劉宏雷　易力　翟曉莉

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·論著·

腦星形細(xì)胞瘤中HPA的表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞侵襲力的影響

劉宏雷易力翟曉莉

050011河北省石家莊市第三醫(yī)院神經(jīng)外科(劉宏雷),病理科(翟曉莉)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科(易力)

【摘要】目的觀察乙酰肝素酶(HPA)在人腦星形細(xì)胞瘤組織的表達(dá)及對腫瘤細(xì)胞侵襲力的影響。方法采用免疫組化ElivisionTMplus兩步法和Real time-PCR法檢測75例星形細(xì)胞瘤組織和40例正常腦組織中HPA蛋白和mRNA表達(dá)情況。通過siRNA干擾技術(shù)沉默星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中HPA表達(dá)，采用Real time PCR、Western blot、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞HPA、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)及細(xì)胞侵襲力變化。結(jié)果正常腦組織未見HPA蛋白表達(dá)，星形細(xì)胞瘤組織中HPA陽性表達(dá)率為78.67%(59/75)，星形細(xì)胞瘤組織HPA陽性表達(dá)率顯著高于正常腦組織，且其mRNA表達(dá)水平也顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。星形細(xì)胞瘤Ⅱ～Ⅳ級組，HPA陽性表達(dá)率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且有轉(zhuǎn)移組HPA陽性表達(dá)率顯著高于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。siRNA能夠有效抑制星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中HPA表達(dá)，并下調(diào)VEGF、MMP-9表達(dá)，同時(shí)穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HPA在星形細(xì)胞瘤組織異常高表達(dá)，隨著腫瘤惡性程度增高而逐漸升高。siRNA沉默HPA后細(xì)胞侵襲力顯著降低，HPA有可能成為治療星形細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】星形細(xì)胞瘤；乙酰肝素酶；侵襲

腦星形細(xì)胞瘤是最常見的成人原發(fā)腦腫瘤，其發(fā)生率逐年遞增，約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%[1]。盡管神經(jīng)影像學(xué)的快速發(fā)展極大幫助了星形細(xì)胞瘤的診斷和治療，對星形細(xì)胞瘤的治療技術(shù)也取得了較大的進(jìn)步，但其臨床效果并不理想，主要原因?yàn)樾切渭?xì)胞瘤大多呈侵襲性生長，手術(shù)難以切底根治[2]。乙酰肝素酶(Heparanase，HPA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，其能夠破壞由細(xì)胞外基質(zhì)與血管基底膜組成的天然屏障結(jié)構(gòu)，在腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí)，HPA在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)[3]。本研究檢測了HPA在不同病理分級星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)，并通過siRNA干擾技術(shù)沉默星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中HPA表達(dá)，觀察其對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)和細(xì)胞侵襲力的影響。

1資料與方法

1.1一般資料腫瘤組織標(biāo)本來自于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和石家莊市第三醫(yī)院。自2004年1月至2014年12月共收集到資料完整的75例原發(fā)性星形細(xì)胞瘤患者。所有病例保存的石蠟組織切片均由兩位高年資病理醫(yī)師按2010年WHO《神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤》進(jìn)行診斷復(fù)核。所選取的75例標(biāo)本中，男45例，女30例；年齡12～78歲，平均年齡(59±25)歲；病理分級：Ⅱ級25例，Ⅲ級29例，Ⅳ級21例。浸潤深度：累及漿膜者44例，未累及漿膜者31例。另隨機(jī)選取顱腦損傷后行顱內(nèi)減壓患者的正常腦組織40例作為對照，其中男28例，女12例；年齡21～65歲，平均年齡(41±12)歲。

1.2實(shí)驗(yàn)方法及試劑

1.2.1免疫組織化學(xué):每例石蠟組織均取切片3張，應(yīng)用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus兩步法染色，用已知陽性切片作對照，用PBS液染色作為陰性對照。所用一抗為小鼠抗人HPA單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，ElivisionTMPlus免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。 結(jié)果判定：HPA陽性部位在胞核和胞漿，呈棕黃色顆粒，不出現(xiàn)為陰性。高倍鏡下，在每一張切片的角及中央各取5個高倍視野，計(jì)算100個癌細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的比例，取平均值。然后，按染色強(qiáng)度計(jì)分：0～3分分別為無色、淡黃色、黃色、棕黃色；按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分為陰性，1分、2分、3分和4分分別為陽性細(xì)胞占<11%、11%～50%、51%～75%和>75%，計(jì)算方法為：染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞所占百分比；其中：>3分為(+)，6～9分為(++)，10～12分為(+++)，凡(+)或(+)以上者為陽性表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染:在37℃ 5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)U87細(xì)胞，將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，待細(xì)胞融合至30%～50%，將細(xì)胞分3組：①空白對照組；②陰性對照組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒；③轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染HPA-siRNA。

1.2.3Real time-PCR:Trizol提取組織或細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1　Real time PCR引物序列

1.2.4Western-blot:收集、裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的比值。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn):用預(yù)冷無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml，Transwell小室上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10% BSA的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育18 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醛室溫固定15 min。用棉簽輕拭上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。將微孔膜置于載玻片上，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，取均值。

2結(jié)果

2.1腦星形細(xì)胞瘤及正常腦組織中HPA的表達(dá)情況

2.2.1免疫組化結(jié)果顯示：HPA陽性染色部位定位于胞核和胞漿，呈棕黃色顆粒，在75例星形細(xì)胞瘤組織和40例正常腦組織中HPA蛋白陽性表達(dá)率分別為78.67%(59/75)、0(0/40)，HPA蛋白在星形細(xì)胞瘤組織的陽性表達(dá)率顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　2組HPA蛋白陽性表達(dá)率比較　例(%)

注：與正常腦組織比較,*P<0.05

2.2.2Real time-PCR結(jié)果顯示HPA mRNA在星形細(xì)胞瘤組織和正常腦組織的表達(dá)水平分別為1.92±0.31、0.00±0.00，HPA mRNA在星形細(xì)胞瘤組織的表達(dá)水平顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3　HPA在不同病理分級星形細(xì)胞瘤組織的表達(dá)情況　±s

注：與正常腦組織比較,*P<0.05

2.2HPA與腦星形細(xì)胞瘤組織病理分級的關(guān)系HPA在不同病理分級星形細(xì)胞瘤組織的陽性表達(dá)率分別為60.00%(15/25)、79.31%(23/29)、90.48%(19/21)，HPA在Ⅳ級星形細(xì)胞瘤組織的陽性表達(dá)率顯著高于Ⅲ級星形細(xì)胞瘤組織，而后者顯著高于Ⅱ級星形細(xì)胞瘤組織，提示HPA的陽性表達(dá)率隨著星形細(xì)胞瘤分化程度降低呈現(xiàn)線性升高趨勢。見表4。

表4　HPA在無轉(zhuǎn)移和有轉(zhuǎn)移星形細(xì)胞瘤組織的表達(dá)情況　例

注：與Ⅱ級比較，*P<0.05

2.3HPA與轉(zhuǎn)移的關(guān)系HPA在無轉(zhuǎn)移和有轉(zhuǎn)移的星形細(xì)胞瘤組織的陽性表達(dá)率分別為61.29%(19/31)、95.45%(42/44)，HPA在有轉(zhuǎn)移的腦星形細(xì)胞瘤組織的陽性表達(dá)率顯著高于無轉(zhuǎn)移的腦星形細(xì)胞瘤組織，提示HPA的陽性表達(dá)率與腦星形細(xì)胞瘤是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表5。

表5　HPA與轉(zhuǎn)移的關(guān)系　例

注：與無轉(zhuǎn)移比較，*P<0.05

2.4HPA siRNA對U87細(xì)胞中HPA mRNA和蛋白表達(dá)的影響Real time-PCR和Western-blot結(jié)果顯示：HPA siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，U87細(xì)胞中HPA mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，與空白對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明HPA siRNA可以有效沉默HPA表達(dá)。見表6。

組別HPAmRNA表達(dá)水平HPA蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染組0.18±0.030.14±0.02陰性對照組0.67±0.11*0.60±0.10*空白對照組0.65±0.10*0.55±0.09*

注：與轉(zhuǎn)染組比較,*P<0.05

2.5HPA siRNA對U87細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響Real time-PCR和Western-blot結(jié)果顯示：HPA siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，U87細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，與空白對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明HPA siRNA可以顯著抑制VEGF表達(dá)。見表7。

組別VEGFmRNA表達(dá)水平VEGF蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染組0.21±0.030.17±0.02陰性對照組0.89±0.14*0.79±0.12*空白對照組0.90±0.15*0.77±0.11*

注：與轉(zhuǎn)染組比較,*P<0.05

2.6HPA siRNA對U87細(xì)胞中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Real time PCR和Western-blot結(jié)果顯示：HPA siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，U87細(xì)胞中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，與空白對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明HPA siRNA可以顯著抑制MMP-9表達(dá)。見表8。

組別MMP-9mRNA表達(dá)水平MMP-9蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染組0.15±0.020.11±0.02陰性對照組0.76±0.12*0.68±0.11*空白對照組0.74±0.11*0.64±0.10*

注：與轉(zhuǎn)染組比較,*P<0.05

2.7HPA siRNA對U87細(xì)胞侵襲力的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HPA siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、空白對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(21±3)、(51±7)、(53±9)個，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對照組、空白對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明HPA siRNA可以顯著降低U87細(xì)胞侵襲力。

3討論

星形細(xì)胞瘤起源于胚胎外胚層，是最常見的腦組織腫瘤，其發(fā)生率逐年遞增，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，星形細(xì)胞瘤約占原發(fā)性惡性腦瘤的70%[1]，居顱腦腫瘤的第一位，是嚴(yán)重危害人類生命健康的一類疾病，且其預(yù)后常常欠佳[4]。星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)特征具有特殊性，表現(xiàn)為無論其分化程度高低，均呈現(xiàn)浸潤性生長。雖然神經(jīng)影像學(xué)的快速發(fā)展，極大幫助了星形細(xì)胞瘤的診斷和治療；醫(yī)學(xué)治療手段的不斷進(jìn)步和多樣化，提高了星形細(xì)胞瘤患者的生存率，但星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍不理想。

星形細(xì)胞瘤患者病死率高的主要原因是腫瘤的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤的侵襲性生長必須降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的各種成分和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，然后才能穿過由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血管基底膜(BM)組成的屏障。HPA是近年發(fā)現(xiàn)的一種ECM降解酶，從人的胎盤組織及血小板克隆得到。Hulett等[5]研究認(rèn)為HPA是一種細(xì)胞膜蛋白，可以降解BM和ECM中的HSPG，對HSPG的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)；而且在多種轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞系中HPA都出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，并且在轉(zhuǎn)染了HPA cDNA的細(xì)胞系中也表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)移特性。目前研究發(fā)現(xiàn)HPA在乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等多種原發(fā)性腫瘤組織中異常高表達(dá)，在惡性腫瘤持續(xù)病理學(xué)狀態(tài)中起重要作用[6-14]，且其表達(dá)增加與腫瘤患者術(shù)后生存期縮短、轉(zhuǎn)移和微血管密度增加相關(guān)[3]。

本研究收集的75例星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中有59例HPA表達(dá)陽性，陽性率為78.67%，而在正常腦組織中卻未發(fā)現(xiàn)其陽性表達(dá)，而且隨著星形細(xì)胞瘤病理級別的升高其表達(dá)隨之升高，說明HPA參與了星形細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展。此外，本研究利用siRNA干擾技術(shù)成功造成HPA基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞侵襲力顯著降低，同時(shí)VEGF、MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)HPA高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)水平可作為評判腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)。

綜上所述，HPA高表達(dá)在星形細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。通過基因靶向治療下調(diào)HPA表達(dá)有可能實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的目的。HPA可作為判斷星形細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的標(biāo)志物和治療該腫瘤的潛在靶點(diǎn)[15-18]。

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doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.013

【中圖分類號】R 730.264.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)14-2130-04

(收稿日期：2016-01-11)

Expression of HPA in human astrocytoma and its effects on invasiveness of tumor cells

LIUHonglei*,YILi,ZHAIXiaoli.*

DepartmentofNeurosurgery,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of heparanase (HPA) in human astrocytoma and its effects on invasiveness of tumor cells.MethodsThe expression levels of HPA were detected by immunohistochemical assay and Real time-PCR in 75 cases of human astrocytoma tissues and 40 cases of normal brain tissues. The small interfering RNA (siRNA) knockdown technique was used to silence the expressions of PHA protein and mRNA in astrocytoma U87 cells.The expression levels of HPA,vascular endothelium growth factor (VEGF), matrix metalloproteinases-9 (MMP) as well as the changes of invasiveness of tumor cells were detected by Real time-PCR, Western Blot and Transwell assay.ResultsThe expressions of PHA were not observed in normal brain tissues. The positive expression rate of HPA protein was 78.67% (59/75) in astrocytoma tissues, which was significantly higher than that [0(0/40)] in normal brain tissues (P<0.05),moreover, the positive expression rate of HPA mRNA was significantly higher than that in normal brain tissues (P<0.05). The positive expression rate of HPA at gradeⅡ～Ⅳof astrocytoma was gradually increased,and the positive rate was 60.00% (15/25), 79.31% (23/29), 90.48% (19/21),respectively,and there was a significant difference among them (P<0.05).Furthermore the positive expression rate of HPA in tumor metastasis group was significantly higher than that in non-metastasis group (P<0.05).The siRNA could effectively inhibit the expressions of HPA in U87 cells and could down-regulate the expressions of VEGF,MMP-9,at the same time, which could obviously decrease the cell counts of permeating cell membrane (P<0.05).ConclusionThe high-expressions of HPA exist in astrocytoma tissues,moreover,which are gradually increased with the malignant degree of tumor.The invasiveness of tumor cells is obviously decreased afterHPA is silenced by siRNA,thus,PHA may become a potential target point in treatment of astrocytoma.

【Key words】astrocytoma; heparanase;invasion