付德來(lái)，種　鐵，李和程，張 鵬，劉洪濤，王子明

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1.泌尿外科，2.麻醉科，陜西西安　710004)

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·基礎(chǔ)研究·

Shotgun技術(shù)篩選尿液中腎癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物

付德來(lái)1，種鐵1，李和程1，張 鵬1，劉洪濤2，王子明1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1.泌尿外科，2.麻醉科，陜西西安710004)

摘要：目的尋找尿液中潛在的腎癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物。方法收集腎癌患者根治性腎切除術(shù)前、術(shù)后、非腎癌對(duì)照者晨起第二次中段尿液標(biāo)本，提取尿蛋白并經(jīng)SDS-PAGE初步分離，尿蛋白酶解后通過高效液相色譜聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果整合后經(jīng)Bioworks Browser 3.1軟件搜索SWISS-PROT和/或TREMBL人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定差異蛋白。結(jié)果腎癌患者術(shù)前組、術(shù)后組、對(duì)照組分別收集獲得滿足條件的尿液標(biāo)本32、32、34份，各組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL，各組分別鑒定獲得獨(dú)特肽段727、679、753個(gè)，獨(dú)特肽段數(shù)≥1的蛋白群分別有278、237、259個(gè)，獨(dú)特肽段數(shù)≥2的蛋白群分別有83、92、106個(gè)。其中有5個(gè)獨(dú)特肽段數(shù)≥2的蛋白群在腎癌術(shù)前組特異表達(dá)，這5個(gè)蛋白中4個(gè)為免疫球蛋白類，1個(gè)為L(zhǎng)ipocalin-2(LCN2)。結(jié)論LCN2在腎癌患者術(shù)前尿液中高可信表達(dá)，LCN2在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為尿液中腎癌標(biāo)志物的意義值得進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：腎癌；標(biāo)志物；尿液；蛋白組學(xué)

腎癌又稱腎細(xì)胞癌，是最常見的腎臟惡性腫瘤。約30%腎癌患者在首次就診時(shí)已處于疾病晚期，目前晚期腎癌缺乏有效的治療手段，預(yù)后較差。尋找腎癌標(biāo)志物對(duì)于提高腎癌的早期診斷水平，研究腎癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。尿液是尋找腎癌標(biāo)志物的理想標(biāo)本，我們前期通過磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)從多肽組的層面對(duì)尿液中腎癌標(biāo)志物進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)有意義的差異表達(dá)多肽峰。然而僅僅從多肽組的角度分析尿液中腎癌標(biāo)志物是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，腎癌相關(guān)大分子蛋白質(zhì)也可能通過各種途徑進(jìn)入尿液。本實(shí)驗(yàn)擬通過shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)比分析腎癌患者根治性腎切除術(shù)前、術(shù)后及對(duì)照組尿液中蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)組的層面探索尿液中可能存在的腎癌標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象按照知情同意的原則篩選2009年3月至2009年12月期間西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科住院患者和健康志愿者。所有入選研究對(duì)象均自愿參與本課題。入組腎癌患者均為行根治性手術(shù)治療的早期腎癌(美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)AJCC腎癌TNM分期T1～2N0M0期)患者，且病理類型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma，ccRCC)。

1.2主要儀器及試劑Zorbax 300SB-C18色譜柱購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司，EttanTMMDLC高效液相色譜購(gòu)自瑞典GE healthcare公司，LTQ離子阱質(zhì)譜購(gòu)自美國(guó)Thermo Finnigan公司，BioworksTM購(gòu)自美國(guó)Thermo Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1尿液的收集與保存收集患者入院第2天及術(shù)后第7天晨起空腹第二次中段尿。尿液標(biāo)本4 000 r/min離心10 min，獲得的上清液2 mL/管分裝后-80 ℃保存。從尿液標(biāo)本收集到離心完畢分裝凍存在1 h內(nèi)完成。

1.3.2尿蛋白的濃縮與提取(1)超濾法濃縮尿蛋白:凍存的尿液標(biāo)本4 ℃環(huán)境下融化，采用截留分子質(zhì)量(Molecular Weight Cutoff，MWCO)為50 ku的超濾管進(jìn)行超濾，超濾管上層液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，下層液體采用MWCO為3 ku的超濾管再次進(jìn)行超濾濃縮。兩次超濾液混合待用。

(2)三氯醋酸-丙酮沉淀法提取尿蛋白:①超濾液中加入適當(dāng)體積的100%三氯醋酸(TCA)溶液，使混合液中TCA濃度為10%，充分混勻后冰浴中放置10 min；②14 000 r/min離心10 min，得到蛋白沉淀；③沉淀物中加入200 μL冷丙酮(-20 ℃預(yù)冷30 min)，混勻器充分混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清;④重復(fù)步驟③兩次，以盡量洗凈沉淀中的TCA;⑤棄上清，所得蛋白沉淀物室溫放置30 min使丙酮揮發(fā)、干燥;⑥干燥后的蛋白樣品分裝后-80 ℃保存。

1.3.3蛋白混合物SDS-PAGE電泳初步分離本實(shí)驗(yàn)采用12%的分離膠、5%的積層膠，SDS-PAGE電泳分離蛋白混合物。電泳完畢2%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，脫色直至凝膠背景變白。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得圖像。

1.3.4膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解根據(jù)SDS-PAGE凝膠中蛋白分離的情況，將各組蛋白泳道切為4段(圖1)，將各段蛋白切為約1 mm3大小的膠粒。同時(shí)切下空白條帶作為對(duì)照。所有的膠粒用超純水清洗、脫色液(30%乙腈，100 mmol/L NH4HCO3)脫色，直至膠粒無(wú)色透明。抽真空離心干燥，直至膠粒變成白色顆粒狀。每管加入90 μL NH4HCO3(100 mmol/L)、10 μL DTT(100 mmol/L)，56 ℃水浴孵化30 min還原蛋白質(zhì)。測(cè)序級(jí)胰酶4 ℃酶解30 min，將蛋白酶解為肽段。加100 uL提取液(50%ACN/5%甲酸)提取肽段，抽真空離心干燥，-80 ℃保存待用。

1.3.5高效液相色譜聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段經(jīng)洗脫、上樣、平衡、分離等步驟后，通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。采用正離子模式，優(yōu)化后質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置為：電噴霧電壓3.2 kV，解吸電壓60 V，質(zhì)譜檢測(cè)范圍400～1 600 Da，加熱快溫度設(shè)置為176 ℃。每次全掃描(full scan)后采集20個(gè)碎片圖譜(MS2scan)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，得到原始文件(raw file)。

1.3.6數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和數(shù)據(jù)分析高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜采集到的原始文件采用Bioworks Browser rev 3.1軟件查庫(kù)，搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)3.53版本(http://www. ebi.ac.uk /IPI /IPI help.html)。鑒定參數(shù)設(shè)置為：蛋白酶為胰蛋白酶，最大允許丟失的酶切位點(diǎn)為2個(gè)，固定修飾為半胱氨酸的羧甲基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，前體離子的質(zhì)量允差為3.0 u，片段離子的質(zhì)量允差為0.0 u。SEQUEST蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果過濾參數(shù)為：當(dāng)Charge +1，Xcorr≥1.9；當(dāng)Charge +2，Xcorr≥2.2；當(dāng)Charge +3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。參考HE等[1]的報(bào)道，采用Buildsummary 4.7.0合并輸出鑒定的每個(gè)樣品蛋白質(zhì)的信息，僅篩選基于一個(gè)或一個(gè)以上獨(dú)特肽段識(shí)別的蛋白質(zhì)。

1.3.7搜索結(jié)果整合由于同源性肽段的存在，質(zhì)譜鑒定的肽段可能指向多個(gè)蛋白，這時(shí)搜索結(jié)果將以一組同源性蛋白呈現(xiàn)，稱為一個(gè)蛋白群(protein group)。為避免過多的估計(jì)鑒定蛋白的數(shù)量，參考高峰等[2]的報(bào)道，采用如下原則來(lái)選擇其中一個(gè)蛋白作為代表：①如果肽段只對(duì)應(yīng)一個(gè)蛋白，則選擇此“唯一”蛋白；②如果肽段對(duì)應(yīng)多個(gè)同源性蛋白，選擇匹配肽段最多的蛋白作為這個(gè)群的代表；③如果有多個(gè)蛋白擁有最多的匹配肽段數(shù)，首先選擇SWISS-PROT和/或TREMBL數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的蛋白，因這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的蛋白可信度較高；④如果仍有多個(gè)蛋白滿足條件③，選擇分子量最大的蛋白作為這個(gè)群的代表。

2結(jié)果

2.1基本信息共收集得到尿液標(biāo)本167份，經(jīng)篩選獲得符合入組條件的標(biāo)本98份。腎癌患者術(shù)前組、術(shù)后組尿液標(biāo)本各32份，其中T1aN0M0期5例，T1bN0M0期18例，T2aN0M0期8例，T2bN0M0期1例。對(duì)照組尿液標(biāo)本34份：其中腎積水12例，腎錯(cuò)構(gòu)瘤5例，腎盂惡性腫瘤4例，腎囊腫5例，腎結(jié)核2例，腎結(jié)石2例，健康志愿者3例。入組患者基本信息無(wú)明顯差異(表1)。

表1研究對(duì)象基本資料計(jì)數(shù)資料

組別n男[例(%)]年齡(x±s,歲)腎癌術(shù)前組3224(75.0)56.3±10.0腎癌術(shù)后組3224(75.0)56.3±10.0對(duì)照組3425(73.5)49.4±20.2χ2/F值0.0823.39P值0.950.16

2.2各組蛋白定量情況三氯醋酸-丙酮沉淀法成功提取了尿中蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品在562 nm處吸光度(A)值，繪制A-蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式A=0.0375 Con(A：吸光度；Con：蛋白濃度，μg/uL；R2=0.9885)。將各待測(cè)樣品組A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算得腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL。

2.3各組蛋白SDS-PAGE電泳分離情況SDS-PAGE電泳分離發(fā)現(xiàn)各組樣品蛋白條帶清晰。整體上三組蛋白條帶分布相似，同時(shí)存在細(xì)微差別，在分子量14.4～32 ku之間差異較為明顯。各組在分子量64 ku附近均有大量蛋白表達(dá)，參考對(duì)照條帶此處蛋白可能為血清白蛋白，高豐度蛋白在腎癌術(shù)前組、對(duì)照組組表達(dá)更明顯，在腎癌術(shù)后組表達(dá)量相對(duì)較少(圖1)。

圖1　尿蛋白的SDS-PAGE初步分離結(jié)果及凝膠切開位置

2.4各組蛋白表達(dá)量高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組分別共鑒定獲得肽段4 388、3 501、3 861個(gè)，其中獨(dú)特肽段(UniquePep)分別727、679、753個(gè)，三組中獨(dú)特肽段數(shù)≥1的蛋白群分別有278、237、259個(gè)，獨(dú)特肽段數(shù)≥2的蛋白群分別有83、92、106個(gè)。

2.5腎癌特異性蛋白篩選對(duì)比分析各組蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，共鑒定獲得495個(gè)非冗余蛋白。其中96個(gè)蛋白在3組中共同表達(dá)，共表達(dá)蛋白分別占腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組蛋白數(shù)目的34.53%、40.51%、37.07%。除外這96個(gè)蛋白，另外有16、50、21個(gè)蛋白分別在腎癌術(shù)前組和腎癌術(shù)后組、腎癌術(shù)前組和對(duì)照組、腎癌術(shù)后組和對(duì)照組兩兩表達(dá)。腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組分別剩余的116、104、92個(gè)蛋白為本組特異性蛋白，分別占本組總蛋白數(shù)的41.73%、43.88%、35.52%。腎癌術(shù)前組特異表達(dá)的116個(gè)蛋白中獨(dú)特肽段數(shù)≥2的高可信蛋白共有5個(gè)，其中4個(gè)為免疫球蛋白類，一個(gè)為L(zhǎng)ipocalin-2(LCN2)(圖2)。

圖2　各組蛋白集合關(guān)系模式圖(維恩圖)

Ⅰ：腎癌術(shù)前組特異表達(dá)蛋白(116個(gè))；Ⅱ：腎癌術(shù)后組特異表達(dá)蛋白(104個(gè))；Ⅲ：對(duì)照組特異表達(dá)蛋白(92個(gè))；Ⅳ：腎癌術(shù)前組合對(duì)照組共同表達(dá)蛋白(50個(gè))；Ⅴ：腎癌術(shù)前組和腎癌術(shù)后組共同表達(dá)蛋白(16個(gè))；Ⅵ：腎癌術(shù)后組和對(duì)照組共同表達(dá)蛋白(21個(gè))；Ⅶ：三組共同表達(dá)蛋白(96個(gè))。

2.6各組蛋白理論雙向電泳分布分析發(fā)現(xiàn)鑒定蛋白相對(duì)分子量分布于3.56～3 829.88 ku。分布趨勢(shì)相對(duì)集中，在10～200 ku范圍內(nèi)有717個(gè)蛋白(占總蛋白數(shù)的92.64%，含組間相同蛋白)，10 ku以下有5個(gè)蛋白，200 ku以上有52個(gè)蛋白。

鑒定蛋白等電點(diǎn)分布于4.06～11.88。3組中共有699個(gè)蛋白(占總蛋白數(shù)的90.31%，含組間相同蛋白)等電點(diǎn)分布于4～7和8～10之間，僅有56個(gè)蛋白(占總蛋白數(shù)的7.24%，含組間相同蛋白)等電點(diǎn)分布在7～8之間。

腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組分別有5、6、8個(gè)蛋白等電點(diǎn)>10。根據(jù)鑒定蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)信息，繪制各組蛋白理論雙向電泳分布圖(圖3),圖中可見各組鑒定蛋白理論雙向電泳分布總體趨勢(shì)相似，并且各組蛋白點(diǎn)具有一定的重疊，說(shuō)明各組蛋白共同表達(dá)率較高，圖中直觀顯示了各組差異蛋白點(diǎn)。

圖3　鑒定蛋白理論雙向電泳(MW/PI)分布

3討論

尿液蛋白質(zhì)表達(dá)譜復(fù)雜多變，尿液蛋白質(zhì)組研究結(jié)果變異較大。選擇合適的蛋白質(zhì)組研究策略、提高結(jié)果的可靠性是蛋白質(zhì)組研究的首要問題。Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、高通量、自動(dòng)化的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)過程操作無(wú)需經(jīng)過復(fù)雜的雙向電泳，影響因素較傳統(tǒng)的2-DE策略顯著減少，因此結(jié)果可靠性更高。同時(shí)shotgun技術(shù)分析極堿、分子質(zhì)量極小或極大的蛋白具有優(yōu)勢(shì)，本研究中腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組分別有5、6、8個(gè)蛋白等電點(diǎn)>10，3組中分子質(zhì)量10 ku以下有5個(gè)蛋白，200 ku以上有52個(gè)蛋白，這些蛋白在傳統(tǒng)的2-DE策略中通常很難檢測(cè)到。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL。SDS-PAGE電泳分離發(fā)現(xiàn)各組均有不同程度的高豐度蛋白表達(dá)，在腎癌術(shù)后組高豐度蛋白表達(dá)量相對(duì)較少。對(duì)比SDS-PAGE中BSA條帶及結(jié)合蛋白鑒定結(jié)果，考慮高豐度蛋白為白蛋白(MW 69 ku)。正常情況下，腎小球?yàn)V過的白蛋白及低分子量蛋白在腎小管幾乎全部被重吸收或代謝掉，每天從尿液中排出的蛋白少于150 mg，其中白蛋白約10 mg[3]。白蛋白是尿液中的主要高豐度蛋白。在本研究中3組尿蛋白中白蛋白相對(duì)豐度較正常情況更高(圖1)，這可能是因?yàn)槟I癌術(shù)前組患者及部分對(duì)照組患者存在不同程度的血尿，導(dǎo)致尿中以白蛋白為代表的高豐度蛋白高表達(dá)。腎癌術(shù)后患者血尿明顯減輕，尿中白蛋白含量銳減，所以腎癌術(shù)后組蛋白濃度低，高豐度蛋白表達(dá)也相對(duì)較少。

分析發(fā)現(xiàn)各組蛋白鑒定數(shù)目非常接近(腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組、對(duì)照組尿液中分別鑒定獲得278、237、259個(gè)蛋白)，蛋白數(shù)目與蛋白濃度之間缺乏相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定的蛋白大部分只檢測(cè)到一個(gè)肽段，為低豐度蛋白。這說(shuō)明shotgun技術(shù)鑒定蛋白敏感性高，大量的低豐度蛋白被發(fā)現(xiàn)。這些低豐度蛋白總體濃度不高，但在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，而濃度占優(yōu)的以白蛋白為首的高豐度蛋白在數(shù)量上有限，所以出現(xiàn)蛋白濃度與數(shù)目不一致的情況。

各組蛋白的分子量、等電點(diǎn)分布范圍廣泛又相對(duì)集中，主要分布于分子質(zhì)量10～100 ku、等電點(diǎn)4～7和8～10之間。各組蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)分布規(guī)律與SUN等[4]通過3種不同分離方法分析尿蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果一致。

尿液在形成過程中流經(jīng)腎小管上皮，腎小管上皮細(xì)胞可分泌一種叫做外排小體(exosome)的微囊，這些微囊包含的蛋白構(gòu)成尿蛋白的重要組成部分[5]。腎小管上皮細(xì)胞在由正常分化細(xì)胞逐步轉(zhuǎn)化為腎癌細(xì)胞的過程中以及腎癌形成后，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的重要分子很容易通過胞吐外排小體的形式進(jìn)入尿液。同時(shí)血液中的腎癌標(biāo)志物也可通過腎小球過濾進(jìn)入尿液。當(dāng)腎癌生長(zhǎng)到一定程度后，還可侵犯集合系統(tǒng)，腫瘤相關(guān)分子更容易直接進(jìn)入尿液。尿液中可能富含腎癌標(biāo)志物[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，有116個(gè)蛋白在腎癌術(shù)前組尿液中特異表達(dá)，這些蛋白中可能有重要的腎癌標(biāo)志物。分析發(fā)現(xiàn)，獨(dú)特肽段數(shù)≥2的蛋白有5個(gè)，這些蛋白為高可信蛋白。其中4個(gè)為免疫球蛋白類，推測(cè)可能與腎癌誘導(dǎo)的機(jī)體免疫有關(guān)，另一個(gè)高可信蛋白為L(zhǎng)CN2。

LCN2又稱中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，分子質(zhì)量25 ku。LCN2最初在活化的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其他很多細(xì)胞也可產(chǎn)生LCN2，如腎小管上皮細(xì)胞受到各種創(chuàng)傷因素的刺激后可釋放LCN2。LCN2是載脂蛋白家族成員之一，擁有一個(gè)保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)，即由8個(gè)反平行折疊形成的桶狀親脂性結(jié)構(gòu)，借此結(jié)構(gòu)可與一些親脂小分子結(jié)合而形成復(fù)合物，在親脂小分子的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用。LCN2還可以通過二硫鍵結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)，調(diào)節(jié)MMP9酶活性，同時(shí)還參與相關(guān)細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

LCN2在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等關(guān)系密切。張秀峰等[7]發(fā)現(xiàn)LCN2在乳腺癌中高表達(dá)。MONIAUX等[8]發(fā)現(xiàn)LCN2在胰腺癌高表達(dá)，在健康胰腺組織中低表達(dá)，但在胰腺癌PanIN-1期即有LCN2表達(dá)，提示LCN2可能為胰腺癌早期標(biāo)志物。BERGER等[9]發(fā)現(xiàn)敲出小鼠LCN2基因可使乳腺癌成瘤受抑制。帖儒修等[10]發(fā)現(xiàn)LCN2基因表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)人胚腎HEK293細(xì)胞增殖。TONG等[11]發(fā)現(xiàn)LCN2表達(dá)上調(diào)可降低肺腺癌A549對(duì)凋亡的敏感性，表達(dá)下調(diào)則能促進(jìn)OSU03012誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生。張丕顯等[12]發(fā)現(xiàn)LCN2蛋白可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生自噬性凋亡。BAUER等[13]分析207例乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)68例表達(dá)LCN2，是預(yù)后不良的標(biāo)志分子。

近年來(lái)LCN2與腎癌的關(guān)系也有報(bào)道。2010年BARRESI等[14]通過免疫組化分析30例手術(shù)切除的腎臟腫瘤標(biāo)本(包括18例ccRCC，5例paRCC，3例chRCC，2例尿路上皮癌和2例大嗜酸粒細(xì)胞瘤)和2例ccRCC腹膜轉(zhuǎn)移癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中28例有不同程度的LCN2表達(dá)，尤其高表達(dá)在paRCC、chRCC及病理分級(jí)較高的ccRCC高表達(dá)。在腹膜轉(zhuǎn)移癌中也同樣發(fā)現(xiàn)LCN2表達(dá)。2010年P(guān)ORTA等[15]發(fā)現(xiàn)血清LCN2水平是接受舒尼替尼治療的轉(zhuǎn)移性腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存期的重要預(yù)后因子。2011年P(guān)ERRIN等[16]在一項(xiàng)包含74例ccRCC患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血清NGAL-MMP-9復(fù)合物濃度與患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期呈負(fù)相關(guān)，LCN2表達(dá)于腎癌組織浸潤(rùn)的白細(xì)胞中。2013年SHALABI等[17]通過尿LCN2檢測(cè)用于腎細(xì)胞癌不同亞型的鑒定。2014年YU等[18]研究發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞中LCN2表達(dá)水平與對(duì)舒尼替尼治療敏感性呈負(fù)相關(guān)，LCN2可通過作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A進(jìn)而促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖。

結(jié)合本研究結(jié)果及前人的報(bào)道，LCN2可能在腎癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用，其具體作用機(jī)制目前尚不清楚，值得深入研究。LCN2可能是尿液中腎癌重要的標(biāo)志物，尿LCN2檢測(cè)對(duì)腎癌早期診斷的意義也值得進(jìn)一步研究。

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(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-05-19修回日期：2015-08-09

通訊作者:王子明，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師.

作者簡(jiǎn)介:付德來(lái)(1981-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)博士.研究方向：泌尿系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床、尿道狹窄. E-mail：fudelai@126.com

中圖分類號(hào):R737.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.015

Screening urinary markers for renal cell carcinomaby shotgun strategy

FU De-lai1, CHONG Tie1, LI He-cheng1, ZHANG Peng1, LIU Hong-tao2, WANG Zi-ming1

(1.Department of Urology，2. Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate potential urinary protein markers of renal cell carcinoma (RCC). MethodsMiddle stream samples of 2nd morning urine from RCC patients, pre-operatively and post-operatively, and from non-RCC patients were collected. Urine proteins were extracted and separated by SDS-PAGE, digested by trypsin and further analyzed by Capillary High Performance Liquid Chromatography ESI-MS/MS. Results were integrated and conducted for bioinformatic analysis with Bioworks Browser rev 3.1 in searching SWISS-PROT and/or TREMBL human proteome database. ResultsFor pre-operative (n=32), post-operative (n=32) and control (n=34) urine samples, the protein concentration was 32.79, 9.15 and 26.57 μg/μL; 727, 679, and 753 unique peptides were detected; 278, 237, and 259 protein clusters were identified under the criterion of uniquepepcount ≥1; and 83, 92, and 106 protein clusters were found under the criterion of uniquepepcount ≥2. A total of 5 proteins (namely LCN2 and 4 immune globulins) were specifically expressed in pre-operative group. ConclusionsLCN2 is specifically expressed in urine of RCC patients. The role of LCN2 in the occurrence and development of RCC and its potency as urinary marker for RCC is worthy of further investigation.

KEY WORDS:renal cell carcinoma; marker; urine; proteome

E-mail：ziming-w@263.net