孫蕊，王學(xué)群，李朝陽，李洪飛，賈鵬禹

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319）

高效液相色譜法測定木糖母液及發(fā)酵液中單糖含量

孫蕊，王學(xué)群，李朝陽，李洪飛，賈鵬禹

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319）

建立了木糖母液及其酵母發(fā)酵液中葡萄糖和半乳糖含量的高效液相色譜測定方法。測定方法基于鉛配位體交換色譜分離模式，色譜分離柱采用Sepax Carbomix Pb-NP5（300×7.8 mm ID，5 μm，8%交聯(lián)度）色譜柱，柱溫75℃；流動相采用超純水（100%），泵速0.55 mL·min-1；示差折光檢測器溫度30℃；木糖母液樣品采用固相萃取脫色前處理，母液的發(fā)酵液樣品采用乙腈沉淀蛋白前處理。在最終的方法條件下，葡萄糖和半乳糖組分在25 min內(nèi)完成基線分離，在0.2～10.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法檢測限分別為0.124 mg·mL-1和0.115 mg·mL-1。儀器系統(tǒng)簡單，方法重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。

葡萄糖；半乳糖；木糖母液；發(fā)酵液；高效液相色譜法

木糖由酸水解玉米芯等天然半纖維素經(jīng)凈化、結(jié)晶等工藝制成，一般用做加氫生產(chǎn)木糖醇的初級產(chǎn)品。木糖企業(yè)在制得結(jié)晶木糖的同時，離心分流出大量木糖結(jié)晶后殘液（木糖母液），以往母液被廉價出售用于生產(chǎn)焦糖色素［1，6］。近年來，模擬移動床（SMB）色譜分離成為木糖母液中單糖高效回收利用的重要技術(shù)［2-5］，該技術(shù)手段不但可得到高純木糖，同時可得到高純、高附加值的阿拉伯糖，現(xiàn)已實現(xiàn)技術(shù)轉(zhuǎn)化并達到規(guī)?；a(chǎn)。木糖母液中除了含有木糖和阿拉伯糖以外，還含有葡萄糖和半乳糖等雜糖組分，葡萄糖的存在增加了糖液的黏度，影響料液傳質(zhì)速度［6-7］，同時雜糖組分增加了模擬移動色譜分離難度，所以在回收利用木糖母液之前一般采用酵母發(fā)酵去除母液中的葡萄糖［6］，也有報道有些酵母也可同時去除母液中的半乳糖［8］；實踐證明，在模擬移動床分離母液后的木糖收集液中存在少量半乳糖會影響木糖的結(jié)晶得率和產(chǎn)品純度。因此，工藝流程中葡萄糖和半乳糖的組分含量是調(diào)控和評價木糖母液模擬移動色譜回收工藝及產(chǎn)品純度的重要技術(shù)指標(biāo)。

由于木糖母液及其發(fā)酵液樣品基體十分復(fù)雜，對其組分測定方法提出了更高的要求，其中單糖分析方法一直受到眾多科研工作者的關(guān)注。針對葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖4種常見半纖維素來源的目標(biāo)成分，孫廣仁等利用鈉型配位體交換樹脂色譜柱分離檢測木糖母液中的單糖組成，但是半乳糖和阿拉伯糖無法分離［8］，而利用鈣型配位體交換樹脂檢測單糖，木糖和半乳糖無法分離［9］；另有采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生單糖組分結(jié)合紫外-可見檢測器測定木糖液中的多種單糖［10-12］，但方法樣品前處理較為耗時且果糖衍生效果較差。利用鉛型配位體交換色譜分離柱，結(jié)合固相萃取等樣品前處理方法，檢測了木糖母液及其酵母發(fā)酵液樣品中葡萄糖及半乳糖含量，建立了鉛配位體交換結(jié)合示差折光檢測高效液相色譜測試方法，所建檢測方法可為木糖生產(chǎn)企業(yè)工藝過程中目標(biāo)物監(jiān)測及木糖、阿拉伯糖產(chǎn)品質(zhì)量檢驗提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：LC-20AT日本Shimadzu公司），配備：在線真空脫氣機、高壓恒流泵、恒溫柱溫箱、示差折光檢測器、LC solution色譜工作站；電子分析天平（感量：0.000 1 g瑞士梅特勒公司）；離心機（最大轉(zhuǎn)速：16 000 rpm上海安亭科學(xué)儀器廠）；固相萃取儀（位數(shù)：20美國沃特世公司）；超純水機（型號：Master-E上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試劑、實驗材料

D-半乳糖、D-葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。實驗所用乙腈為HPLC級、水為超純水，其他實驗試劑均為進口光譜級或分析級試劑；木糖母液由黑龍江省鶴崗市經(jīng)緯糖醇有限公司提供（糖度Brix 60.7%），發(fā)酵液由實驗室利用木糖母液加入啤酒酵母經(jīng)發(fā)酵獲得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制與樣品前處理

精密稱取D-半乳糖和D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g，精確至0.000 1 g，用超純水溶解標(biāo)準(zhǔn)品并定容至于10 mL棕色容量瓶中，配制成2種單糖的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲備液4℃保存，分析前用水逐級稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)0.45 μm的水相濾膜慢速過濾后上機分析，以各標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度對應(yīng)峰面積做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算得出線性回歸方程。

精密量取木糖母液樣品2 mL用純水稀釋后定容至200 mL容量瓶中，待混勻后量取定容溶液5 mL滴入經(jīng)80%（v/v）乙腈預(yù)活化的活性炭固相萃取小柱內(nèi)，在負(fù)壓下收集流出液，先棄去前3 mL液體，收集后2 mL流出液，該液經(jīng)0.45 μm的水相濾膜過濾后上機分析。

精密量取木糖母液的發(fā)酵液樣品10 mL用純水稀釋后定容至200 mL容量瓶中，待混勻后量取稀釋液5 mL加入1 mL乙腈，劇烈震蕩1 min，靜止后以12 000 rpm轉(zhuǎn)數(shù)離心10 min，取上層清液經(jīng)0.45 μm的有機相濾膜過濾后上機分析。

單一標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，峰面積外標(biāo)法或峰面積歸一化法定量。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：賽分Carbomix Pb-NP5（300×7.8 mm ID，5 μm，8%交聯(lián)度），配同系保護柱Carbomix Pb-NP5（50×7.8 mm ID，5 μm，8%交聯(lián)度）；流動相：超純水（100%）；泵速：0.55 mg·mL-1；經(jīng)典柱壓：37 bar；柱溫：75℃；示差折光檢測器溫度：30℃，響應(yīng)時間：6 s；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法適應(yīng)性考察

實驗對木糖母液（A）及其發(fā)酵液（B）樣品中目標(biāo)組分的分離情況進行了方法適應(yīng)性考察。由圖1可見，樣品色譜圖峰數(shù)5個，各峰由標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，其中葡萄糖（1）和半乳糖（3）分別在14.95 min和17.53 min處被流動相洗脫，目標(biāo)峰位無雜峰干擾；譜圖中樣品A和B的疊加曲線顯示，木糖母液經(jīng)酵母發(fā)酵后葡萄糖被分解去除，而半乳糖未受到影響。

2.2 分離柱的選擇與色譜柱溫的優(yōu)化

實驗比較了不同填料粒徑鉛配位體交換柱對樣品中主要組分分離效果的影響，對比實驗采用了Sepax Carbomix Pb-NP10（300×7.8 mm ID，10 μm，8%交聯(lián)度）色譜柱，全水流動相，流速0.55 mL·min-1，柱溫75℃，示差折光檢測器溫度30℃。結(jié)果表明，樣品在相同的色譜條件下，各組分在小粒徑填料（5 μm）下表現(xiàn)出更高的分離度，同時各組分保留時間稍有延長，其原因在于各組分在分離過程中因填料粒徑變小而增大了保留面積，從而增加了柱效，使得各組分能夠基本實現(xiàn)基線分離。因此實驗采用5 μm鉛（Pb2+）配位體填料色譜柱進行實際樣品分離，以獲得更高的目標(biāo)組分選擇性；由于低交聯(lián)度聚合物填料基質(zhì)剛性較差，色譜柱長時間運行壓力耐受性欠佳。因此，實驗選用填料剛性更強的8%交聯(lián)度樹脂［9］。

圖1 樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample

以聚合物基質(zhì)為主的配位交換色譜柱在分離糖醇化合物時一般需要在高的色譜柱溫度（一般80℃）下運行，由于高溫降低了流動相的黏度，使得填料溶脹好，系統(tǒng)運行壓力小，不易損傷剛性較差的聚合物填料；另外柱溫升高可以有效的改善組分峰型，防止譜峰拖尾或裂峰現(xiàn)象的發(fā)生，但過高的柱溫也可導(dǎo)致色譜柱填料的損害［13］。由于實驗使用了氣浴加熱式柱溫箱，由于氣浴式加熱存在熱量損失，為保證色譜柱內(nèi)溫度穩(wěn)定性，柱溫箱實際設(shè)置溫度較色譜條件溫度提高2℃，設(shè)定為77℃。

2.3 樣品前處理

在木糖生產(chǎn)工藝過程中，木糖液經(jīng)凈化工藝已基本脫除灰分雜質(zhì)和顏色，在即將進行木糖結(jié)晶的前段工藝需要進行單效或多效濃縮，在此工藝中由于高溫產(chǎn)生了少量焦糖色素，在結(jié)晶工藝中這些色素集中進入木糖母液［1］。木糖母液中含有大量因濃縮產(chǎn)生的呈褐色的焦糖色素，這些色素等大分子雜質(zhì)進入色譜柱后會對色譜柱填料造成吸附性損傷，因此實驗采用了固相萃取方法進行樣品去雜質(zhì)處理，在固相萃取裝置的負(fù)壓條件下，樣品溶液中的色素雜質(zhì)在經(jīng)過裝有活性炭的柱管時被活性炭吸附去除，目標(biāo)物糖類化合物不受吸附進入收集管，收集液經(jīng)微米級濾頭過濾進行上機檢測。

木糖母液經(jīng)過加入啤酒酵母發(fā)酵后的料液中含有約0.3%的殘余酵母，由于木糖母液經(jīng)水稀釋后發(fā)酵，所以發(fā)酵液樣品在分析時色素含量很低，可以忽略其干擾，只需去除殘余酵母蛋白即可，實驗采用加入乙腈沉淀酵母蛋白，經(jīng)高速離心后取上清液過濾上機分析。

2.4 回歸方程、線性范圍與檢測限

實驗考察了兩種單糖組分的方法學(xué)指標(biāo)。針對標(biāo)準(zhǔn)品濃度的上下限考察了組分分析的線性范圍，根據(jù)峰面積Y對各單糖濃度X（mg·mL-1）進行線性回歸，得出線性方程和相關(guān)系數(shù)，并依據(jù)三倍噪聲計算檢測限，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程Table 1 Linear regression equations

2.5 方法精密度和回收率

為驗證所建檢測方法的精密度，實驗設(shè)計考察了6個平行樣品的重現(xiàn)性情況，即在單批次木糖母液及其對應(yīng)發(fā)酵液樣品中各自精密量取待檢樣品6份，按照樣品前處理流程分別進行前處理，每類樣品共進樣6次，記錄并計算2種組分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，葡萄糖和半乳糖的精密度（RSD，n=6）分別為：2.13%和2.56%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.6%，方法的穩(wěn)定性較高；實驗采用實際樣品中定量加入混標(biāo)的方式進行方法回收率測試，采用峰面積外標(biāo)法定量測定加入標(biāo)準(zhǔn)品前后的組分含量，依據(jù)含量計算得出葡萄糖平均回收率在98.9%～101.6%之間，半乳糖平均回收率在98.1%～100.9%之間，方法前處理得當(dāng)，重現(xiàn)性好。

2.6 樣品測試結(jié)果

實驗利用峰面積外標(biāo)定量方法對3個不同批次的木糖母液及對應(yīng)發(fā)酵液中葡萄糖和半乳糖2種單糖含量進行了實際檢測，不同批次所得各結(jié)果見表2，由結(jié)果可見采用常規(guī)酵母可穩(wěn)定去除木糖母液中的葡萄糖組分，但半乳糖組分在本實驗中未受到酵母發(fā)酵影響，這與孫廣仁等［8］的研究結(jié)果略有不同，其原因最大可能為酵母類型不同導(dǎo)致利用轉(zhuǎn)化單糖種類不同。

表2 樣品測定結(jié)果Table 2 Test results of samples

3 小結(jié)

利用二價鉛離子型配位體交換單糖分離模式結(jié)合示差折光檢測器檢測，所建立的高效液相色譜方法實現(xiàn)了木糖母液及其發(fā)酵液中葡萄糖和半乳糖的分析和含量的測定。采用更小粒徑填料大大增加了組分分離效能，流動相采用超純水運行，對環(huán)境無危害，所需儀器配置較低，所建方法簡便易操作，重現(xiàn)性好，此法可為木糖母液模擬移動床色譜回收工藝過程的控制及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供準(zhǔn)確的測試數(shù)據(jù)。在方法實際運用中，小批量樣品可采用純水稀釋后濾膜過濾方式直接進樣，大批量樣品測試考慮到樣品中雜質(zhì)對色譜柱的污染，需采用對應(yīng)的樣品前處理方法，此方法儀器配置中示差折光檢測器可采用蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測器代替以提高方法靈敏度。

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Determ ination of M onosaccharides in Xylose M other Liquor and Fermentation Solution by HPLC

Sun Rui，W ang Xuequn，Li Chaoyang，Li Hongfei，Jia Pengyu
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The determination method of glucose and galactose in xylose mother liquor and its yeast fermentation solution was established with HPLC.The method was based on seperation mode called lead ligand exchange.A Sepax Carbomix Pb-NP5（300× 7.8 mm ID，5 μm，8%crosslinkage）column was used for the seperation with ultra-pure water（100%）as mobile phase.The pump rate of mobile phase was 0.55 mL·min-1at a column temperature of 75℃.Temperature of refractive index detector（RID）was 30℃. Xylose mother liquor was pretreated by solid phase extraction（SPE）to remove colourings，fermentation solution was pretreated by acetonitrile to precipitate protein.Baseline separation was achieved within 25 min at final conditions.The calibration curve was linear in the mass concentration range of 0.2～10.0 mg·mL-1，the LOD of glucose and galactose were 0.124 mg·mL-1and 0.115 mg·mL-1respectively.The instrument system was simple，and method was accurate and reproducible.

glucose；galactose；xylose mother liquor；fermentation solution；HPLC

O657.72

A

1002-2090（2016）03-0078-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.016

2015-03-10

黑龍江省教育廳項目（12541591）。

孫蕊（1984-），女，實驗師，齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事儀器分析的研究工作。

賈鵬禹，男，助理研究員，E-mail：jiapengyu@126.com。