徐太哲，李　麗，王長(zhǎng)山

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

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小鼠胚胎胸腺移植方法和實(shí)驗(yàn)研究①

徐太哲1，李麗2，王長(zhǎng)山2

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討T細(xì)胞剔除的同種胎胸腺在老齡小鼠腎被膜下血運(yùn)重建、免疫功能和外周血T細(xì)胞池重建恢復(fù)。方法:對(duì)10只胸腺老化萎縮的BALB/c老齡(16月齡)小鼠施行胚胎胸腺移植,供體為BALB/c小鼠妊娠14d(E14d)的胎鼠,將胎鼠胸腺小葉移植于受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠腎被膜下,無菌縫合結(jié)扎逐層結(jié)扎封閉腹腔。術(shù)后連續(xù)5d給予環(huán)孢素A 10mg/kg 體重靜脈注射。結(jié)果:受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只全部存活,無排斥反應(yīng),移植后移植胸腺恢復(fù)血運(yùn)，重建免疫、恢復(fù)免疫功能。結(jié)論:老齡小鼠胸腺組織在腎被膜下移植3周后血運(yùn)重建良好，術(shù)后6周恢復(fù)發(fā)揮對(duì)新生T淋巴細(xì)胞選擇發(fā)育功能。

關(guān)鍵詞：胚胎胸腺;胸腺移植;胸腺萎縮

胸腺移植不僅能誘導(dǎo)移植免疫耐受,還可以使動(dòng)物機(jī)體獲得免疫重建。胸腺移植已越來越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者用于治療多種疾病。本研究旨在建立一種小鼠胚胎胸腺移植動(dòng)物模型,觀測(cè)胚胎胸腺移植的受體小鼠外周血T細(xì)胞池獲得重建和恢復(fù)情況，更好為開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床胸腺移植奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組：供體BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠10只,不限雄雌，單次鈷(60Co )全身均勻5Gy強(qiáng)度輻射(劑量率為:0.8Gy/min)，去除供體胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞。受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只，體重24～27g。對(duì)照動(dòng)物組：BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只，體重24～27g。

1.2方法

①麻醉方法:1%戊巴比妥鈉60mg/kg體重腹腔內(nèi)注射。②建立胸腺移植模型：供體BALB/c手術(shù):將供體BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠胎盤分離出，無菌取胎鼠，斷頭，體視鏡下摘取胎鼠胸腺小葉于培養(yǎng)液中，待用。③受體BALB/c手術(shù)：BALB/c老齡(16月齡)小鼠無菌麻醉、消毒后，取腰背左側(cè)中縱行切口，顯露左側(cè)腎臟，腎被膜處制孔，在體視鏡下將胸腺小葉植入16月老齡小鼠腎被膜下。無菌縫合結(jié)扎逐層結(jié)扎封閉腹腔。術(shù)后連續(xù)5d給予環(huán)孢素A 10mg/kg 體重靜脈注射，安置在SPF級(jí)飼養(yǎng)室內(nèi)，分籠單獨(dú)飼養(yǎng)4～6周后取移植胸腺標(biāo)本,在光鏡下觀察胸腺組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只全部存活,供體胎鼠胎胸腺移植于左側(cè)腎臟腎被膜下，術(shù)后4周，打開腹腔，光鏡下觀察移植胸腺無明顯縮小，胸腺組織結(jié)構(gòu)基本正常,未見明顯排斥現(xiàn)象。術(shù)后5周，觀察移植胸腺組織在腎臟被膜下繼續(xù)發(fā)育，呈半球形，顏色瓷白，表面可見數(shù)條細(xì)小的血管。

圖1　左圖為供體BALB/c小鼠妊娠14d的胎鼠，右圖為妊娠14d胎鼠的胸腺。

圖2移植5周后胎鼠胸腺組織的在腎臟被膜下生長(zhǎng)情況。綠色箭頭所指為生長(zhǎng)狀態(tài)下移植的胸腺組織，圖左側(cè)是未移植胸腺的腎臟，圖右側(cè)是移植胸腺5周后的腎臟。

移植的老齡小鼠T淋巴細(xì)胞的恢復(fù)效果，流式細(xì)胞分析老齡移植小鼠相比同齡對(duì)照，CD4+細(xì)胞百分含量分別為：14.07±4.13，10.95±6.63，差異不顯著；CD8+細(xì)胞百分含量分別為：25.12±13.53，12.96±11.64，差異顯著；CD4+/ CD8+比值分別為：0.59±0.56，0.82±0.27，差異不顯著。

表1　老齡移植小鼠與對(duì)照的脾臟CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞的百分含量和CD4+/CD8+

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

3討論

胸腺移植的方法有很多，胸腺細(xì)胞及胸腺移植被國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者建模和應(yīng)用治療多種疾病：Hong[1]和Dupuy[2]等人通過移植胸腺細(xì)胞，恢復(fù)淋巴細(xì)胞功能，治療免疫缺陷?。煌ㄟ^移植胸腺上皮細(xì)胞，改善免疫功能低下的人體。Danner[3]等人通過胸腺組織塊移植治療愛滋病患者，Ortak[4]等人通過將帶血管的胸腺移植來重建移植胸腺的血液供應(yīng)，目前國(guó)內(nèi)已建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，Lambrigts[5]等人的胸腺與其他臟器聯(lián)合移植。在國(guó)內(nèi)，徐春岳等[6]將大鼠胚胎胸腺與后腎原基聯(lián)合移植至無胸腺裸小鼠,探討了聯(lián)合移植能否重建受體細(xì)胞免疫功能。付繼成等[7，8]將正常胚胎小鼠胸腺移植于2月齡的雄性 BXSB小鼠體內(nèi)治療紅斑狼瘡和改善BXSB雄性小鼠腎功能。徐高四等[9]也探討了胚胎胸腺組織移植對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)模型鼠的治療效果。胡正等[10]將凍融處理或新鮮的人胚胎胸腺移植入小鼠腎被膜下1～3mm處，良好地支持人胸腺發(fā)育。在國(guó)外，Zhu X等[11]利用胚胎胸腺移植，恢復(fù)血運(yùn)，免疫重建、恢復(fù)功能。

目前國(guó)內(nèi)尚未見小鼠胚胎胸腺移植動(dòng)物模型建立的報(bào)道。與國(guó)外動(dòng)物模型相比,我們采用的移植物為胎胸腺小葉,可充分發(fā)揮胎胸腺功能、利于最大限度地發(fā)揮移植胎胸腺的功能。我們胸腺移植受體部位是腎被膜下，該部位局部血液供給較豐富，手術(shù)簡(jiǎn)單，便于手術(shù)觀察移植物的變化等優(yōu)點(diǎn)，朱世濱等[12]也觀察了腎包膜下胰島移植對(duì)移植物存活情況。我們?cè)谶M(jìn)行手術(shù)時(shí)，采用妊娠14d(E14d)胎鼠胸腺，胚胎胸腺組織對(duì)于受體而言，抗原性低，而適合用來移植，移植后容易形成免疫耐受，有利于在同種異體或異種受者中存活，楊崇賢等[13]曾用胚胸腺組織漿液注射治療慢性病毒性肝炎。胎鼠胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞鈷剔除技術(shù),張濤等[14]曾探討過(60)Co照射小鼠免疫功能的影響，這樣大大縮短了移植胸腺恢復(fù)血運(yùn)時(shí)間,對(duì)老齡小鼠恢復(fù)免疫起重要作用,建立了較為成功的胎胸腺移植動(dòng)物模型。

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基金項(xiàng)目：①1.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃，編號(hào)：NO.1253G057;2.佳木斯大學(xué)自然科學(xué)基礎(chǔ)研究類重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：Sjz2012-11。

作者簡(jiǎn)介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治醫(yī)師。 通訊作者：王長(zhǎng)山(1977～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，主要從事胸腺微環(huán)境。E-mail：wcs0451@163.com。

中圖分類號(hào)：R655.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1008-0104(2016)03-0110-02

(收稿日期：2016-02-29)