閆　寧，趙韜智，向德虎，龔達(dá)平，張洪博，杜詠梅，劉新民，張忠鋒，劉艷華*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

普通煙草茄尼基焦磷酸合酶基因NtSPS的克隆和表達(dá)分析

閆寧1，趙韜智2，向德虎1，龔達(dá)平1，張洪博1，杜詠梅1，劉新民1，張忠鋒1，劉艷華1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為揭示煙草茄尼基焦磷酸合酶（Nicotiana tabacum solanesyl diphosphate synthase,NtSPS）在煙草茄尼醇生物合成中的作用，分離了煙草品種紅花大金元茄尼醇生物合成關(guān)鍵基因NtSPS1和NtSPS2，并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)、進(jìn)化分析和亞細(xì)胞定位分析，研究了其在煙草植株不同器官的表達(dá)水平以及煙草植株不同器官的茄尼醇、葉綠素含量與NtSPS表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，NtSPS1和NtSPS2開放讀碼框（ORF）大小分別為1209、1206 bp，分別編碼402、401個(gè)氨基酸；NtSPS1 和NtSPS2均存在2個(gè)保守的DDxxD結(jié)構(gòu)域，這與NtSPS功能發(fā)揮相關(guān)；NtSPS1、NtSPS2與番茄SPS同源性較高，這與煙草、番茄均為茄科作物有關(guān)；NtSPS1、NtSPS2均定位于葉綠體中；煙草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2表達(dá)水平排序?yàn)椋喝~>莖>根，這與茄尼醇、葉綠素在煙草植株中的分布規(guī)律一致。本研究可為NtSPS調(diào)控?zé)煵萸涯岽忌锖铣蓹C(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

煙草；茄尼醇；茄尼基焦磷酸合酶；基因表達(dá)；葉綠素

茄尼醇為四倍半萜烯醇，是一種重要的藥物中間體，可用于合成輔酶Q10和維生素K2等泛醌類藥物和抗癌增效劑SDB[1-5]。輔酶Q10可用于治療偏頭痛、帕金森綜合癥、神經(jīng)退行性疾病[6-7]，并可作為2型糖尿病患者的膳食補(bǔ)充劑[8]；維生素K2已被用于治療骨質(zhì)疏松癥等[9]；茄尼醇衍生物SDB能夠克服腫瘤細(xì)胞經(jīng)由P-糖蛋白介導(dǎo)的多種抗藥性，并與一些抗腫瘤藥物發(fā)揮協(xié)同作用[1,10]。由于茄尼醇鏈長(zhǎng)、合成步驟多，其人工合成難度很大[11]，目前主要依賴于從植物中提取，而煙葉是提取茄尼醇最理想的材料[4,12]。自Rowland等[13]首次在煙草中發(fā)現(xiàn)茄尼醇以來，茄尼醇在馬鈴薯、番茄、茄子和辣椒等茄科作物中均有報(bào)道，煙草中含量最高[14-15]；在煙草中，植株不同器官中的茄尼醇含量也不同，以葉中的含量最高，尤其是上部葉[16-17]。茄尼醇在植物中以游離態(tài)和酯型結(jié)合態(tài)2種形式存在，煙草葉片游離態(tài)茄尼醇/總茄尼醇范圍為0.18～0.85[17]。為鑒定出富含茄尼醇的煙草品種，本課題組測(cè)定了93份煙草種質(zhì)的茄尼醇含量，發(fā)現(xiàn)其含量為1.78～3.60%[4]。最近，向德虎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，煙草茄尼醇含量的遺傳由主基因和多基因共同決定，以主基因遺傳為主，同時(shí)受到環(huán)境的影響。

在植物組織中，茄尼醇是在質(zhì)體中經(jīng)由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的[4,15,19-20]。1-脫氧-5-磷酸木酮糖合成酶（DXS）催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合形成 1-脫氧-5-磷酸木酮糖（DXP），DXP在1-脫氧-5-磷酸木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）的催化作用下，經(jīng)過分子內(nèi)重排和還原反應(yīng)形成MEP；MEP在一系列酶的催化作用下形成異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）[4,15]。IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IPI）的催化下形成DMAPP，茄尼基焦磷酸合酶（Solanesyl diphosphate synthase,SPS）催化IPP和DMAPP形成茄尼基焦磷酸（SPP），SPP是茄尼醇生物合成的前體物質(zhì)[4,15,19]。目前已在擬南芥[21-24]、水稻[25]和番茄[26]中鑒定出SPS的同源基因。而煙草中關(guān)于SPS的克隆和表達(dá)分析的研究未見報(bào)道。

本研究分離獲得煙草茄尼醇生物合成關(guān)鍵酶基因NtSPS1和NtSPS2，對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)、進(jìn)化分析、亞細(xì)胞定位分析以及表達(dá)特性分析，分析了煙草植株不同器官的茄尼醇、葉綠素含量與NtSPS表達(dá)水平的相關(guān)性，為NtSPS調(diào)控?zé)煵萸涯岽忌锖铣傻臋C(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料

供試材料為普通煙草品種紅花大金元（Nicotiana tabacum cv.Honghuadajinyuan）。煙草培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，光暗周期14 h/10 h，相對(duì)濕度（70±10）%；土壤條件為：pH 7.2，全氮1.89 g/kg，堿解氮48.3 mg/kg，全磷0.45 g/kg，有效磷32.4 mg/kg，全鉀32.5 g/kg，速效鉀219 mg/kg，有機(jī)質(zhì)7.39 g/kg。移栽后30 d，分別采集根、莖和葉樣品。采取混合取樣的方法：選擇9株有代表性的健康植株，每3株混合，取根、莖、葉，3次重復(fù)。

1.2基因克隆

使用GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo)提取煙草植株不同器官（根、莖、葉）總RNA。采用PrimerScriptTM RT-PCR Kit(Takara)反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。檢索中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://218.28.140.17/），得到普通煙草NtSPS1和NtSPS2基因全長(zhǎng)CDS，并據(jù)其進(jìn)行相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)（表1），用于擴(kuò)增普通煙草NtSPS1和NtSPS2基因全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[27]。將PCR產(chǎn)物檢測(cè)回收，連接pmd18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。篩選陽性克隆，并送華大基因公司測(cè)序。

表1　煙草茄尼基焦磷酸合酶（NtSPS）基因克隆和表達(dá)分析的引物及其序列Table 1　Primers used in cloning and expression analysis of Nicotiana tabacum solanesyl diphosphate synthase(NtSPS).

1.3多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化和亞細(xì)胞定位分析

采用DNAMAN軟件將得到的NtSPS1和NtSPS2序列與擬南芥、水稻和番茄SPS進(jìn)行多序列比對(duì)分析；利用MEGA 5.0[28]構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。采用在線程序Predotar[29]和TargetP[30]，分別對(duì)NtSPS1 和NtSPS2亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4熒光定量表達(dá)分析

分別提取煙草植株不同器官（根、莖和葉）的總RNA，去除基因組DNA污染后，稀釋到100 μg/μL。按照試劑盒說明，利用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，Takara）在熒光定量 PCR儀 ABI7500上進(jìn)行qRT-PCR分析。所用基因特異引物見表1，以煙草Actin基因作為內(nèi)參。

1.5茄尼醇含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]方法，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件后利用超高效液相色譜檢測(cè)煙草植株不同器官（根、莖和葉）中總茄尼醇和游離態(tài)茄尼醇含量，并計(jì)算游離態(tài)/總茄尼醇。儀器條件為，色譜柱：BEHC181.7μm 2.1*50 mm，流動(dòng)相：甲醇+乙腈=50+50，流速：0.5 mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：208nm。

1.6葉綠素含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[31]的方法，測(cè)定煙草植株不同器官（根、莖和葉）中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，并計(jì)算葉綠素a/b。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用Excel整理，所有數(shù)據(jù)在P<0.05水平下進(jìn)行Tukey多重比較。試驗(yàn)中所有的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS18.0（SPSSInc.,Chicago,IL,USA）軟件中完成。

2　結(jié)果

2.1NtSPS1、NtSPS2基因及其編碼蛋白信息

根據(jù)中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的普通煙草NtSPS1和NtSPS2基因全長(zhǎng)CDS，設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表1），在普通煙草紅花大金元中獲得了兩個(gè)基因的序列，NtSPS1和NtSPS2基因的PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。NtSPS1和NtSPS2開放讀碼框（ORF）長(zhǎng)度分別為1209、1206 bp，編碼氨基酸數(shù)目分別為402、401個(gè)，DDxxD結(jié)構(gòu)域數(shù)目均為2個(gè)；在線程序Predotar和TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NtSPS1 和NtSPS2均具有葉綠體定位序列，成熟蛋白定位于葉綠體，參與茄尼醇在葉綠體中的合成反應(yīng)（表2）。

圖1　NtSPS1和NtSPS2基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis results of NtSPS1 and NtSPS2.

表2　NtSPS1、NtSPS2及其編碼蛋白的序列信息Table 2　Sequence information of NtSPS1,NtSPS2 and their corresponding proteins.

2.2多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到的煙草SPS與擬南芥、水稻和番茄SPS進(jìn)行多序列比對(duì)（圖2）。從圖2看出，不同作物中的SPS均存在2個(gè)保守的富含天冬氨酸的DDxxD結(jié)構(gòu)域。DDxxD結(jié)構(gòu)域是異戊烯基焦磷酸合酶最典型的保守結(jié)構(gòu)域，它可以結(jié)合二價(jià)金屬離子，參與協(xié)調(diào)二價(jià)金屬離子和底物分子二磷酸基團(tuán)的結(jié)合；DDxxD結(jié)構(gòu)域位于催化位點(diǎn)的入口，對(duì)反應(yīng)底物的定位起關(guān)鍵作用[32]。因此，NtSPS1和NtSPS2均具有2個(gè)DDxxD結(jié)構(gòu)域，而作為SPS的保守結(jié)構(gòu)域，DDxxD結(jié)構(gòu)域可以確保NtSPS功能發(fā)揮。

圖2　煙草、擬南芥、水稻和番茄SPS序列比對(duì)結(jié)果Fig.2　Alignment results of SPS sequence from tobacco, Arabidopsis,rice and tomato.

圖3　不同物種SPS、DPS、GPS、HPS和OPS的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3　Phylogenetic relationships among SPS,DPS,GPS, HPS and OPS in different species

利用MEGA5.0對(duì)不同物種中的茄尼基焦磷酸合酶（SPS）、聚十異戊烯基焦磷酸合酶（DPS）、牻牛兒基焦磷酸合酶（GPS）、聚六異戊烯基焦磷酸合酶（HPS）和聚八異戊烯基焦磷酸合酶（OPS）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖3）。從圖3可以看出，NtSPS1、NtSPS2與SlSPS1同源性較高，這與煙草、番茄均為茄科作物有關(guān)；相比之下，NtSPS1、NtSPS2 與CsSPS1、AtSPS1、AtSPS2、OsSPS2、CrSPS1、NsSPS1、SsSPS1、PmSPS1等同源性較低，這主要與煙草和黃瓜、擬南芥、水稻、萊茵衣藻、魚腥藻PCC7120、藍(lán)藻、集胞藻PCC6803等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)有關(guān)。NtSPS1、NtSPS2與SlGPS1同源性較低，這與SPS和GPS分別用于催化合成C45茄尼基焦磷酸和C10牻牛兒基焦磷酸有關(guān)[33]；另外，在擬南芥中AtSPS1、AtSPS2與AtSPS3同源性較低，在水稻中OsSPS1與OsSPS2的同源性較低，這可能與不同SPS基因具有不同的生物催化功能相關(guān)，其中OsSPS1、OsSPS2分別催化合成線粒體中的泛醌和葉綠體中的質(zhì)體醌[25]。

2.3熒光定量表達(dá)分析

從圖4可以看出，煙草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量差異顯著（P>0.05），二者均是葉>莖>根。其中，葉中NtSPS1和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量分別是莖的7.69倍、4.95倍，莖中NtSPS1 和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量分別是根的10.4倍、12.3倍。由此可見，葉中NtSPS1和NtSPS2相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖和根的。

圖4　煙草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量Fig.4　Relative expression levels of NtSPS1 and NtSPS2 in different organs of tobacco plants.

2.4茄尼醇含量

從表3可以看出，煙草植株不同器官總茄尼醇和游離態(tài)茄尼醇含量差異顯著（P>0.05），二者均是葉>莖>根；葉和莖的游離態(tài)/總茄尼醇無顯著差異（P<0.05），且均顯著高于根（P>0.05）。葉中總茄尼醇和游離態(tài)茄尼醇含量分別是莖的25.6倍、27.0倍；根中總茄尼醇和游離態(tài)茄尼醇含量均為0。由此可見，葉中總茄尼醇和游離態(tài)茄尼醇含量顯著高于莖和根的。

表3　煙草植株不同器官總茄尼醇、游離態(tài)茄尼醇含量和游離態(tài)/總茄尼醇Table 3　Total solanesol,free state solanesol and the ratio of free:total solanesol in different organs of tobacco plants.

2.5葉綠素含量

從表4可以看出，煙草植株不同器官中的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b和總?cè)~綠素差異顯著（P>0.05），四者均是葉>莖>根。其中，葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b和總?cè)~綠素分別是莖的26.8倍、14.1倍、1.88倍、21.9倍，根中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均為0。由此可見，葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b和總?cè)~綠素含量顯著高于莖和根的。

表4　煙草植株不同器官葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b和總?cè)~綠素Table 4　Chlorophyll a,chlorophyll b,chlorophyll a/b ratio and total chlorophyll content in different organs of tobacco plants.

3　討論

本研究克隆獲得了普通煙草NtSPS1和NtSPS2基因序列，其開放讀碼框長(zhǎng)度分別為1209、1206 bp，編碼氨基酸數(shù)目分別為402、401個(gè)。NtSPS1和NtSPS2的DDxxD結(jié)構(gòu)域數(shù)目均為2個(gè)，DDxxD結(jié)構(gòu)域是異戊烯基焦磷酸合酶最典型的保守結(jié)構(gòu)域，其參與協(xié)調(diào)二價(jià)金屬離子和底物分子二磷酸基團(tuán)的結(jié)合，對(duì)反應(yīng)底物的定位起關(guān)鍵作用，確保SPS功能發(fā)揮[32]。在線預(yù)測(cè)表明，NtSPS1和NtSPS2成熟蛋白均定位于葉綠體中，并參與茄尼醇的生物合成，這與番茄SPS定位于葉綠體中相一致[26]。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以分析分子之間的親緣關(guān)系，通常位于同一亞家族或小分枝上的分子往往可能具有相似的功能[27]。本研究中，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，NtSPS1 和NtSPS2與番茄中的SPS親緣關(guān)系最近，這與煙草、番茄均為茄科作物有關(guān)；然而NtSPS1和NtSPS2與番茄中的GPS同源性較低，這與SPS、GPS具有不同的生物催化功能有關(guān)，其分別用于催化合成C45茄尼基焦磷酸和C10牻牛兒基焦磷酸[33]。表達(dá)特性分析表明，葉中NtSPS1和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖和根的，這與茄尼醇在葉中含量最高相一致[16-17]。葉中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著高于莖和根的，這與NtSPS1和NtSPS2的相對(duì)表達(dá)量在葉中最高一致，可能與葉綠體是茄尼醇生物合成的場(chǎng)所有關(guān)[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NtSPS1和NtSPS2主要在葉中表達(dá)，這與擬南芥中兩個(gè)SPS基因AtSPS1和AtSPS2主要在葉中表達(dá)相一致[21-23]。水稻中，已經(jīng)鑒定出兩個(gè)SPS基因OsSPS1和OsSPS2，OsSPS1主要在根中表達(dá)，OsSPS2主要在根和葉中表達(dá)，并分別合成線粒體中的泛醌和葉綠體中的質(zhì)體醌[25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，AtSPS1和AtSPS2基因沉默會(huì)降低擬南芥葉片中的質(zhì)體醌含量并誘導(dǎo)產(chǎn)生PSII光抑制[24]，而fibrillin 5（FBN5）結(jié)合到AtSPS1和AtSPS2上調(diào)控質(zhì)體醌合成[34]；番茄SlSPS組成型過表達(dá)可提高煙草幼嫩葉片中的質(zhì)體醌含量，SlSPS對(duì)番茄葉綠體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮是必須的[26]。因此，目前對(duì)SPS功能的研究主要集中在質(zhì)體醌生物合成中的作用，研究對(duì)象主要是擬南芥、水稻和番茄等模式植物，而SPS在茄尼醇生物合成中的作用研究很少，尤其在重要經(jīng)濟(jì)作物煙草中的研究未見報(bào)道。作為茄尼醇含量最豐富的植物資源，煙草茄尼醇合成調(diào)控仍不清楚，特別是NtSPS調(diào)控?zé)煵萸涯岽忌锖铣傻臋C(jī)制有待深入研究。本研究可為NtSPS調(diào)控?zé)煵萸涯岽忌锖铣蓹C(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究從普通煙草中克隆得到2個(gè)SPS基因，命名為NtSPS1和NtSPS2。NtSPS1和NtSPS2均存在兩個(gè)保守的DDxxD結(jié)構(gòu)域，其與NtSPS功能發(fā)揮相關(guān)；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，NtSPS1和NtSPS2與番茄SPS同源性較高，這與煙草、番茄均為茄科作物有關(guān)；在線預(yù)測(cè)表明，NtSPS1、NtSPS2均定位于葉綠體中；煙草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2表達(dá)水平排序?yàn)椋喝~>莖>根，這與茄尼醇、葉綠素在煙草植株中的分布規(guī)律一致。

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Cloning and Expression Analysis of Solanesyl Diphosphate Synthase(NtSPS) Genes in Nicotiana Tabacum

YAN Ning1,ZHAO Taozhi2,XIANG Dehu1,GONG Daping1,ZHANG Hongbo1, DU Yongmei1,LIU Xinmin1,ZHANG Zhongfeng1,LIU Yanhua1*
(1.Tobacco Research Institute of ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao 266101,China;2.College of Life Science, NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

We cloned two solanesyl diphosphate synthase genes,NtSPS1 and NtSPS2,from tobacco(Nicotiana tabacum cv. Honghuadajinyuan)plants to investigate their role in tobacco solanesol biosynthesis.In this study,we performed sequence alignment, phylogenetic analysis,and subcellular localization analysis of NtSPS1 and NtSPS2.Further,we studied the expression levels of NtSPSs in different organs of tobacco plants,and analysed the relationship between solanesol,chlorophyll content and the expression levels of NtSPSs in different organs of tobacco plants.The results showed that:NtSPS1 contained an open reading frame(ORF)of 1209 bp encoding 402 amino acids and NtSPS2 contained an ORF of 1206 bp encoding 401 amino acids.Both NtSPS1 and NtSPS2 had two conserved DDxxD domains,which were related to the function of NtSPS.The homology among NtSPS1,NtSPS2,and SlSPS was very high,probably because both tobacco and tomato were solanaceous crops.Both NtSPS1 and NtSPS2 were located in the chloroplast.The expression levels of NtSPS1 and NtSPS2 in different organs of tobacco plants decreased according to this order: leaf>stem>root,which was consistent with the distribution of solanesol and chlorophyll in tobacco plants.This study could lay a foundation for further research on the role of NtSPSs in the regulation of tobacco solanesol biosynthesis.

Nicotiana tabacum;solanesol;solanesyl diphosphate synthase;gene expression;chlorophyll

S572.03

1007-5119（2016）03-0045-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.008

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）；中國(guó)煙草總公司科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草低苯并芘突變體篩選和基因定位研究”[110201401008(JY-08)]；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草增香減害關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201203091）

閆寧，男，博士，助理研究員，從事煙草功能成分與綜合利用研究。E-mail：yanning5110@163.com。*通信作者，E-mail：liuyanhua@caas.cn

2015-11-02

2016-04-06