李小杰，李淑君，陳玉國(guó)，王海濤，李成軍，趙鳳霞，李彥平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000）

豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病力及遺傳多樣性分析

李小杰，李淑君*，陳玉國(guó)，王海濤，李成軍，趙鳳霞，李彥平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000）

為有效防控豫南煙區(qū)煙草青枯病，對(duì)來自信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣的煙草青枯病菌的致病力和遺傳多樣性進(jìn)行了測(cè)定分析。人工接種試驗(yàn)表明，豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病力分為強(qiáng)、中和弱3種，不同寄主來源的煙草青枯病菌具有顯著的致病力差異。從100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出8個(gè)擴(kuò)增條帶清晰且具有豐富多態(tài)性的引物用于不同地區(qū)煙草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析，共擴(kuò)增出720條帶，其中多態(tài)性帶占88.9%。聚類結(jié)果和遺傳相似系數(shù)分析顯示，供試菌株可分為A、B兩大類，遺傳相似系數(shù)范圍為0.49～1.00，且供試菌株間的遺傳相似性與其地理來源有一定的相關(guān)性。綜上所述，豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病力存在明顯差異且其DNA具有豐富的遺傳多樣性。

豫南煙區(qū)；煙草青枯病菌；致病力；遺傳多樣性

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的，在世界范圍內(nèi)廣泛分布、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性煙草根莖病害，目前在我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，造成了巨大的損失[1-2]。同時(shí)由于氣候等方面的原因，該病害發(fā)生有向北擴(kuò)展蔓延趨勢(shì)。目前，河南、安徽、山東、陜西等地均有煙草青枯病的發(fā)生并造成不同程度的損失[3-6]。青枯雷爾氏菌具有顯著的生理分化現(xiàn)象[7-8]，不同地理來源和來自不同寄主植物的病原菌在致病力等方面存在著較大差異。目前有關(guān)青枯菌致病力的研究已有許多報(bào)道，何自福等[9]利用鑒別寄主的方法將31個(gè)茄科青枯菌菌株分為強(qiáng)致病力、中等致病力和弱致病力3個(gè)組群，表明其致病力存在明顯差異；黎妍妍等[10]、王國(guó)平等[11]、陳曉敏等[12]根據(jù)煙草青枯病菌在不同煙草品種上的致病力強(qiáng)弱，將其分為不同的致病型或致病力類群。正因?yàn)榍嗫堇谞柺暇闹虏×Ψ只绱孙@著，從而導(dǎo)致青枯病的防治更加困難，因此對(duì)青枯菌進(jìn)行致病性分析對(duì)病害防治具有重要的指導(dǎo)意義。

植物青枯菌菌株間的致病性差異的本質(zhì)有可能在于其遺傳物質(zhì)DNA的變異，近年來，已有研究者開始利用分子生物學(xué)技術(shù)研究青枯菌菌株間的遺傳差異[13-16]，這些研究結(jié)果都表明了青枯菌的DNA存在著豐富的遺傳多樣性。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)河南省煙草青枯病菌進(jìn)行了遺傳差異分析。

本研究對(duì)豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病力以及遺傳多樣性進(jìn)行研究，旨在探討不同來源青枯菌的致病力差異以及進(jìn)化和親緣關(guān)系，為指導(dǎo)煙草品種的合理布局和病害預(yù)測(cè)與防治提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從河南省信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣采集分離到的19個(gè)煙草青枯菌菌株作為供試菌株。

1.1.2供試煙草品種河南省主栽品種中煙100作為供試煙草品種。

1.1.3培養(yǎng)基菌株分離培養(yǎng)基（TTC）：多聚蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。分離時(shí)在基本培養(yǎng)基中加入氯化三苯基四氮唑（TTC），終濃度為0.05%。

1.2方法

1.2.1煙草青枯病菌的致病力測(cè)定將供試菌株分別在選擇性TTC瓊脂平板上劃線，28℃下培養(yǎng)48 h后，用無菌水配制成濃度為3×l08cfu/mL的細(xì)菌懸浮液供接種用。在溫室條件下按常規(guī)方法育苗，幼苗長(zhǎng)至4～6葉時(shí)供接種使用。采用葉片注射接種法測(cè)定各菌株的致病力：從煙株頂芽往下數(shù)第3片葉背的葉脈，用滅菌的4號(hào)針頭將菌液注射到葉肉細(xì)胞間隙，并對(duì)葉片正面進(jìn)行噴水保濕處理。每處理接種5株煙苗，煙苗置于28℃、濕度70%的條件下培養(yǎng)，每天觀察并記錄各處理煙苗發(fā)病情況，直至病情穩(wěn)定。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無明顯癥狀；1級(jí)，葉片皺縮，注射區(qū)沒有褪綠變黃；2級(jí)，注射區(qū)形成黃色壞死斑；3級(jí)，注射區(qū)形成褐色壞死斑；4級(jí)，注射區(qū)壞死斑明顯擴(kuò)展，葉片萎蔫；5級(jí)，整片葉片萎蔫；6級(jí)，植株枯萎死亡。

致病力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)青枯病菌菌株對(duì)寄主致病力的強(qiáng)弱平均病級(jí)，分為3個(gè)類群：A群（強(qiáng)致病力），平均病級(jí)>4；B群（中等致病力），3≤平均病級(jí)≤4；C群（弱致病力），平均病級(jí)<3。

1.2.2不同致病力的青枯菌在煙苗組織內(nèi)的含菌量檢測(cè)制備菌懸液，濃度為3×l08cfu/mL，每株10 mL灌根接種，煙苗為4～6葉期。每處理15株，3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置清水對(duì)照。28℃ 12 h光照培養(yǎng)，于接種后10 d取樣，取樣部位為煙株莖基部。每1 g樣本加入3 mL無菌水進(jìn)行充分研磨，按10倍梯度稀釋，分別取不同稀釋液0.1 mL涂布于TTC培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，然后換算成每克鮮重青枯菌量。公式如下：

利用DPS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

1.2.3煙草青枯病菌的RAPD分析基因組DNA提?。簩⑶嗫菥杲臃N在NA固體培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)48 h，用滅菌水懸浮菌體，根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒（生工生物）說明書提取基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，貯存于-20℃冰箱中備用。

RAPD分析：從100個(gè)隨機(jī)引物中篩選得到8個(gè)條帶清晰、多態(tài)性好的引物（表1）用于青枯菌DNA 的RAPD分析，引物由生工（上海）生物技術(shù)有限公司合成。RAPD反應(yīng)總體系為25 μL，各反應(yīng)組分終濃度為：1.25 U Taq DNA聚合酶，10 μmol/L引物1 μL，2.5 mmol/LdNTPs 2μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，DNA模板40 ng。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，37℃退火90 s，72℃延伸2 min，41個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，記錄每條引物每個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果。對(duì)電泳結(jié)果采用有帶記為“1”、無帶記為“0”的方法記錄譜帶。利用NTSYS2.1分析軟件，對(duì)結(jié)果以非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)配對(duì)（unweighted pair group method with arithmetic averages，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，自動(dòng)生成相似性系統(tǒng)數(shù)和樹狀圖進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建種間及種內(nèi)的系統(tǒng)聚類圖。

表1　篩選出的隨機(jī)引物以及擴(kuò)增的條帶數(shù)Table 1　Number of fragments amplified with 8 primers selected from 100 random primers

2　結(jié)果

2.1豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病性

菌株接種后72 h開始出現(xiàn)典型癥狀，一般在15 d左右病情穩(wěn)定。根據(jù)煙草青枯菌菌株對(duì)寄主致病力的強(qiáng)弱，將19個(gè)供試菌株分為3個(gè)類群：A群（強(qiáng)致病力群），占供試菌株的42.1%；B群（中等致病力群），占供試菌株的42.1%；C群（弱致病力群），占供試菌株的15.8%（表2）。其中強(qiáng)致病力菌株主要分布在駐馬店確山縣瓦崗鎮(zhèn)，寄主煙草品種以云煙87為主；中等致病力菌株主要分布在駐馬店遂平縣玉山鎮(zhèn)，寄主煙草品種以中煙100為主。由此表明，不同寄主來源的煙草青枯病菌之間具有明顯的致病力差異。

2.2不同致病力的煙草青枯病菌在煙株體內(nèi)的繁殖情況

接種后10 d，不同菌株導(dǎo)致煙株發(fā)病情況有很大差異。對(duì)不同發(fā)病癥狀的具有代表性的煙株進(jìn)行體內(nèi)青枯病菌含量測(cè)定（圖1），結(jié)果表明，接種強(qiáng)致病力菌株TXLLJ14-3的煙株體內(nèi)青枯病菌的含量較高，且極顯著差異于接種中等致病力菌株TSP14-2和SP14-3的煙株體內(nèi)的含菌量，而接種弱致病力菌株TXLT14-2的煙株體內(nèi)含菌量為最少。由此表明，供試煙草青枯病菌的致病力與其在寄主體內(nèi)的繁殖量成正比。

表2　分離菌株的致病性強(qiáng)弱類群Table 2　Groups of pathogenicity of isolates

圖1　接種不同煙草青枯病菌的煙株體內(nèi)含菌量Fig.1　Determination of the amount of bacteria in tobacco plant after inoculation of tobacco bacterial wilt

2.3煙草青枯病菌的RAPD分析

利用篩選出的8條引物對(duì)上述不同地區(qū)具有代表性的10個(gè)煙草青枯病菌菌株進(jìn)行RAPD分析。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，且條帶大小主要分布在0.35～5.0 kb。供試的8條引物所標(biāo)記出的總的DNA指紋譜帶數(shù)為720條，其中多態(tài)性條帶640條，多態(tài)檢測(cè)率為88.9%，表明8條隨機(jī)引物對(duì)供試煙草青枯病菌菌株有豐富的遺傳多態(tài)性。圖2為隨機(jī)引物S27和S29的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2　隨機(jī)引物S29和S27的RAPD擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　RAPDproductsamplifiedwithrandomprimeS29andS27

聚類分析結(jié)果表明（圖3），供試的10個(gè)菌株大體可以聚為A、B兩大類，當(dāng)取相似值0.67時(shí)，A類又可分為2個(gè)群，A1群包括1個(gè)來自信陽羅山縣龍井鄉(xiāng)云煙87品種的青枯病菌菌株，A2群包括2個(gè)來自信陽羅山縣檀崗村中煙201品種的青枯病菌菌株；當(dāng)取相似值0.74時(shí)，B類也可分為2個(gè)群，其中B1群包括2個(gè)來自信陽羅山縣龍井鄉(xiāng)云煙87品種的青枯病菌菌株和3個(gè)來自駐馬店遂平縣玉山鎮(zhèn)中煙100品種的青枯病菌菌株，B2群包括2個(gè)來自駐馬店確山縣瓦崗鎮(zhèn)云煙87品種的青枯病菌菌株。以上聚類分析結(jié)果表明，10個(gè)供試煙草青枯病菌菌株中不同地理來源的菌株之間存在著明顯的遺傳差異，相同地理來源的菌株之間存在著遺傳相似性。

圖3　煙草青枯病菌的RAPD聚類分析樹狀圖Fig.3　Dendrogram based on RAPD analysis of R. solanacearum from tobacco

3　討論

關(guān)于青枯菌致病力分化的研究，大多數(shù)研究者都采用了鑒別寄主植物的方法來研究其致病力差異[9-12]，但他們均沒有對(duì)不同致病力的青枯菌在寄主植物體內(nèi)的繁殖情況進(jìn)行定量分析。本研究通過人工接種試驗(yàn)，將豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病力分為強(qiáng)、中、弱3種類型，其中強(qiáng)致病力菌株的寄主煙草品種以云煙87為主，中等致病力菌株的寄主煙草品種以中煙100為主，這可能是導(dǎo)致青枯菌菌株之間致病力差異的主要原因。同時(shí)，本研究還首次表明，青枯菌的致病力差異與其在寄主體內(nèi)的繁殖量呈明顯的正相關(guān)性。

目前應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)如RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）[9,13-14]、RFLP[15]、MLST（多位點(diǎn)序列分型）等[16]分子標(biāo)記從基因水平上來研究不同青枯菌菌株間的DNA多態(tài)性的報(bào)道還比較少。本研究首次對(duì)豫南煙區(qū)煙草青枯病菌進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果表明，供試煙草青枯菌菌株的DNA有著豐富的遺傳多態(tài)性，且不同地理來源的青枯菌菌株之間存在著明顯的遺傳差異，但這種遺傳差異與菌株的致病性之間無明顯相關(guān)性，這與前人研究結(jié)果基本一致[9,12-13]。因此，關(guān)于豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的致病性與遺傳多樣性的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

值得注意的是，豫南煙區(qū)為河南省煙草青枯病首次發(fā)現(xiàn)的新病區(qū)，且青枯菌的寄主品種中煙100為河南省的主栽品種，這就增加了青枯病在河南省范圍內(nèi)的傳播機(jī)會(huì)，因此，為防止煙草青枯病在河南省其他各主產(chǎn)煙區(qū)的擴(kuò)大危害，要盡量避免地區(qū)間的煙苗運(yùn)輸和跨地區(qū)田間操作。

4　結(jié)論

對(duì)豫南煙區(qū)煙草青枯病菌進(jìn)行了致病力和遺傳多樣性分析，明確了煙草青枯病菌的致病力差異。RAPD分析結(jié)果表明，不同地理來源的青枯菌菌株之間存在著明顯的遺傳差異，但這種遺傳差異與菌株的致病性之間無明顯相關(guān)性。研究結(jié)果為河南省煙草青枯病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及防治提供了依據(jù)。

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Analysis of Pathogenicity and Genetic Diversity of Ralstonia Solanacearum on Tobacco in Southern Henan Province

LI Xiaojie,LI Shujun*,CHEN Yuguo,WANG Haitao,LI Chengjun,ZHAO Fengxia,LI Yanping
(Tobacco Research Institute of HenanAcademy ofAgricultural Sciences,Xuchang,Henan 461000,China)

In order to take effective measures to control tobacco bacterial wilt in Henan Province,the pathogenicity and genetic diversity of Ralstonia solanacearum from tobacco in Luoshan,Queshan and Suiping counties of Henan Province were investigated. The results showed that all the isolates could be divided into three pathogenic types including strong,medium and week pathogenicity by artificial inoculation.Also,the R.solanacearum strains from different hosts showed significant difference in pathogenicity.Eight primers which were screened from 100 primers were used in RAPD analysis of R.solanacearum Isolates.A total of 720 bands were obtained and 88.9%of them were polymorphic.Based on clustering and similarity analysis,the tested isolates fell into two groups and the genetic similarity among different strains was from 0.49 to 1.00.Moreover,the genetic similarity might be related to different geographical origin.In summary,the R.solanacearum isolates infecting tobacco in southern Henan Province showed obvious differentiation of pathogenicity with abundant genetic diversity.

tobacco area in southen Henan province;tobacco bacterial wilt;differentiation of pathogenicity;genetic diversity

S435.72

1007-5119（2016）03-0062-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.011

河南省煙草公司科技項(xiàng)目“河南省煙草青枯病的病原鑒定及防控技術(shù)研究”（HYKJ201407）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目“豫南煙區(qū)煙草青枯病菌的種群分析及與寄主互作機(jī)理研究”（152300410142）

李小杰（1983-），女，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)闊煵葜脖?。E-mail：lixiaojie000631@sina.com

，E-mail：13603749396@126.com

2015-11-12

2016-01-20