聲波輔助浸提法來(lái)獲取巨峰籽中縮合單寧最合適的工藝條件為：提取溫度為50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、固液比為1∶6(g/ml)、提取時(shí)間為30min。

2.6縮合單寧的抗氧化性測(cè)定

表5 不同縮合單寧濃度下的IP%和IC50

續(xù)上表

樣液濃度(ug/ml)708090100110120140160180200樣+DPPH的吸光度0069005500480047003900360048004200420041Aa0003000200020002-0002-00010002000200030002Ai0070005600490048004000370049004300430042IP%7528800782668303845085988266848785248524IC50(ug)282246219197179164141123110099

2.6.1縮合單寧濃度對(duì)自由基清除率的影響

縮合單寧具有很強(qiáng)的自由基清除能力，將粉碎粒度為60目的葡萄籽粉末，用最佳條件(1∶6，70%，50℃)提取出的縮合單寧做抗氧化測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 縮合單寧濃度對(duì)自由基清除率的影響

由圖6可以看出葡萄籽中縮合單寧具有較強(qiáng)的清除DPPH·自由基的能力，在縮合單寧含量為5-120ug/ml時(shí)，跟隨縮合單寧樣液濃度的逐漸升高，清除DPPH·自由基的能力也跟隨逐漸加強(qiáng)。當(dāng)縮合單寧的樣液濃度高于120ug/ml時(shí)，隨著縮合單寧樣液濃度的逐漸增大，清除DPPH·自由基的能力逐漸減小且趨于平穩(wěn)，所以清除DPPH·自由基的能力最佳的縮合單寧樣液濃度是120ug/ml，清除率最高可達(dá)85.98%。

2.6.2縮合單寧濃度對(duì)IC50的影響

通過(guò)計(jì)算IC50來(lái)評(píng)價(jià)乙醇溶劑提取縮合單寧清除DPPH·自由基能力的大小。

圖7 縮合單寧濃度對(duì)IC50(μg)的影響

由圖7可以看出在最佳條件下提取出的縮合單寧的清除DPPH·自由基能力，上圖反映出縮合單寧樣液濃度為5-10ug/ml的時(shí)候，縮合單寧清除DPPH·自由基的能力急劇變化；縮合單寧樣液濃度為10-80ug/ml的時(shí)候，縮合單寧清除DPPH·自由基的能力變化較緩慢；縮合單寧樣液濃度為80-200ug/ml的時(shí)候，縮合單寧清除DPPH·自由基的能力變化逐漸穩(wěn)定。

3.結(jié)論

以巨峰葡萄籽為原料來(lái)提取其濃縮單寧、探究了浸取溫度、料液比、乙醇濃度對(duì)橄欖樹(shù)皮中原花色素提取率的影響，并利用正交實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工業(yè)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)原花色素的提取率的影響次序?yàn)椋撼暅囟?、乙醇濃度、料液比三個(gè)變量因素對(duì)縮合單寧得率的影響的大小排序?yàn)椋毫弦罕?C)>乙醇濃度(B)>提取溫度(A)，并且由正交試驗(yàn)得出縮合單寧超聲波獲取的最優(yōu)工藝條件是: 溫度為50℃、乙醇濃度為70%、料液比為1:6 mg/mL，在該條件下原花色素的提取率可達(dá)4.6%。此外，巨峰葡萄籽中縮合單寧具有較強(qiáng)的清除DPPH·自由基的能力，隨著縮合單寧樣液濃度的逐漸增大，清除DPPH·自由基的能力逐漸減小且趨于平穩(wěn)，當(dāng)縮合單寧樣液濃度為120ug/ml，清除率最高可達(dá)85.98%。

[1]時(shí)國(guó)慶.葡萄籽中原花色素的提取,分離與抗氧化性研究[D].鄭州:鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004,5(01): 1—58.

[2] Sivakumaran S,Molan A.L, Meagher L.P.etal.Variation in antimicro—bial action of proanthocyanidins from Dorycnium rectumagainst rumen bacteria[J].Phytochemistry, 2004, 65 (17):2485—2497.

[3] Nergro C, Tommasi L, Miceli A. Phenolic compounds and antioxidant activity from red grape mare extracts[J].BioresourceTechnology, 2003,87(01):41—44.

[4]唐傳核,彭志英.葡萄多酚類(lèi)化合物以及生理功能[J].中外葡萄與葡萄酒,2000,2(04):12—15.

[5]汪榮鑫.數(shù)理統(tǒng)計(jì)[M].西安:西安交通大學(xué)出版社,2000.

(責(zé)任編輯 徐成東)

A Study on Condensed Tannins Antioxidant Activity of Meiguixiang Grape Seed

ZHANG Lun, HU Xiaoan, GAO Shunyu & XU Chengdong

(SchoolofChemistryandLifeScience,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong, 675000,YunnanProvince)

Condensed tannins are one of the most effective free radical scavenger; which have very strong ability of scavenging free radical and antioxidant. Taking the Kyoho-grape seed from Yuanmou district in Chuxiong as the raw material, the extraction technology and antioxidant activities of the condensed tannins have been studied by single factor and orthogonal experiments. The results show that the best extraction conditions of condensed tannin extract is 1:6, ethanol concentration is 70%, extraction temperature 50℃, extraction time is 30min. The condensed tannin concentration of the best scavenging rate of the free radical (DPPH，2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) was 120ug/ml; the scavenging rate was 85.98%.

Kyoho-grope; condensed tannins; antioxidant activity

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2014FD052；楚雄師范學(xué)院學(xué)術(shù)骨干資助，項(xiàng)目編號(hào)：13XJGG03。

2016 - 05 - 16

張 倫(1978—)，女，博士，講師，從事天然產(chǎn)物化學(xué)工作。

徐成東(1964—)，男，博士，教授，從事植物學(xué)與植物生態(tài)學(xué)研究。

S663.1

A

1671 - 7406(2016)06 - 0032 - 07