陳貫超，廖成水

(1.汝州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南汝州 467500；2.河南科技大學，動物疫病與公共安全重點實驗室/河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南洛陽 471003)

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副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型對小鼠外周血淋巴細胞·細胞因子及免疫球蛋白水平的影響

陳貫超1，廖成水2*

(1.汝州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南汝州 467500；2.河南科技大學，動物疫病與公共安全重點實驗室/河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南洛陽 471003)

摘要[目的]比較副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型菌株感染后小鼠外周血淋巴細胞、血清細胞因子及免疫球蛋白水平的變化情況。[方法]將72只小鼠分為4組，分別腹腔注射副豬嗜血桿菌血清型4、5和12菌株，檢測3 d 、7 d和15 d各組外周血T、B淋巴細胞及血清細胞因子和Ig水平。[結(jié)果]副豬嗜血桿菌感染小鼠3 d，T、B淋巴細胞數(shù)量明顯高于對照組，而隨著感染時間的延長而逐漸下降。IgG、IFN-γ和IL-10水平隨感染時間的延長而逐漸增高，而IgA、IgM和IgE水平逐漸降低。感染3 d，Th1/Th2比值稍有下降，而Th1/Th2比值隨著感染時間的延長而逐漸升高，明顯高于對照組。不同血清型感染在各時間點之間T、B淋巴細胞、IgA、IgM、IgE、IFN-γ、IL-10和Th1/Th2差異均無統(tǒng)計學意義，而血清型4和5感染組小鼠血清IgG均明顯高于血清型12組。[結(jié)論]除IgG以外，副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型4、5和12菌株感染小鼠后外周血淋巴細胞、血清細胞因子及Ig水平無明顯差異。

關(guān)鍵詞副豬嗜血桿菌；血清型；淋巴細胞；細胞因子；免疫球蛋白

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)引起的豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎或敗血癥[1]。該病發(fā)病率一般為30%～40%，死亡率可高達50%以上，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。副豬嗜血桿菌是一種革蘭氏陰性小桿菌，根據(jù)Kieletein-Rapp-Gabriedson瓊脂擴散血清分型方法，將副豬嗜血桿菌至少分為15個血清型[3]，由于副豬嗜血桿菌血清型復(fù)雜，目前仍有20%以上的臨床分離株無法定型。雖然疫苗免疫被認為是防控副豬嗜血桿菌病暴發(fā)與流行的最有效手段，但由于副豬嗜血桿菌血清型眾多，其免疫效果并不理想。因此，弄清不同血清型副豬嗜血桿菌對機體免疫的影響就顯得尤為重要。機體免疫功能的變化預(yù)示著疾病發(fā)展的方向。筆者研究了副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型菌株感染小鼠后的機體相關(guān)免疫指標的變化情況，旨在為進一步研究副豬嗜血桿菌提供參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體重(20±2)g，購自鄭州大學實驗動物研究中心。

1.2菌株副豬嗜血桿菌血清型4、5和12菌株，由河南科技大學微生物基因工程實驗室保存。

1.3試劑與儀器

1.3.1試劑。胰蛋白大豆瓊脂(Trypticsoyagar，TSA)和胰蛋白大豆肉湯(Trypticsoybroth，TSB)，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；新生牛血清，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)，購自瑞士Roche公司；CD3、CD19抗體及IgG、IgA、IgM和IgEELISA檢測試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3.2儀器。試驗儀器有無菌操作臺、超純水儀、微量移液槍、數(shù)碼水熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標儀、流甙細胞儀等。

1.4細菌復(fù)蘇與培養(yǎng)將副豬嗜血桿菌血清型4、5和12菌株劃線于含10%新生牛血清和20μg/mLNAD的TSA平板培養(yǎng)過夜，然后將單菌落接種于含10%新生牛血清和20μg/mLNAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)24h。

1.5動物感染與樣本收集將72只小鼠隨機分成4組：PBS對照組、血清型4組、血清型5組和血清型12組，分別腹腔接種PBS、副豬嗜血桿菌血清型4、5和12。于感染3、7和15d后采用摘眼球法收集各組小鼠血液，將其分成2份：1份樣品進行抗凝處理，用于T、B淋巴細胞檢測分析；另1份收集血清，用于免疫球蛋白檢測。

1.6T淋巴細胞檢測樣品中加入1.5mL紅細胞裂解液，室溫孵育15min后1 500r/min離心5min，PBS重懸。50μL抗凝血與20μLFITC-CD3抗體混勻后，避光孵育15min。棄上清液后，用PBS清洗細胞1次，PBS重懸后上流式細胞儀分析。

1.7B淋巴細胞檢測 使用全自動細胞計數(shù)儀檢測全血總淋巴細胞數(shù)，同時使用流式細胞儀檢測B淋巴細胞，在100μL抗凝血中分別加入20μLFITC-CD19、PE-CD3及同型陰性對照，避光孵育30min，加入紅細胞裂解液，室溫孵育10min，1 000r/min離心5min棄去上清，PBS重懸后上流式細胞儀分析。

1.8免疫球蛋白檢測按照ELISA試劑盒說明書檢測各組IgG、IgA、IgM和IgE水平。

1.9Th1/Th2比值檢測按照ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清IFN-γ和IL-10含量，以IFN-γ代表Th1，以IL-10代表Th2，計算Th1/Th2比值。

2結(jié)果與分析

2.1副豬嗜血桿菌感染不同時間點小鼠T、B淋巴細胞檢測 由表1可知，感染3d各感染組T、B淋巴細胞數(shù)量明顯高于對照組(P<0.01)；感染7d，各感染組T、B淋巴細胞數(shù)量有所下降，但均高于對照組(P<0.05)。感染15d，各感染組T、B淋巴細胞數(shù)量極顯著低于對照組(P<0.01)。不同血清型感染在不同時間點之間差異均無統(tǒng)計學意義。

表1　副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型菌株感染不同時間點小鼠T、B淋巴細胞的比較

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。

Note：*standsforsignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.05)，**standsforextremelysignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.01).

2.2副豬嗜血桿菌感染不同時間點小鼠免疫球蛋白檢測 由表2可知，各個時間點各感染組血清IgG與對照組相比均顯著增高(P<0.01)，且隨著感染時間的延長，感染組IgG水平逐漸增高。感染組IgA、IgM和IgE水平與對照組相比具有一致性的變化趨勢，即感染3d各感染組IgA、IgM和IgE水平明顯高于對照組(P<0.01)，但其隨著感染時間的延長呈逐漸下降趨勢(P<0.01或P<0.05)，其中15d各感染組IgM和IgE水平降至正常水平(P<0.05)。各時間點血清型4和5感染組小鼠血清IgG均明顯高于血清型12組(P<0.01)。

表2　副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型菌株感染不同時間點小鼠免疫球蛋白含量的比較

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)；#表示與血清型12組差異顯著(P<0.05)，##表示與血清型12組差異極顯著(P<0.01)。

Note：*standsforsignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.05)，**standsforextremelysignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.01)；#standsforsignificantdifferencecomparedwithtype12group(P<0.05)，##standsforextremelysignificantdifferencecomparedwithtype12group(P<0.01).

2.3副豬嗜血桿菌感染不同時間點小鼠Th1/Th2比值檢測由表3可知，各組不同時間點IFN-γ和IL-10水平與對照組相比均明顯升高(P<0.01)。感染3d各感染組Th1/Th2比值稍有下降，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，而隨著感染時間的延長，各感染組Th1/Th2比值逐漸升高，7d和15d各感染組Th1/Th2比值均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。不同血清型感染在不同時間點之間IFN-γ和IL-10水平及Th1/Th2比值差異均無統(tǒng)計學意義。

表3　副豬嗜血桿菌國內(nèi)流行血清型菌株感染不同時間點小鼠Th1/Th2比值的比較

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。

Note：*standsforsignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.05)，**standsforextremelysignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P<0.01).

3討論與結(jié)論

淋巴細胞是機體主要免疫細胞，其數(shù)量變化可以反映機體的細胞免疫水平。CD3和CD19分別是T、B淋巴細胞表面的特異抗原，可以反映總T、B淋巴細胞的量[4]。該研究結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌感染小鼠3dT、B淋巴細胞數(shù)量明顯增高，且隨著感染時間的延長呈逐漸下降的趨勢，但不同血清型感染各時間點之間均無明顯差異。Ig是指B淋巴細胞或記憶細胞在外源物質(zhì)刺激下增殖分化成的漿細胞所產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，主要分布在血清、組織液及外分泌液中。健康人血清中的Ig含量是恒定的，Ig在機體防御中發(fā)揮著重要作用。病原微生物感染機體后產(chǎn)生大量的Ig，以抵抗感染。該研究結(jié)果表明副豬嗜血桿菌感染小鼠后IgG水平隨感染時間的延長而逐漸增高，而感染組IgA、IgM和IgE水平呈逐漸降低的趨勢。但是，各時間點血清型4和5感染組小鼠血清IgG水平均明顯高于血清型12組。這可能是因為副豬嗜血桿菌血清型12具有不同于血清型4和5的一些功能蛋白，所激發(fā)機體分泌產(chǎn)生抗體的水平不一致。

細胞因子是指一類由T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞和內(nèi)皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等某些非免疫細胞經(jīng)外源物質(zhì)刺激后合成、分泌的蛋白質(zhì)或小分子多肽，這類小分子物質(zhì)具有廣泛生物學活性[5]。作為免疫系統(tǒng)中細胞間相互作用的信號分子，與細胞膜上受體結(jié)合后發(fā)揮多種生物效應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起重要作用。根據(jù)在感染和炎癥反應(yīng)中的功能作用，又可將其分為促炎性細胞因子(IL-1、IL-8、TNF-α和IFN-γ等)和抑炎性細胞因子(IL-1rα、IL-4和IL-10等)2大類。該研究結(jié)果表明副豬嗜血桿菌感染小鼠血清IFN-γ和IL-10水平明顯升高，但不同血清型之間差異無明顯變化。正常情況下，機體Th1和Th2細胞功能均處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能。該研究結(jié)果表明感染3dTh1/Th2比值稍有下降，而Th1/Th2比值隨著感染時間的延長而逐漸升高，在7d和15d各感染組Th1/Th2比值均明顯高于對照組，但不同血清型之間差異無明顯變化。

參考文獻

[1]MACEDON，ROVIRAA，TORREMORELLM.Haemophilus parasuis：Infection，immunityandenrofloxacin[J].VetRes，2015，46：128.

[2]KUEHNJS，REGISTERKB，PHILLIPSGJ.Draftgenomesequencesfor10isolatesoftheswinepathogenHaemophilus parasuis[J].Genomeannounc，2013，1(5)：739-752.

[3]KIELSTEINP，RAPP-GABRIELSONVJ.Designationof15serovarsofHaemophilus parasuisonthebasisofimmunodiffusionusingheat-stableantigenextracts[J].JClinMicrobiol，1992，30(4)：826-865.

[4] 張有聰，劉淑英.T淋巴細胞和B淋巴細胞的研究進展[J].畜牧與飼料科學(奶牛版)，2006，1(6)：75-78.

[5] 高玲美，牛鐘相，丁淑燕.動物細胞因子研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2003，24(4)：46-48.

基金項目國家自然科學基金面上項目(31572489)；河南科技大學青年科學基金項目(2015QN033)。

作者簡介陳貫超(1986- )，男，河南寶豐人，碩士研究生，研究方向：畜禽疫病防控。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事微生物感染與先天性免疫細胞作用研究。

收稿日期2016-05-08

中圖分類號S 855.1+2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-164-03

LevelofPeripheralBloodLymphocytes,CytokinesandImmunoglobulinsinMiceInfectedwiththeEpidemicSerotypesHaemophilus parasuisinChina

CHENGuan-chao1,LIAOCheng-shui2*

(1.RuzhouAnimalHealthInspectionInstitute,Ruzhou,Henan467500; 2.AnimalDiseaseandPublicSecurityAcademicianWorkstationofHenanProvince/TheKeyLabofAnimalDiseaseandPublicHealth,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003)

Abstract[Objective] To comparatively study on level of peripheral blood lymphocytes, cytokines, and immunoglobulins (Ig) in mice infected with the epidemic serotypes Haemophilus parasuis in China. [Method] 72 mice were subdivided into four groups, group serotypes 4, 5, 12, and PBS (control group), and were injected intraperitoneally with Haemophilus parasuis serotypes 4, 5, 12, and PBS. T lymphocytes and B lymphocytes, cytokines, and Ig were detected. [Result] The number of T lymphocytes and B lymphocytes in mice on 3 days after infection with Haemophilus parasuis, and gradually decreased as increasing time. But gradually increased in the level of IgG, IFN-γ, and IL-10, and gradually decreased in the level of IgA, IgM, and IgE. The Th1/Th2 level was gradually increased as increasing time, and significantly higher than the control group. However, there were no significant differences between different serotypes Haemophilus parasuis in the level of T lymphocytes and B lymphocytes, IgA, IgM, IgE, IFN-γ, IL-10, and Th1/Th2, but the level of IgG in group serotypes 4 and 5 were significantly higher than group serotypes 12. [Conclusion] There were no significant differences in the level of peripheral blood lymphocytes, cytokines, and Ig except IgG in mice infected with Haemophilus parasuis serotypes 4, 5, 12 in China.

Key wordsHaemophilus parasuis; Serotypes; Lymphocytes; Cytokines; Immunoglobulins