馬茹霞，洪艷華，艾士奇，鄧兵，賈軍，晏磊，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶163319）

牛糞攪拌式固定床沼氣發(fā)酵條件的優(yōu)化

馬茹霞，洪艷華，艾士奇，鄧兵，賈軍，晏磊，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶163319）

以牛糞為沼氣發(fā)酵原料，利用連續(xù)攪拌式反應(yīng)器（Continuous stirred tank reactor，CSTR）和碳纖維載體構(gòu)建攪拌式固定床反應(yīng)器，研究料液濃度（TS）、碳氮比（C/N）、溫度、pH、水力停留時間（HRT）和攪拌轉(zhuǎn)速對甲烷產(chǎn)量的影響，通過響應(yīng)面設(shè)計進行回歸分析，結(jié)合滿意度函數(shù)確定牛糞攪拌式固定床厭氧發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)。研究結(jié)果表明最佳工藝條件為：TS 8%，C/N 25∶1，溫度39℃，pH 7.5，HRT 10 d。驗證分析表明，模型預(yù)測值與試驗值相吻合（偏差2.27%），模型擬合度較好。

牛糞；攪拌式固定床；沼氣；響應(yīng)面分析法；發(fā)酵條件優(yōu)化

隨著我國奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，大量未處理的牛糞日益成為環(huán)境污染的重要因素，對牛糞進行厭氧發(fā)酵處理是當前實現(xiàn)其無害化與資源化的主要的手段之一［1］。傳統(tǒng)的厭氧發(fā)酵連續(xù)攪拌式反應(yīng)器（Continuous stirred tank reactor，CSTR）工藝具有發(fā)酵時間長、沼氣產(chǎn)量低、微生物易隨發(fā)酵產(chǎn)物排出而浪費等缺點［2］，如果添加適宜的載體固定反應(yīng)器中的微生物進而增加微生物的滯留期，可提高反應(yīng)器的發(fā)酵性能［3］。孫宇等人以牛糞為發(fā)酵原料，篩選厭氧發(fā)酵固定床最佳載體材料，以碳纖維薄膜為載體的沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量分別比不加載體提高12.1%和15.6%［4］。林長松等研究發(fā)現(xiàn)在固定床厭氧反應(yīng)器中添加炭纖維載體具有較高的COD去除率和產(chǎn)氣效率，能夠抵抗低pH、高負荷沖擊的能力，在運行過程中不易發(fā)生反應(yīng)器堵塞的現(xiàn)象［5］。但實際生產(chǎn)應(yīng)用中，在牛糞為原料的沼氣發(fā)酵體系中采用固定床工藝來提高沼氣產(chǎn)量至今還沒有取得實質(zhì)性進展，所以在農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用化方面，探究良好的牛糞沼氣固定床發(fā)酵工藝具有重要意義。

在設(shè)計實驗，建立模型時，響應(yīng)面法（response surface method，RSM）能夠評價多個因素作用，尋求出最優(yōu)條件，能有效減少實驗處理次數(shù)［6］。在沼氣發(fā)酵工藝的研究中，可以通過實驗設(shè)計的有限個工藝參數(shù)有效評價沼氣發(fā)酵過程中某些變量之間的交互作用［7］。在已有研究基礎(chǔ)上，采用單因素和響應(yīng)面分析結(jié)合的方法對影響沼氣發(fā)酵的主要因素進行優(yōu)化，提高反應(yīng)體系的產(chǎn)氣性能，為牛糞高效生產(chǎn)沼氣技術(shù)提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

1 原料與方法

1.1 試驗原料

沼氣發(fā)酵原料為新鮮牛糞（黑龍江八一農(nóng)墾大學附近養(yǎng)牛場），試驗前粉碎大塊牛糞，過篩去除其中的雜物。剩余牛糞保存于-20℃冰箱備用。經(jīng)pH計（日本HORIBA）測定新鮮牛糞的pH為7.8，利用灼燒法測定牛糞TS含量為17.89%，VS含量為16.95%，經(jīng)碳氮元素分析儀（德國Multi N/C 2100S）測定牛糞的TN含量為1.99%，C/N為31.9∶1。

1.2 試驗裝置

試驗裝置采用1 L螺口瓶，以碳纖維為載體構(gòu)建攪拌式固定床反應(yīng)器，利用橡膠塞密封。發(fā)酵罐頂部設(shè)有排氣口和取樣口，排氣口通過橡膠管與1 L的集氣袋相連，用于收集氣體，通過Geotech公司的GA2000便攜式沼氣分析儀（Geotech Biogas Check）測定沼氣中甲烷含量，通過恒溫搖床（BS-1E，上海有限公司）控制發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速，利用蠕動泵（BQ80S，北京五洲東方科技有限公司）循環(huán)進出料液調(diào)節(jié)HRT。

1.3 試驗方案

1.3.1 單因素試驗

1.3.1.1 發(fā)酵料液初始TS對甲烷產(chǎn)量的影響

發(fā)酵罐裝料量為800 mL。設(shè)定初始料液濃度分別為4%、6%、8%和10%，初始pH為7.5，添加尿素和蔗糖調(diào)節(jié)初始料液的C/N為25∶1，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，將發(fā)酵裝置置于轉(zhuǎn)速為120 r·min-1恒溫搖床上，35℃下厭氧發(fā)酵30 d。使用便攜式沼氣分析儀測定產(chǎn)氣量和甲烷含量。發(fā)酵料液裝量和測定指標下同。

1.3.1.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)甲烷量的影響

設(shè)定發(fā)酵初始TS為8%，pH值為7.5，C/N為 25∶1，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，分別置于25、30、35和40℃的恒溫搖床中，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)30 d。

1.3.1.3 發(fā)酵料液初始碳氮比（C/N）對產(chǎn)甲烷量的影響

設(shè)定發(fā)酵初始TS為8%，pH值為7.5，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，調(diào)節(jié)初始料液的C/N為20∶1、25∶1、30∶1和35∶1，35℃下，120 r·min-1發(fā)酵30 d。

1.3.1.4 攪拌轉(zhuǎn)速對產(chǎn)甲烷量的影響

設(shè)定發(fā)酵初始TS為8%，pH值為7.5，C/N為25∶1，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，設(shè)定攪拌速度為80、100、120和150 r·min-1，35℃下發(fā)酵30 d。

1.3.1.5 初始pH值對產(chǎn)甲烷量的影響

設(shè)定發(fā)酵初始TS為8%，C/N為25∶1，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，調(diào)節(jié)發(fā)酵料液初始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，35℃下，攪拌轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)30 d。

1.3.1.6 HRT對甲烷產(chǎn)量的影響

設(shè)定發(fā)酵初始TS為8%，pH值為7.5，C/N為25∶1，每個處理設(shè)置4個重復(fù)，HRT分別設(shè)定為9、15、21和27 d，利用蠕動泵循環(huán)進出料液調(diào)節(jié)HRT，每個處理發(fā)酵時間為兩個循環(huán)，35℃下，攪拌轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)30 d。

1.3.2 響應(yīng)面和滿意度函數(shù)分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對發(fā)酵過程中甲烷產(chǎn)量具有顯著影響的因素，采用Design-Expert 7.0軟件中4因素5水平的CCD（Central composite design）構(gòu)建響應(yīng)曲面模型，選擇TS、HRT、溫度和C/N四個顯著性因素作為自變量設(shè)計分析。響應(yīng)變量設(shè)定為TS、甲烷產(chǎn)率（Y1）和甲烷產(chǎn)量（Y2），自變量設(shè)定為TS（X1）、HRT（X2）、C/N（X3）和溫度（X4），其中變量的取值范圍參考上述的單因素試驗結(jié)果，分別設(shè)定X1為（2%、4%、6%、8%、10%），X2為（4 d、10 d、16 d、22 d、28 d），X3為（20、25、30、35、40）和X4（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）。并以編碼值-2、-1、0、+1、+2分別代表自變量不同水平。

試驗采用最小二乘法擬合的二次多項式方程來預(yù)測自變量與因變量的關(guān)系，得到多元二次回歸方程見（1）。

其中，b0是參數(shù)項，b1、b2、b3、b4是線性系數(shù)，b12、b13、b14、b23、b24、b34是交互項系數(shù)，b11、b22、b33、b44是二

次項系數(shù)。試驗設(shè)計共有30個試驗點，試驗參數(shù)變化對試驗結(jié)果的影響有24個析因點，有6個試驗條件相同的中心點，用來評估模型的純誤差。

在沼氣發(fā)酵工藝設(shè)計的響應(yīng)曲面模型中含有Y1和Y2兩個響應(yīng)變量，而且這兩個變量的最優(yōu)值所對應(yīng)的最佳試驗條件不同，所以采用Design-Expert 7.0軟件中的滿意度函數(shù)（Desirability）分析方法，對該發(fā)酵工藝進行二響應(yīng)、多變量的同時優(yōu)化。此方法將每個響應(yīng)轉(zhuǎn)換成滿意度函數(shù)，統(tǒng)一對各變量與TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷量的影響進行評價，并對模型的可靠性進行驗證試驗。

表1 單因素試驗結(jié)果及方差分析Table1 Single factor test results and variance test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同初始條件對甲烷產(chǎn)率的影響

表1結(jié)果顯示，TS甲烷產(chǎn)率隨著料液濃度的增加先上升后下降，當TS為4%時，TS甲烷產(chǎn)率最低（17.73 mL·g-1）；當TS為8%時，TS甲烷產(chǎn)率最高（33.00 mL·g-1）。各個處理間有顯著差異（R2＜0.000 1），說明底物濃度與甲烷產(chǎn)率相關(guān)顯著。起始pH值（6.0～8.0）、攪拌轉(zhuǎn)速對TS甲烷產(chǎn)率影響差異性均不顯著。pH值為7.5時，TS甲烷產(chǎn)率最高，為36.97 mL·g-1。而試驗發(fā)現(xiàn)，適度的攪拌有利于發(fā)酵料液充分混合，減少出現(xiàn)堵塞和噴罐的現(xiàn)象。隨著C/N的增加，TS甲烷產(chǎn)率先升高后下降，除C/N為20∶1和25∶1的差異不顯著外，各處理間差異性顯著，C/N為25∶1時，TS甲烷產(chǎn)率最高。TS甲烷產(chǎn)率隨溫度的增加先升高后略有下降，當溫度達到30℃～35℃時，TS甲烷產(chǎn)率最高，達到了37.25 mL·g-1，說明適宜的溫度有利于甲烷的產(chǎn)生，溫度過高和過低都會影響甲烷的生成。TS甲烷產(chǎn)率隨HRT先升高后降低，各個處理間差異顯著，當HRT為15 d時，TS甲烷產(chǎn)率最高。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以TS甲烷產(chǎn)率作為衡量指標，用SPASS軟件進行方差分析。結(jié)果顯示，影響TS甲烷產(chǎn)率顯著的因素為濃度、碳氮比、溫度和水力停留時間。其中，濃度和溫度達到極顯著水平，C/N和HRT達到顯著水平。pH值和攪拌轉(zhuǎn)速影響較小，未達到顯著水平。

表2 CCD設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Design matrix and results of central composite experiment design

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化

以產(chǎn)氣率和甲烷產(chǎn)量作為評價沼氣發(fā)酵效果的指標，選擇對甲烷產(chǎn)率影響顯著的4個因素（TS、C/N、HRT和溫度）進行優(yōu)化，產(chǎn)氣率和甲烷產(chǎn)量越高，沼氣發(fā)酵效果越理想。為了得到最優(yōu)化的實驗條件和結(jié)果，建立響應(yīng)變量與自變量之間的函數(shù)關(guān)系，構(gòu)建特定的響應(yīng)曲面圖，找出最佳響應(yīng)值及其對應(yīng)自變量的取值范圍。

2.2.1 實驗設(shè)計及響應(yīng)曲面模型的方差分析

根據(jù)CCD試驗設(shè)計，共進行了30組發(fā)酵實驗，試驗方案和結(jié)果見表2。對結(jié)果進行多元回歸擬合，得出TS（X1，%）、HRT（X2，d）、C/N（X3）和溫度（X4，℃）與TS甲烷產(chǎn)率（Y1，mL·g-1）和日產(chǎn)甲烷量（Y2，mL）的二次多項式回歸方程，見公如（2）和公式（3）。

TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷量模型的方差分析（ANOVA）結(jié)果見表3，TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷量的失擬項分別為0.531 4和0.131 5，失擬程度都不顯著，說明此模型可以用來預(yù)測和分析厭氧發(fā)酵TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷產(chǎn)量。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)建立的二次多項式數(shù)學模型具有顯著性，TS甲烷產(chǎn)率的R2為0.953 5，日產(chǎn)甲烷量的R2值為0.966 80，說明預(yù)測值和試驗值之間具有很好的擬合度。TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷量的Adj R2（調(diào)整確定系數(shù)）分別為0.910 1和0.938 1，這兩個模型方程分別能解釋91.01%的TS甲烷產(chǎn)率響應(yīng)值變化和93.81%的日產(chǎn)甲烷量響應(yīng)值變化。

表4 響應(yīng)曲面模型的回歸系數(shù)與顯著性水平Table 4 Regression coefficients and their significance level for response surface quadratic model

由表4可知，在Y1模型中，一次項X1對TS甲烷產(chǎn)率的線性效應(yīng)極顯著，X3和X4對TS甲烷產(chǎn)率響應(yīng)顯著，X2對其相應(yīng)不顯著。二次項X12對TS甲烷產(chǎn)率的曲面效應(yīng)極顯著，X22對TS甲烷產(chǎn)率效應(yīng)顯著。交互作用對TS甲烷產(chǎn)率的影響不大，表明各因素對TS甲烷產(chǎn)率的影響不是簡單的線性關(guān)系。結(jié)合TS甲烷產(chǎn)率的響應(yīng)曲面圖（圖1），（a）中可見，在C/N為30、溫度為35℃、編碼值0的情況下，TS甲烷產(chǎn)率（Y1）隨TS（X1）的增加而增加，說明兩者呈正相關(guān)性。HRT（X2）在范圍內(nèi)呈二次方程曲線變化，而對TS甲烷產(chǎn)率的影響不明顯。TS與HTR的交互性顯著。由（b）可知，在HRT為16 d、溫度為35℃時，C/N對TS甲烷產(chǎn)率的影響也較大，TS與C/N交互作用不顯著。在（c）中，HRT 16 d、C/N為30時，TS甲烷產(chǎn)率隨溫度的增加而增加，影響顯著，溫度與TS的交互性顯著。結(jié)合回歸方程表5可知，X1的系數(shù)為2.5。對影響TS甲烷產(chǎn)率的因素主次順序為：TS＞C/N＞溫度＞HTR。

圖1 TS甲烷產(chǎn)率的曲面響應(yīng)圖Fig.1 The RSM plots of TS methane yield

在Y2模型中，一次項X1和X2對日產(chǎn)甲烷量的線性效應(yīng)極顯著，二次項X22對日產(chǎn)甲烷量的響應(yīng)極顯著，各因素的交互作用對日產(chǎn)甲烷量的影響也不大。日產(chǎn)甲烷量的響應(yīng)曲面圖如圖2所示。（a）HRT為16 d、溫度為35℃時，日產(chǎn)甲烷量隨TS的增加而增加，隨C/N的增加而減小，TS和C/N對日產(chǎn)甲烷量的影響極顯著，C/N與TS對日產(chǎn)甲烷量的交互作用不顯著。由（b）可見，在HRT為16 d、C/N為30時，溫度的變化對日產(chǎn)甲烷量的影響不顯著，TS與溫度的交互作用也不顯著。由（c）可知，在TS為6%、HRT為16 d時，日產(chǎn)甲烷量隨溫度的增加先增加后減小，可見適宜的發(fā)酵溫度有利于甲烷的產(chǎn)生。通過結(jié)合回歸方程表5，在Y2模型中，影響日產(chǎn)甲烷量的因素的主次順序為：HRT＞TS＞C/N＞溫度。

圖2 日產(chǎn)甲烷量的曲面響應(yīng)圖Fig.2 The RSM plots of methane yield per day

2.3 滿意度函數(shù)優(yōu)化模型

利用Design-Expert 7.0軟件Desirability函數(shù)對Y1和Y2兩個響應(yīng)變量同時進行優(yōu)化，優(yōu)化的試驗條件包括X1、X2、X3和X4。每個自變量（Xi）和響應(yīng)量（Yi）的重要性的取值范圍為1～5，n值一般設(shè)定為軟件默認值。實驗設(shè)定的各自變量參數(shù)條件Xi和響應(yīng)值Yi的范圍見表5。由表可知，各響應(yīng)值與參數(shù)值的高低限都是設(shè)定為實驗的默認值，因為TS甲烷產(chǎn)率是最關(guān)鍵的評價指標，將其重要值設(shè)為最高值5，甲烷產(chǎn)量的重要值為4，其余各項均為默認值3。

由滿意度函數(shù)優(yōu)化處理后得到的各變量的di值與D值見圖3，可知TS甲烷產(chǎn)率的di值為0.367 9，日產(chǎn)甲烷量的di值為0.128 0，而其余各參數(shù)的di值均為1，系統(tǒng)的總體滿意度值D為0.230 1。Design-Expert 7.0軟件給出的Desirability函數(shù)的優(yōu)化方案是：TS 8%，HRT 10 d，溫度為39℃，C/N 25∶1。

表5 滿意度函數(shù)的變量范圍Table 5 The lower limit and upper limit values of the individual response of desirability

圖3 各變量的di及總體滿意度D的條形圖Fig.3 Bar graph representing individual desirability of all response in correspondence with combined desirability（D）

2.4 優(yōu)化處理試驗驗證

根據(jù)滿意度函數(shù)優(yōu)化的回歸模型所預(yù)測出的最優(yōu)條件，進行3次牛糞厭氧沼氣發(fā)酵試驗驗證優(yōu)化模型的可靠度和準確度，試驗結(jié)果得出：平均TS甲烷產(chǎn)率為38.43 mL·g-1，平均日產(chǎn)甲烷量為188.2 mL，預(yù)測值與試驗值基本吻合，二者偏差2.27%。由此說明響應(yīng)面與滿意度函數(shù)分析法相結(jié)合可以用來優(yōu)化以牛糞為原料的發(fā)酵產(chǎn)沼氣工藝。

3 討論與結(jié)論

研究表明，固定床載體能將大量厭氧微生物固定，使反應(yīng)器內(nèi)保持有較高濃度的活性污泥，從而有效提高反應(yīng)器的運行性能［6］。TS、溫度、C/N、HRT、pH等條件能在不同程度上影響甲烷的產(chǎn)出［8-13］，試驗研究表明，發(fā)酵溫度較低時，系統(tǒng)啟動較慢，啟動需時較長，TS甲烷產(chǎn)率低，但溫度過高也會抑制甲烷產(chǎn)出；TS甲烷產(chǎn)率隨著發(fā)酵料液濃度的增加先上升后下降，宋籽霖等［14］的研究也表明，發(fā)酵料液濃度并不是越高越好。單因素試驗中，pH和攪拌轉(zhuǎn)速對TS甲烷產(chǎn)率影響不顯著，但Khursheed.K研究表明，適度的攪拌能提高產(chǎn)氣效率，發(fā)酵濃度增加，效果越明顯［15］。分析原因，可能是因為應(yīng)用的試驗材料不同所致。

在牛糞厭氧發(fā)酵條件研究結(jié)果中表明，進料TS和C/N是影響牛糞厭氧消化產(chǎn)氣效果的重要因素，其應(yīng)用響應(yīng)面法同時優(yōu)化沼氣產(chǎn)率、甲烷含量和COD去除率，篩選出三者共同的最佳條件為TS 6.49%，溫度35.37℃，C/N 25.36∶1［16］。試驗對TS甲烷產(chǎn)率和日產(chǎn)甲烷量兩個響應(yīng)變量進行優(yōu)化，得出對TS甲烷產(chǎn)率影響最大的兩個因素是底物濃度，其次是C/N。得出最終優(yōu)化方案：TS 8%，溫度39℃，C/N 25∶1，HRT 10 d，與上述優(yōu)化條件基本一致。但研究的日產(chǎn)甲烷量更高，產(chǎn)甲烷效果較好可能與采用的攪拌式固定床反應(yīng)器有關(guān)。

固定床對產(chǎn)甲烷微生物具有截留作用，適度的攪拌使發(fā)酵原料與微生物混合均勻，增加了物料與微生物的接觸機會，從而提高反應(yīng)效率。

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Optim ization of Fermentation Conditions of M ixing Type Fixed Bed Reactor Using Cow M anure as the Feedstock

M a Ruxia，Hong Yanhua，Ai Shiqi，Deng Bing，Jia Jun，Yan Lei，W ang W eidong
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Mixing type fixed bed reactor was built combining the Continuous Stirred Tank Reactor（CSTR）and carbon fiber carrier. The effects of total solid（TS），carbon and nitrogen ratio（C/N），temperature，pH，hydraulic retention time（HRT）and stirring speed on biogas production were investigated using cow manure as the feedstock.According to the analysis of response surface method logy and desirability function，the optimum conditions for biogas yield was as follows：materials density 8%，hydraulic retention time 10 d，temperature 39℃，pH 7.5，carbon and nitrogen ratio 25∶1.After model validation，experimental and predictive value was consistent and the test result and the relative deviation was 2.27%.

cow manure；mixing type fixed bed；biogas；response surface analysis；optimization of fermentation conditions

X713；S216.4

A

1002-2090（2016）03-0105-08

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.021

2015-12-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD12B05-3，2015BAD21B04）；黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊計劃項目（2012TD006）。

馬茹霞（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院2014級碩士研究生。

王偉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：wwdcyy@126.com。