于文瑩，姜述君，卜志新，馬婧，楊系玲，范文艷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319）

藜致病真菌的鑒定及其生物學特性研究

于文瑩，姜述君，卜志新，馬婧，楊系玲，范文艷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319）

從野外自然患病的藜植株上分離一高致病菌株（Hf-05），經(jīng)人工接種試驗證實為侵染藜的病原菌。菌株形態(tài)學和ITS序列分析結(jié)果表明，菌株Hf-05為玉蜀黍赤霉菌的變種。生物學特性研究結(jié)果表明，Hf-05的最適C源為麥芽糖，在麥芽糖中最易產(chǎn)孢，最適N源為硝酸鈉；pH為8時生長速度最快，孢子萌發(fā)率最高；25℃是菌絲生長最適宜的溫度；孢子萌發(fā)的最適宜溫度為30℃；黑暗條件更有利于該菌株生長。

藜；致病菌；ITS序列；生物學特性

藜（Chenopodium album L.）為藜科（Chenopodiaceae）藜屬（Chenopodium）植物，又稱為灰菜、灰條菜、落藜，其為一年生草本植物，種子繁殖，全國各地均有分布，是世界惡性雜草，常形成單一種群或與萹蓄、馬唐等混生［1］。藜主要為害麥類、棉花、豆類、薯類、花生、蔬菜、玉米和果樹等，同時也是地老虎、棉鈴蟲和雙斑螢葉甲的寄主［2］，有時也是棉蚜的寄主［3］。藜的生命力極其旺盛，其地下根系對作物生長危害甚大，特別是在作物苗期，若不防治將嚴重影響作物的產(chǎn)量。藜生長常高出作物，影響作物的光合作用，干擾作物生長［4］。目前，對于旱田惡性雜草藜的防除主要采用的是化學防治。化學除草劑得到了推廣和應(yīng)用，雖然顯著的提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，同時也帶來了殘留毒性高、難降解、破壞生態(tài)平衡、抗藥性雜草的出現(xiàn)等一系列問題，而生物防治是上述問題的一個有效途徑［5-6］。

目前，關(guān)于惡性雜草藜的生物防治研究較少，已報道的藜生防菌僅有鏈格孢和殼二孢菌［7-10］。菌株Hf-05是作者所在實驗室獲得了一株對惡性雜草藜具有強致病力的菌株。研究利用ITS序列分析技術(shù)對菌株Hf-05進行了鑒定，并初步研究了菌株生物學特性，為進一步研究應(yīng)用菌株Hf-05防治惡性雜草藜提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗采用從藜植株上分離純化后低溫保存的藜的致病菌株，該菌株保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學植物保護實驗室。實驗中使用的培養(yǎng)基主要有PDA培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基。

1.2 主要實驗儀器及試劑

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、微波爐、電磁爐、培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、冰箱、天平、pH自動檢測儀、血球計數(shù)板、研缽、1.5 mL離心管、2 mL離心管、水浴鍋、冰盒、低溫離心機、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀、PCR管、移液槍等。

待用菌絲、液氮、CTAB提取液、酚：氯仿：異戊醇、醋酸鈉、無水乙醇、異丙醇、TAE、瓊脂糖、EB替代物、ddH2O、R-Taq酶、引物、dNTP、PCR Buffer、Marker、Loading Buffer、膠回收試劑盒。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的形態(tài)學鑒定

將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后在顯微鏡下觀察其菌落、菌絲及孢子的形態(tài)特征，根據(jù)《真菌鑒定手冊》及《中國氣傳真菌彩色圖譜》進行分類鑒定［11-12］。

1.3.2 菌株的分子生物學鑒定

將純化培養(yǎng)好的生防菌株置于鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4天后，在無菌條件下，取下玻璃紙，置于干燥無菌的滅菌箱中，晾干后，放在無菌錫箔紙上，包好做好標記，-20℃冰箱中保存待用，為下一步用菌絲提取DNA做準備，每個菌株三次重復。

快速提取DNA：將菌絲，在-80℃冷凍過夜，然后冷凍干燥出去水分；將干燥后的菌絲用液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)；加入預熱30 min（65℃）的CTAB提取液600 μL，65℃水浴60 min，每隔10 min搖勻一次；向離心管內(nèi)加入500 μL酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）劇烈轉(zhuǎn)抽10 min，4℃12 000 rpm離心10 min；取上清液加入10%醋酸銨和兩倍體積的無水乙醇，混勻后冰浴20 min；4℃12 000 rpm離心20 min；棄上清，70%乙醇洗滌，二次乙醇沉淀，待沉淀風干后，加入50 μL水溶液，用于PCR反應(yīng)。

引物的設(shè)計：通用引物ITS（ITS1正向：5′-CTTG-GTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS4反向：5′-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3′）；

PCR擴增：PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：dNTP混合溶液0.5 μL、10 mmol·L-1上下游引物各0.5 μL、10×PCR buffer2.5 μL、Tap DNA聚合酶0.5 μL、模板DNA1.0 μL、ddH2O 19.5 μL。

PCR程序如下：94℃下預變性5 min；94℃下變性50 S、54℃下退火50 S、72℃下延伸50 S，30個循環(huán)；最后72℃下延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收、純化PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DHSa菌株，篩選陽性克隆，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行序列測定。通過BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/）對測序結(jié)果進行分析，選擇相似性較高的菌株序列與供試的菌株序列，用DNAMAN4.0軟件進行多序列比對，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 菌株對藜的致病力檢測

選取長勢整齊一致的藜植株，每株取大小相差不多的葉片分別置于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿底部先鋪一層無菌濾紙，濾紙用無菌水浸濕，以起到保濕作用。離體的藜葉片用75%的酒精進行表面消毒處理，再用無菌水沖洗干凈，葉片背面向上平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上，每個培養(yǎng)皿中放置6枚葉片。將分離純化后得到的菌種進行活化培養(yǎng)，在生長旺盛的部位取直徑為7 mm的Hf-05菌碟放在離體的藜葉片背面，以未接種處理為對照。48 h后開始觀察記錄葉片是否發(fā)病以及病斑大小等情況。

1.3.4 C、N源對菌株生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖作為培養(yǎng)基C源，硫酸銨、硝酸鈉、尿素、蛋白胨作為N源分別替換原有培養(yǎng)基中的C、N源培養(yǎng)菌株，觀察菌株生長情況，測量菌落大小。

在Czapek培養(yǎng)基中，固定N源（硝酸鈉），分別以不同C源的培養(yǎng)基在25℃條件下培養(yǎng)病原菌株，每種處理4個重復，每隔24 h測量1次菌落直徑，測量采用垂直十字交叉法，并觀察菌株是否產(chǎn)孢；以同樣方法，固定C源（蔗糖），分別以不同N源進行培養(yǎng)，每種處理4個重復，每隔24 h測量1次菌落直徑，觀察菌株是否產(chǎn)孢。

1.3.5 pH值對菌株生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，用pH自動檢測儀測定。共設(shè)置8個酸堿度處理，pH值分別為4、5、6、7、8、9、10和11。接菌處理后置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察菌株生長情況并測量菌落大小，以確定pH值對病原菌株生長的影響。

1.3.6 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

將直徑8 mm的菌碟接種至PDA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)基的pH為6.5。接種后將培養(yǎng)皿分別置于10、15、20、25、30、35℃的環(huán)境中培養(yǎng)，觀察菌株生長情況，每24 h測量菌落大小，每個處理4次重復，以確定菌株生長的最適溫度。

1.3.7 光照對病原菌株生長的影響

將病原菌接種于pH為6.5的PDA平板上，置于25℃光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。光照條件分別設(shè)置為全暗、全光照（20 W日光燈距培養(yǎng)物10 cm）和12 h光照/12 h黑暗。培養(yǎng)5天后觀察菌株生長情況，分別測量菌落大小進行比較，每個處理4次重復。

1.3.8 病原菌株的孢子萌發(fā)

采用孢子懸滴法測定孢子萌發(fā)情況［13］。無菌培養(yǎng)皿中放3張滅菌后濾紙，倒入無菌水，皿內(nèi)放入牛津杯兩個，并將凹玻片架在其上，凹玻片凹形周圍涂無菌凡士林，后用接菌環(huán)蘸取孢子懸浮液于蓋玻片上，翻轉(zhuǎn)扣在凹玻片上，蓋上皿蓋，然后置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照和黑暗交替各12 h，孢子懸浮液pH分別設(shè)置為4、5、6、7、8、9、10、11，在光學顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)過程，并計算孢子萌發(fā)率。溫度試驗與光照試驗中孢子懸浮液的pH均為7。

將操作方法如上的玻片置于光照培養(yǎng)箱中，分別置于15、20、25、30、和35℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)液pH為7.5。48 h后觀察孢子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。試驗重復4次，每次重復觀察不少于200個孢子。

將操作方法如上的玻片置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分設(shè)全暗培養(yǎng)、全光照培養(yǎng)、12 h光照·12 h-1黑暗培養(yǎng)，48 h后觀察孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計分析和處理。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

菌株Hf-05的菌絲呈白色棉絮狀，菌絲有橫隔，分枝。培養(yǎng)基上有淡紫色色素產(chǎn)生（圖1）；分生孢子呈鐮刀形，有隔膜2～7個，分隔明顯，大小為（3～6）μm×（25～72）μm，基部有明顯的足胞（圖2）。Hf-05的形態(tài)特征符合鐮孢菌屬（Fusarum spp.）的形態(tài)特征。

圖1 H f-05菌株菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of colony of strain Hf-05

圖2 H f-05菌株分生孢子形態(tài)Fig.2 Morphology of spore of strain Hf-05

2.2 菌株的分子生物學鑒定

Hf-05菌株P(guān)CR擴增及序列測定后，在NCBI中進行ITS序列比對后，與多個鐮孢菌的序列相似比達99%。由系統(tǒng)發(fā)育樹中也可以看出，Hf-05與Gibberella zeae strain GZ2在同一分支上，進化關(guān)系最為相近（圖3）。由于菌株Hf-05與小麥赤霉病的遺傳距離值大于66，但小于95，因此，確定菌株Hf-05為玉蜀黍赤霉菌的一個變種。

2.3 菌株對藜的致病力檢測

如圖4所示，試驗處理的所有葉片（除對照外）均出現(xiàn)病斑，且病斑上帶有白色霉層，病斑面積占葉片總面積的13.8%。

圖3 菌株H f-05與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Hf-05 and its relatives

圖4 菌株H f-05的致病力檢測Fig.4 Pathogenicity test of strain Hf-05

2.4 碳、氮源對菌株生長的影響

從圖5可以看出，在碳源篩選方面，Hf-05對麥芽糖的利用效果最好，其次是淀粉與蔗糖，葡萄糖的效果最差，但相差并不十分明顯，可見這幾種糖類均可較好的為Hf-05提供碳源；且Hf-05在麥芽糖培養(yǎng)基上最易產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量最大。

從圖6可以看出，在氮源篩選方面，Hf-05對硝酸鈉的利用效果最好，菌落在含硝酸鈉的培養(yǎng)基上生長最快，在硫酸銨的培養(yǎng)基上生長最差。

2.5 pH值對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響

從圖7可以看出，Hf-05在pH值為4～11的培養(yǎng)基上均可生長，適宜生長的酸堿度為pH7～8，最適酸堿度為pH8。試驗結(jié)果表明，Hf-05適宜在中性偏堿性條件下生長，在極酸或極堿條件下菌絲生長都較為緩慢。從圖8可以看出，Hf-05在pH4～11的條件下孢子均可萌發(fā)，最適萌發(fā)酸堿度為pH8時，48 h的孢子萌發(fā)率為94.25%。

圖5 碳源對菌株H f-05生長的影響Fig.5 Effects of C sources on strain Hf-05 growth

圖6 氮源對菌株Hf-05生長的影響Fig.6 Effects of N sources on strain Hf-05 growth

圖7 pH對菌株H f-05生長的影響Fig.7 Effect of pH on the growth of strain Hf-05

圖8 pH對菌株H f-05孢子萌發(fā)的影響Fig.8 Effect of pH on conidia germination of strain Hf-05

2.6 培養(yǎng)溫度對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響

從圖9可以看出，Hf-05適宜生長溫度為20～30℃，最適溫度為25℃，高于35℃菌株不生長，在低溫條件下生長極為緩慢；從圖10可以看出，Hf-05的適宜孢子萌發(fā)溫度為20～30℃，在10℃或35℃時萌發(fā)率極低，最適萌發(fā)溫度為30℃，孢子萌發(fā)率為93.5%。

圖9 溫度對菌株H f-05生長的影響Fig.9 Effect of temperature on the growth of strain Hf-05

圖10 溫度對菌株H f-05孢子萌發(fā)的影響Fig.10 Effect of temperature on conidia germination of strain Hf-05

2.7 光照對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，Hf-05在12 h光照/12 h黑暗與24 h光照菌絲生長速率差異不顯著；24 h黑暗條件下菌絲生長最快，且與其他光照條件差異顯著，表明Hf-05更適合在黑暗條件下培養(yǎng)。不同光照條件對Hf-05的孢子萌發(fā)影響不明顯，3種光照條件下孢子萌發(fā)率都在93%左右，且差異不顯著。

表1 光照對菌株H f-05菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響Table1 Effect of light on hypha growth and conidia germination of strain Hf-05

3 結(jié)論

試驗從野外自然患病的藜植株上分離篩選得到的藜致病菌株Hf-05，基于菌株形態(tài)學特征、ITS序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定，確定菌株Hf-05為玉蜀黍赤霉菌的變種。

菌株生物學特性的研究結(jié)果表明，菌株Hf-05的最適C源為麥芽糖，且在麥芽糖中最易產(chǎn)孢，最適N源為硝酸鈉。菌株在pH8時生長速度最快，孢子萌發(fā)率最高。孢子萌發(fā)的最適宜溫度為30℃，25℃是菌絲生長最適宜的溫度。黑暗條件更有利于菌株Hf-05生長，孢子萌發(fā)對光照條件要求不高。

4 討論

鐮孢菌屬包括很多的種類，并且該屬真菌在形態(tài)、致病力和培養(yǎng)特性等方面存在較大的異質(zhì)性，從而導致該屬真菌的分類鑒定較為困難，因此，利用分子生物學方法對菌株進行鑒定是十分必要的。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）具有極高的保守性，并且種內(nèi)相對一致，而種間差異明顯，這一特征使得ITS非常適合于真菌分子鑒定。一些研究表明，利用ITS鑒定技術(shù)能有效地區(qū)分鐮孢菌屬真菌［14-16］，研究的ITS鑒定結(jié)果表明，菌株Hf-05的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中鐮孢菌屬ITS序列的高同源性達到99%。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果表明，菌株Hf-05與玉蜀黍赤霉菌菌株Gibberella zeae strain GZ2進化關(guān)系最近，但兩個菌株的遺傳距離值介于66～95之間，表明這兩個菌之間存在明顯差異，這一結(jié)果說明，菌株Hf-05與玉蜀黍赤霉菌菌株Gibberella zeae strain GZ2為玉蜀黍赤霉菌的不同變種。由于GenBank中鐮孢菌屬ITS序列有限，因此，研究還無法確定菌株Hf-05屬于玉蜀黍赤霉菌的那一類變種。

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Identification and Biological Characteristics of Pathogenic Fungus in Chenopodium album L.

Yu W enying，Jiang Shujun，Bu Zhixin，M a Jing，Yang Xiling，F(xiàn)an W enyan
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Apathogenic strain Hf-05 was isolated from the diseased goosefoots（Chenopodium album L）plant in the field.Artifical infection proved that the strain was a pathogen to goosefoots.The strain was identified as variety of Gibberella zeae by method of morphology and ITS sequence.The biological characteristics experiment results showed that the optimum carbon source of strain Hf-05 was maltose.It was easily for Hf-05 to produce spores in maltose.The optimum nitrogen source of Hf-05 was sodium nitrate.The strain Hf-05 had a fastest growth rates and highest spore germination rates under pH 8.The most suitable growth temperature of Hf-05 was 25℃.The optimum temperature of spore germination was 30℃.Dark condition was more conducive to the strain Hf-05 growth.

Chenopodium album L.；pathogenic fungus；ITS sequence；biological characteristics

S476

A

1002-2090（2016）03-0006-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.002

2015-03-16

黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項目（HNK125B-08-05A）。

于文瑩（1988-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院2012級碩士研究生。

范文艷，女，教授，博士研究生導師，E-mail：fwyjsj@sohu.com。