徐瑤，李鵬，劉洪亮，穆娟微

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)墾科學院植物保護研究所）

水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性及生物學特性的研究

徐瑤1，李鵬2，劉洪亮2，穆娟微2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)墾科學院植物保護研究所）

為了明確黑龍江省水稻惡苗病菌對咪鮮胺的產(chǎn)生抗性情況，利用菌絲生長速率法檢測了來自黑龍江省8個縣（市）的32個惡苗病菌株對咪鮮胺的敏感性，確定敏感基線值為0.068 9 μg·mL-1，有15.63%供試菌株為低抗菌株，3.12%為中抗菌株，沒有檢測到高抗菌株，表明黑龍江省水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性明顯下降，已經(jīng)產(chǎn)生抗性菌株。比較了抗性菌株JMS-3和敏感菌株NH-1的生物學特性，發(fā)現(xiàn)抗性菌株在生物學特性方面發(fā)生了一定變化，抗性菌株JMS-3菌絲生長速度明顯低于敏感菌株NH-1，敏感菌株NH-1最適pH為7，抗性菌株JMS-3最適pH為6，敏感菌株NH-1最適氮源為硝酸鈉，抗性菌株JMS-3最適氮源為硝酸鉀。

水稻惡苗病菌；咪鮮胺；抗藥性；生物學特性

水稻惡苗病是由串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme Sheld）引起的真菌病害［1］，是嚴重影響黑龍江省水稻生產(chǎn)的主要病害之一，發(fā)病地塊一般減產(chǎn)10%～20%，嚴重的可減產(chǎn)50%以上。近年來，隨著水稻種植面積的不斷擴大、旱育秧技術的推廣及種植戶在藥劑使用技術上存在不足，使得水稻惡苗病的發(fā)生日趨嚴重［2］，有關該病的研究得到人們?nèi)找嬷匾暋?/p>

自20世紀90年代咪鮮胺代替多菌靈防治惡苗病以來，咪鮮胺以防效高、對作物安全等優(yōu)勢倍受農(nóng)民青睞。咪鮮胺浸種防治水稻惡苗病在黑龍江已應用長達20年，連續(xù)使用單一殺菌劑會導致抗藥性的出現(xiàn)［3］，檢測其抗藥性對保護水稻安全生產(chǎn)意義重大。通過測定黑龍江省不同地區(qū)惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性，確立該地區(qū)惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性基線，進而評價該地區(qū)惡苗病菌對咪鮮胺的抗性水平，并探討具有抗藥性菌株的生物學特性的變化，為黑龍江省監(jiān)測惡苗病菌對咪鮮胺的抗藥性奠定基礎，為指導水稻惡苗病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2013年8月在黑龍江省虎林、阿城、訥河、佳木斯、鐵力、富裕、綏化和慶安等8個縣（市）采集87個水稻惡苗病病株標樣，采用組織分離方法進行病原菌的分離，通過單孢分離純化培養(yǎng)獲得62個惡苗病菌菌株，每個縣（市）隨機抽取4個菌株，共計32個供試菌株。

1.2 惡苗病菌對咪鮮胺敏感性測定

通過預備試驗確定出藥劑的5個有效濃度，配制含藥平板。以室內(nèi)生長速率法測定咪鮮胺對水稻惡苗病菌菌株的毒力大?。?-5］。在活化后的惡苗病菌菌落邊緣上打取直徑為5 mm的菌碟，挑取菌碟置于含藥平板培養(yǎng)皿的中央，將其置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后以十字交叉法測菌落直徑，計算不同濃度藥劑對各菌株菌絲生長抑制率。求出藥劑對菌株的毒力公式，即回歸方程y=ax+b及x與y之間的相關系數(shù)r，計算出咪鮮胺對各供試菌株的抑制中濃度（EC50）。根據(jù)病菌對咪鮮胺的敏感性頻率分布建立惡苗病菌對咪鮮胺的敏感基線，確定抗性指數(shù)和抗性菌株頻率?？剐灾笖?shù)=供試菌株EC50/敏感基線EC50?？剐灾笖?shù)（0，30）為敏感菌株，抗性指數(shù)（3，10）為低抗菌株，抗性指數(shù)（10，100）為中抗菌株，抗性指數(shù)（100，∝）為高抗菌株［6-7］。

1.3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

設10、15、20、25、30、35、40℃共7個處理，每處理重復3次。將對咪鮮胺敏感菌株和抗性菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用打孔器取直徑7 mm的菌片，然后將菌片接到PDA平板中央，每皿1片，分別置于不同處理溫度條件下培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑。

1.4 光照對病原菌菌絲生長的影響

設全天24 h黑暗、12 h光照/12h黑暗、全天24 h光照等3個處理，每處理重復3次。將對咪鮮胺敏感菌株和抗性菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用打孔器取直徑7 mm的菌片，然后將菌片接到PDA平板上，每皿1片，接入平板中央位置，分別置于25℃恒溫箱中不同光照條件下培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑。

1.5 pH對病原菌菌絲生長的影響

用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH將PDA培養(yǎng)基調(diào)成pH值為4、5、6、7、8、9、10、11等8個處理。將各處理分別制成平板，每處理3皿，移對咪鮮胺敏感菌株和抗性菌株直徑7 mm菌片于平板中央，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，5 d后測量菌落生長直徑。

1.6 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響

供試碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖。以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以等碳量分別用各供試碳源取代基礎培養(yǎng)基內(nèi)的蔗糖，配置成不同碳源的供試培養(yǎng)基，將不同碳源的培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿中制成平板，在平板中央移入在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)直徑5 mm的菌片，每皿1片，每處理重復3次，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑。

1.7 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響

供試氮源為硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、脯氨酸、甘氨酸。以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以等氮量分別用各供試氮源取代基礎培養(yǎng)基內(nèi)的硝酸鈉，配置成不同氮源的供試培養(yǎng)基，將不同氮源的培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿中制成平板，在平板中央移入在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)直徑5 mm的菌片，每皿1片，每處理重復3次，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對咪鮮胺的敏感性

利用室內(nèi)生長速率法測定了咪鮮胺對32個供試菌株的毒力大小，通過分析得出各個菌株的毒力回歸方程和EC50值，相關系數(shù)均在0.917 7以上。各菌株的EC50值差異較大，最小EC50值為0.001 5 μg·mL-1，最大EC50值為1.306 7 μg·mL-1，相差871倍（表1）。

表1 惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性Table 1 Sensitivity of Fusarium fujikuroi to prochloraz

依據(jù)表1中供試的32個惡苗病菌菌株的EC50值，從0 μg·mL-1開始，以0.05 μg·mL-1為截距，將EC50等分為27個區(qū)間，統(tǒng)計每一個區(qū)間出現(xiàn)供試菌株頻率（表2）。由表2可知，EC50值在0～0.15 μg·mL-1范圍內(nèi)，水稻惡苗病菌對咪鮮胺敏感性的頻率分布呈連續(xù)正態(tài)分布，為敏感菌株群體，其EC50平均值為0.068 9 μg·mL-1，由于無法找到從未用過咪鮮胺的惡苗病菌群體，故實驗就以較為敏感菌株群體的EC50平均值（0.068 9 μg·mL-1）作為敏感基線值。依據(jù)該敏感基線值計算出各供試菌株的抗性指數(shù)并判斷其敏感性，在32個供試菌株中，有26個菌株的抗性指數(shù)（0，3）為敏感菌株，占81.25%；有5個菌株的抗性指數(shù)（3，10）為低抗菌株，占15.63%；有1個菌株抗性指數(shù)（10，1000）為中抗菌株，占3.12%；沒有檢測到高抗菌株。表明黑龍江省水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性明顯下降，已經(jīng)產(chǎn)生抗性菌株，在藥劑防治方面應及時采取新的防控措施。

表2 惡苗病菌對咪鮮胺敏感性的分布情況Table 2 Distribution of sensitive Fusarium fujikuroi to prochloraz

2.2 抗性菌株在生物學特性方面發(fā)生的變化

2.2.1 溫度對病菌菌絲生長的影響

溫度對抗性菌株JMS-3和敏感菌株NH-1生長具有明顯影響，抗性菌株JMS-3和敏感菌株NH-1的菌絲生長溫度范圍和最適溫度是一致的，在10～35℃均能生長，40℃均不能生長，最適溫度均為35℃，但在相同溫度下抗性菌株JMS-3菌絲生長量明顯低于敏感菌株NH-1，在適溫30℃條件下培養(yǎng)5 d后，菌落凈生長直徑分別為49.5和58.9 mm（圖1）。

2.2.2 光照對病菌菌絲生長的影響

實驗結(jié)果表明，病菌在不同光照條件下生長差異不明顯，有無光照情況下均能生長，12 h光照/12 h黑暗條件下生長最好。在同等光照條件下，抗性菌株JMS-3菌落凈生長直徑明顯低于敏感菌株NH-1（表3）。

圖1 溫度對病原菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of temperature to mycelial growth

表3 光照對病原菌菌絲生長的影響Table 3 Effects of light to mycelial growth

2.2.3 pH對病菌菌絲生長的影響

實驗結(jié)果表明，在pH值4～11范圍內(nèi)病菌均能較好地生長，在相同pH值條件下，抗性菌株JMS-3菌絲生長速度明顯低于敏感菌株NH-1?？剐跃闖MS-3在pH 6時菌絲生長最快，培養(yǎng)5 d后，菌落凈生長直徑40.1 mm；而敏感菌株NH-1在pH 7時菌絲生長最快，培養(yǎng)5 d后，菌落凈生長直徑49.7 mm（圖2）。

2.2.4 不同碳源對病菌菌絲生長的影響

從表4可以看出，病菌在淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，蔗糖次之。在相同碳源培養(yǎng)基上，抗性菌株JMS-3菌絲生長量明顯低于敏感菌株NH-1（表4）。

圖2 pH對病原菌菌絲生長的影響Fig.2 Effects of pH on mycelial growth

2.2.5 不同氮源對病菌菌絲生長的影響

實驗結(jié)果表明，抗性菌株JMS-3和敏感菌株NH-1對氮源需求有較大差別，抗性菌株JMS-3菌絲在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)7 d后菌落凈生長直徑為50.8 mm，脯氨酸次之。敏感菌株NH-1菌絲在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)7 d后菌落凈生長直徑為76.8 mm，硝酸鉀次之。在相同氮源培養(yǎng)基上，抗性菌株JMS-3生長速度明顯低于敏感菌株NH-1（表5）。

表4 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響Table 4 Effects of carbon sources to mycelial growth

表5 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響Table 5 Effects of nitrogen sources to mycelial growth

3 結(jié)論與討論

趙志華等［8］研究表明，水稻惡苗病菌對咪鮮胺具有潛在的抗性風險；劉永鋒等［9］研究表明，田間惡苗病菌對咪鮮胺已有一定的抗性；楊紅福等［10］報道由于長期單一使用咪鮮胺浸種防治水稻惡苗病，導致水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗藥性大幅度上升，抗性菌株成為田間優(yōu)勢種群，并導致田間咪鮮胺對水稻惡苗病喪失防效。通過檢測來自黑龍江省8個縣（市）的32個惡苗病菌株對咪鮮胺的敏感性，發(fā)現(xiàn)有81.25%菌株表現(xiàn)敏感，18.75%菌株已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，抗性菌株的產(chǎn)生是咪鮮胺浸種的防治效果降低的主要原因。繼續(xù)使用咪鮮胺浸種防治水稻惡苗病存在很大的風險，建議更換作用機制不同的藥劑推廣使用，以控制惡苗病的發(fā)生與危害。

對抗性菌株JMS-3和敏感菌株NH-1比較研究發(fā)現(xiàn)，抗性菌株生物學特性方面發(fā)生了一定變化。與敏感菌株NH-1相比，抗性菌株JMS-3菌絲生長速度明顯降低，生長條件更喜偏酸（pH值為6），最適氮源為KNO3。綜合分析認為水稻惡苗菌菌絲在10～35℃均能生長，最適生長溫度為30℃；最適菌絲生長的pH呈弱酸性或中性；光暗交替條件有利于菌絲生長；菌絲適于以淀粉、硝態(tài)氮為碳氮源的培養(yǎng)環(huán)境下生長。產(chǎn)祝龍等［11］研究表明，人工誘導抗咪鮮胺突變菌株的菌絲生長速率小于敏感菌株；Tasleen-uz等［12］研究指出抗咪鮮胺菌株的生長速率比敏感菌株要低，這與研究結(jié)果相同。水稻生產(chǎn)上大量施用氮肥、土壤pH適宜，惡苗病發(fā)病率較高，而適當使用有機肥，改善土壤環(huán)境，可減少發(fā)病率，溫度對惡苗病菌絲生長具有明顯影響，避免中午高溫時插秧，以減輕發(fā)病，春季氣溫較高時應加強對惡苗病的防治，避免惡苗病的大發(fā)生。

［1］王拱辰.水稻惡苗病病原菌的研究［J］.植物病理學報，1990，20（2）：93-98.

［2］產(chǎn)祝龍，丁克堅，檀根甲.水稻惡苗病的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2002，30（6）：880-883.

［3］楊謙.植物病原菌抗藥性分子生物學［M］.2版.北京：科學出版社，2011.

［4］張亞玲，王寶玉，臺蓮梅，等.黑龍江省和吉林省稻瘟病菌種群多樣性研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2014，26（1）：1-4.

［5］陳夕軍，盧國新，童蘊慧，等.水稻惡苗病菌對三種浸種劑的抗性及抗藥菌株的競爭力［J］.植物保護學報，2007，34（4）：425-430.

［6］蘭波，李湘民.江西省稻瘟病菌對富士一號的抗藥性研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2007，29（3）：351-355.

［7］袁杰，楊學輝.貴州省稻瘟病菌對三環(huán)唑敏感性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2006，19（2）：219-221.

［8］趙志華，張錫明，范潔茹，等.咪鮮胺對水稻惡苗病菌及其抗藥突變體生長發(fā)育的影響［J］.農(nóng)藥學學報，2007，9（3）：251-256.

［9］高宇.水曲柳主要病蟲害及其防治方法［J］.長春大學學報，2014，24（10）：1384-1388.

［10］楊紅福，吉沐祥，姚克兵，等.水稻惡苗病菌對咪鮮胺產(chǎn)生的抗藥性研究及治理［J］.江西學報，2013，25（6）：94-96.

［11］產(chǎn)祝龍.水稻惡苗病的防治機理及其病原菌抗藥性的研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2003.

［12］Khan T Z，G iliM A，Khan M G.Inheritance studies for bakanae disease of rice［J］.Pakistan Journal of phytopathology，1999，11（2）：181-182.

Research on Sensitivity and Biological Characteristics of Fusarium fujikuroi to Prochloraz

Xu Yao1，Li Peng2，Liu Hongliang2，M u Juanwei2
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Institute of Plant Protection，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences）

In order to clarify Fusarium fujikuroi resistant to prochloraz，the mycelium growth rate method was used to test sensitivity of 32 Fusarium fujikuroi isolates to prochloraz that collected from 8 countries（cities）in Heilongjiang province，and the sensitive baseline value was 0.068 9 μg·mL-1.The low level resistant strains and the medium level resistant strains accounted for 15.63%and 3.12%，respectively，and the high level resistant strains was not detected.The results showed that the sensitivity of Fusarium fujikuroi to prochloraz in Heilongjiang province was significantly lower and resistant strains was produced.Compared the biological characteristics of resistant strains JMS-3 and sensitive strains NH-1，the some changes had taken place in the biological characteristics of resistant strains，and resistant strains JMS-3 mycelium growth rate was significantly lower than sensitive strains NH-1.The optimal pH of sensitive strains NH-1 was 7 and the optimal pH of resistant strains JMS-3 was 6.The optimal nitrogen sources for sensitive strains NH-1 was NaNO3and the optimal nitrogen sources for resistant strains JMS-3 was KNO3.

Fusarium fujikuroi；prochloraz；fungicide resistance；biological characteristics

S482.2+99

A

1002-2090（2016）03-0012-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.003

2015-03-25

黑龍江墾區(qū)一戎水稻科技獎勵基金會支持項目（水稻包衣劑防治惡苗病配套技術研究）；黑龍江墾區(qū)一戎水稻科技獎勵基金會支持項目（水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗藥性風險評價及防治新技術示范）。

徐瑤（1988-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院2012級碩士研究生。

穆娟微，女，研究員，碩士研究生導師，E-mail：mujuanwei@126.com。