劉海偉,路玫,曹大明,于冬冬,滕迎春(.湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430065;.河南中醫(yī)學院,鄭州 450046)

針灸對環(huán)磷酰胺化療小鼠血清中IL-7和IL-18含量的影響

劉海偉1,路玫2,曹大明2,于冬冬1,滕迎春1
(1.湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430065;2.河南中醫(yī)學院,鄭州 450046)

目的通過觀察針灸治療前后環(huán)磷酰胺(CTX)化療模型小鼠血清中白介素-7(IL-7)和白介素-18(IL-18)含量的變化,探討針灸改善化療后所導致免疫抑制的分子生物學機制。方法選用清潔級昆明種雄性小鼠80只,按體重隨機分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組,每組20只。除空白組外,其余各組均腹腔注射CTX制備小鼠骨髓抑制模型。針刺組和艾灸組選取大椎、膈俞、腎俞、足三里進行針刺和艾灸治療,空白組、模型組每日陪同抓取和固定,不做任何治療。依次經(jīng)過治療后3 d和5 d,在每組中分兩次分別處死10只小鼠,摘眼球取血,采用ELISA法檢測血清中IL-7和IL-18的含量。結(jié)果治療3 d至5 d,針刺組和艾灸組白細胞均開始回升,且針刺組療效優(yōu)于艾灸組;在3 d組和5 d組中,針刺組和艾灸組血清中IL-7含量均高于模型組(P＜0.05),且針刺組療效優(yōu)于艾灸組(P＜0.05);在3 d組和5 d組中,針刺組和艾灸組血清中IL-18含量均高于模型組(P＜0.05),且在5 d組中,針刺組療效優(yōu)于艾灸組(P＜0.05)。結(jié)論針刺和艾灸可以明顯上調(diào)CTX化療小鼠血清中IL-7、IL-18的含量,減輕CTX引起的免疫抑制,提高機體的免疫功能。

針灸療法;白細胞介素7;白細胞介素18;環(huán)磷酰胺;免疫;小鼠

[Abstract]ObjectiveTodiscuss the molecular biological mechanismof acupuncture and moxibustion inimproving immunosuppression due to chemotherapy,by observing the effect of acupuncture and moxibustion on the serum contents of interleukin(IL)-7 and IL-18 in m ice undergone chemotherapy with Cyclophosphamide(CTX).M ethodEighty SPF male Kunm ing ricewere random ized into ablank controlgroup,amodel group,an acupuncturegroup,and amoxibustion group according to the weight,20 m ice in each group.A ll of the groups except the blank control received intraperitoneal injection with CTX to prepare themousemodel ofmyelosuppression.The acupuncture group and moxibustion group respectively received acupuncture andmoxibustion intervention at Dazhui(GV14),Geshu(BL17),Shenshu(BL23)and Zusanli(ST36),while the blank control group and model group were only treated with grasping and fixing.Respectively after 3-day and 5-day interventions,10mice from each group were sacrificed each time to collect blood via removing eyeballs,and the enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)was used to exam ine the serum contents of IL-7 and IL-18.ResultAfter 3-day and 5-day interventions,the white blood cells increased in both acupunctureandmoxibustion groups,and the efficacy of theacupuncture groupwasmore significant than that of the moxibustion group;despite 3-day intervention or 5-day intervention,the serum contents of IL-7 in both acupuncture andmoxibustion groupswere significantly higher than that in themodel group(P＜0.05),and the efficacy of the acupuncture group wasmore significant than that of themoxibustion group(P＜0.05);after 3-day and 5-day interventions,the serum contents of IL-18 in both acupunctureandmoxibustion groupswere significantly higher than that in themodel group(P＜0.05),and theefficacy of the acupuncture group wasmore significant than thatof themoxibustion group after 5-day intervention(P＜0.05).Conclusion Acupuncture and moxibustion can significantly up-regulate the serum contents of IL-7 and IL-18 in m ice undergone CTX chemotherapy,m itigate immunosuppression caused by CTX,and improve immune function of thebody.

[Key w ords]Acupuncture-moxibustion;IL-7;IL-18;CTX;Immune;Mice

烷化劑環(huán)磷酰胺(Cyc lophosphamide,CTX)為廣譜抗腫瘤藥物之一,在臨床中常用于惡性腫瘤的藥物治療,由于其特異性選擇不高,在殺傷腫瘤細胞的同時,也可對機體的正常細胞造成破壞,產(chǎn)生免疫抑制,造成機體免疫力低下,最終導致化療失敗。本實驗研究通過腹腔注射CTX制備小鼠骨髓抑制模型,觀察CTX化療小鼠血清中IL-7、IL-18的含量為評價指標。為針灸大椎、膈俞、腎俞、足三里緩解惡性腫瘤患者應用CTX藥物治療所致的免疫抑制提供科學的理論依據(jù)和實驗依據(jù),探討針灸增強CTX小鼠免疫功能的作用和機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

80只雄性清潔級昆明種(KM)小鼠,體重(20±2)g,按清潔級進行飼養(yǎng),由鄭州大學醫(yī)學院提供,實驗動物使用許可證號為SCXK(豫)2010-0002。

1.2主要實驗儀器

超凈工作臺、薄片離心機SHANDON、電子天平、小鼠固定板(自制)、鼠夾、華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn))、特制美容艾條(河南南陽臥龍艾絨廠生產(chǎn))等。

1.3實驗試劑

環(huán)磷酰胺注射液(山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號為04120501);生理鹽水注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司,批號為120412107);小鼠IL-7檢測試劑盒(河南華豫教學實驗儀器用品營銷部提供,批號為CK-E20125M);小鼠IL-18檢測試劑盒(河南華豫教學實驗儀器用品營銷部提供,批號為CK-E11385M);過氧化物酶(HRP);四甲基聯(lián)苯胺(TMB);冰乙酸溶液;蒸餾水。

1.4動物分組

取80只雄性KM小鼠,按體重編號后用隨機數(shù)字表隨機分出空白組20只,其余統(tǒng)一造模后,再用上述方法分為模型組、針刺組、艾灸組,每組20只。

1.5造模

參照《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》(中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局編)的造模方法[1],腹腔注射CTX 100 mg/kg/d(即依據(jù)小鼠體重0.02 mL/g用藥量,腹腔注射濃度為5 mg/mLCTX溶液),分別在首次注射藥物的24 h、48 h再次注射CTX溶液,連續(xù)3 d,停藥后4 h造模成功(依據(jù)CTX藥代動力學過程,4 h后即失去活性)[2]?？瞻捉M小鼠腹腔注射同等劑量的0.9%生理鹽水,連續(xù)3 d。

1.6選穴及治療方法

選取大椎、膈俞、腎俞、足三里。小鼠穴位定位參考《中國獸醫(yī)針灸學》,并模擬大鼠穴位定位法,大椎位于背部正中,第7頸椎與第1胸椎之間;膈俞位于第7胸椎下兩旁,肋間,左右各分布一穴;腎俞在第2腰椎下兩旁,左右各分布一穴;足三里位于小鼠后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處,左右各分布一穴。

針刺組:按照各組造模時間的先后順序,在造模完成(第3次小鼠腹腔注射CTX)4 h后針刺治療,各組小鼠配對同時進行操作。用華佗牌美容毫針,采用管式進針法直刺,進針深度為3 mm,留針6 min。每日1次。

艾灸組:按照各組造模時間的先后順序,在造模完成4 h后開始艾灸治療,各組小鼠配對同時進行。用美容細艾條點燃后,在距離穴位皮膚2 cm處固定懸灸3 min。每日1次。

空白組和模型組:每日陪同針刺組、艾灸組抓取和固定,不做任何治療。

各組連續(xù)治療5 d。

1.7觀察指標及方法

1.7.1取材方法

從首次CTX造模第1天起,每天在相同時間固定專人對各組小鼠進行割尾靜脈采血,每只取10mL,分別滴入事先預備好的390mL3%冰乙酸稀釋液試管中,將試管中的血樣本搖勻后,用玻璃棒蘸取少量血樣本從蓋玻片邊緣滴入細胞計數(shù)板上,人工鏡檢外周血白細胞總數(shù)。在造模成功后,每天相同時間進行針刺或艾灸治療,治療3 d后,次日以頸椎脫臼法隨機處死每組10只小鼠,摘其眼球,取血液于凍存管中,置于3500 r/min的離心機中離心10 min,用移液器取上清液于EP管中,放置于﹣80冰箱中保存。治療5 d后,次日以頸椎脫臼法處死每組剩余10只小鼠,操作方法同上。

1.7.2ELISA法檢測CTX小鼠血清中IL-7和IL-18含量的表達

采用比色法測定血清中IL-7和IL-18的含量,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.8統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計采用單因素方差分析,按a=0.05標準進行檢驗,用Levene法進行方差齊性檢驗,若方差齊,兩兩比較采用LSD法;若方差不齊,兩兩比較采用Tamhane法。

2　結(jié)果

2.1針灸對CTX化療小鼠外周血白細胞計數(shù)動態(tài)變化的影響

表1結(jié)果顯示,小鼠腹腔注射CTX后第2天、第3天外周血白細胞逐漸下降,與空白組比較,模型組、針刺組、艾灸組白細胞均降低,有顯著性差異(P＜0.01);與模型組比較,針刺組、艾灸組白細胞計數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。表明化療藥物CTX具有明顯的抑制骨髓功能,損傷造血細胞的毒副反應。針刺、艾灸進行干預之后,與模型組比較,針刺組和艾灸組可使CTX化療小鼠白細胞提前1天回升(在第3天)并提前1天超過基礎水平(在第5天)。在第3天,針刺組與艾灸組均開始回升,針刺組療效優(yōu)于艾灸組,且針刺組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);尤其在第4～5天針刺組、艾灸組白細胞均明顯升高,表明針灸確有減輕CTX化療小鼠骨髓抑制,提升白細胞的作用。針刺與艾灸兩種方法比較無顯著性差異,但針刺療效優(yōu)于艾灸。表明針灸改善化療后骨髓抑制,升高白細胞的療效是確切的,其療效隨著治療次數(shù)的增加而增加,具有積極的治療意義。

表1　針灸對CTX化療小鼠外周血白細胞計數(shù)動態(tài)變化的影響(治療3 d以前n=20;治療3 d以后n=10)　(±s,109/L)

表1　針灸對CTX化療小鼠外周血白細胞計數(shù)動態(tài)變化的影響(治療3 d以前n=20;治療3 d以后n=10)　(±s,109/L)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別　　造模1 d　　造模2 d　　造模3 d　　治療1 d　　治療2 d　　治療3 d　　治療4 d　　治療5 d空白組　8.56±2.36　10.05±1.79　6.28±2.03　7.32±2.11　7.84±2.11　8.29±0.95　9.85±1.80　10.92±0.94模型組　6.48±1.97　5.14±2.361)　2.85±1.111)　1.41±0.561)　1.49±0.551)　0.76±0.291)　4.35±0.821)　7.70±1.57針刺組　6.86±3.57　4.35±1.601)　2.16±0.721)　1.28±0.311)　1.01±0.251)　2.48±2.271)2)　6.95±2.83　12.56±7.16艾灸組　7.01±1.60　4.51±0.731)　2.30±0.331)　1.14±0.261)　1.26±0.271)　2.01±0.361)　6.10±0.911)2)　11.50±3.30

由圖1動態(tài)變化折線圖分析可知,在治療第3天,針刺組和艾灸組白細胞計數(shù)均開始回升,在治療第5 天,針刺組和艾灸組白細胞計數(shù)回升高于空白組白細胞計數(shù),達到峰值。

圖1　針灸對CTX化療小鼠外周血白細胞計數(shù)動態(tài)變化折線圖(±s,109/L)

2.2針灸對CTX化療小鼠血清中IL-7含量的影響

表2結(jié)果顯示在實驗中治療3 d與治療5 d,空白組含量高于模型組,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明了烷化劑CTX具有免疫損傷和免疫抑制的毒副反應;針刺組在分別治療3 d和5 d后,IL-7含量均高于模型組,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明針刺治療可以提高CTX化療小鼠血清中IL-7的含量;艾灸組與模型組對比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明艾灸可以提高CTX化療小鼠血清中IL-7的含量;針刺組和艾灸組IL-7含量均高于模型組,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明對CTX小鼠進行針刺和艾灸治療后IL-7的含量均高于模型組;針刺組IL-7的含量高于艾灸組,經(jīng)過3 d 和5 d治療兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),并且通過本實驗證實,在提高IL-7含量的療效趨勢中,針刺的療效要優(yōu)于艾灸的療效。

表2　針刺與艾灸對CTX化療小鼠血清中IL-7含量的影響(±s,pg/mL)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P ＜0.05

組別　n　3 d組　5 d組空白組　10　104.27±7.74　109.39±8.15模型組　10　70.81±11.631)　70.44±5.101)針刺組　10　94.03±6.901)2)　86.65±4.061)2)艾灸組　10　80.56±4.231)　80.62±3.671)3)

2.3針刺與艾灸對CTX化療小鼠血清中IL-18含量的影響

表3　針刺與艾灸對CTX化療小鼠血清中IL-18含量的影響(±s,pg/mL)

表3　針刺與艾灸對CTX化療小鼠血清中IL-18含量的影響(±s,pg/mL)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P ＜0.05

組別　n　3 d組　5 d組空白組　10　82.55±13.78　96.58±8.75模型組　10　46.57±8.351)　41.69±12.021)針刺組　10　74.05±13.772)　91.29±9.102)艾灸組　10　69.01±9.411)3)　76.24±6.201)2)3)

3　討論

現(xiàn)代醫(yī)學惡性腫瘤治療方法中,化療為主要的手段和方法之一。化療藥物在靶向殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長和擴散的同時,在不同程度對正常細胞進行殺傷,繼而出現(xiàn)白細胞減少和骨髓抑制等毒副反應。烷化劑CTX作為主要的化療藥物之一,具有抑制機體骨髓功能、減少白細胞數(shù)量的毒副反應。中醫(yī)學中將“骨髓抑制”“白細胞減少”等歸入“虛勞”范疇。多由機體正氣不足,復感化療外來“毒邪”,傷及正氣,導致氣血化源不足,肝腎精血虧虛,“毒邪”與氣血搏擊,臟腑氣血失調(diào),而發(fā)為本病。

本實驗穴組根據(jù)“虛則補之”“勞則溫之”的原則,選取大椎、膈俞、腎俞、足三里,通過針刺與艾灸,以達調(diào)補氣血、健脾益腎、填精益髓之功效。大椎位于督脈,為諸陽之會,可振奮機體陽氣;膈俞為背部腧穴,為血之會,具有理氣養(yǎng)血、活血化瘀之功效;腎俞為背俞穴,具有補益腎氣、滋陰養(yǎng)腎、填精益髓之功效;足三里為胃之下合穴,具有調(diào)理脾胃、補益氣血之功效[3]。四穴合用,不僅補益先天之本,還可補益后天之本,具有補血活血、溫通陽氣、通而不滯的作用[4]。

白細胞介素-7(IL-7)是由骨髓基質(zhì)細胞、胸腺基質(zhì)細胞和脾細胞所產(chǎn)生的細胞因子,其主要功能為刺激免疫細胞T細胞、B細胞前體細胞生長,能促進骨髓組織的生成[5],具有廣泛的免疫效應[6]。IL-7具有抗腫瘤免疫反應調(diào)節(jié)作用[7]。潘德順等[8]研究發(fā)現(xiàn),IL-7基因轉(zhuǎn)染人舌鱗癌細胞株,具有明顯的抑瘤作用,機制可能為IL-7降低腫瘤細胞產(chǎn)生的抑制免疫因子,增強NK細胞的活性,并促進淋巴細胞增殖。鐘惠珍等[9]研究證實,IL-7在腹水中的含量要高于血清,并且IL-7具有抗腫瘤作用。本實驗研究結(jié)果證實,CTX化療小鼠血清中IL-7的含量在3 d組和5 d組中,空白組IL-7含量均高于模型組,說明烷化劑CTX對小鼠的免疫細胞T細胞、B細胞有抑制作用,從而抑制其免疫功能。針刺組和艾灸組IL-7的含量在3 d組和5 d組中均高于模型組,表明經(jīng)過針刺和艾灸治療后,可以不同程度地解除CTX對小鼠的免疫細胞T細胞、B細胞的抑制作用和對免疫效應及功能的影響。同時,3 d組和5 d組研究結(jié)果證實,針刺組療效優(yōu)于艾灸組。說明經(jīng)過針刺和艾灸治療后,均可以提高血清IL-7的含量及促進抗腫瘤免疫功能,但是針刺的療效要明顯優(yōu)于艾灸的療效。

白細胞介素-18(IL-18)為巨噬細胞、DC、角質(zhì)細胞所產(chǎn)生的細胞因子,其主要功能為促進Th1分化、刺激T細胞產(chǎn)生干擾素、增強NK細胞活性[10]。近年來研究結(jié)果顯示,IL-18具有抑制腫瘤血管生成和腫瘤的發(fā)生作用[11],還具有抗腫瘤免疫方面的重要價值[12]。徐玢等[13]研究發(fā)現(xiàn)IL-18有顯著抗白血病作用,其基因可修飾瘤苗。IL-18促進Th1細胞發(fā)育,產(chǎn)生抗腫瘤效應[14]。IL-18在小鼠實體瘤均具有顯著抗腫瘤免疫效應[15]。徐英萍等[16]研究證實,IL-18基因修飾的腫瘤細胞,可增強機體的抗腫瘤免疫反應。本實驗研究結(jié)果證實,CTX化療小鼠血清中IL-18的含量在3 d組和5 d組中,空白組IL-18含量均高于模型組,說明烷化劑CTX對小鼠有抑制免疫細胞活性的作用,從而抑制其免疫功能。針刺組和艾灸組IL-18的含量在3 d組和5 d組中均高于模型組,表明經(jīng)過針刺和艾灸治療后,可以不同程度地解除CTX對小鼠的免疫細胞活性的抑制作用和對免疫效應及功能的影響。同時,經(jīng)過針刺和艾灸治療后,還可以提高抗腫瘤的免疫效應。研究結(jié)果證實,在5 d組CTX化療小鼠血清中IL-18的含量比較,針刺組療效優(yōu)于艾灸組。說明經(jīng)過針刺和艾灸治療后,均可以促進免疫功能的恢復。且隨著治療時間的累積,針刺的療效明顯優(yōu)于艾灸。

綜上所述,通過對CTX化療小鼠進行針刺和艾灸干預后,均可以提高CTX化療小鼠血清中IL-7和IL-18的含量,進而可以緩解被CTX所致的免疫抑制,同時,還可以促進免疫細胞的生長,促使其免疫活性的發(fā)揮,促進免疫功能和免疫效應的發(fā)揮,在一定程度可以提高抗腫瘤的免疫效應。因此,針刺和艾灸治療可以提高烷化劑CTX化療所致的毒副反應,提高化療的成功率和腫瘤患者的生存質(zhì)量。

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Effect of Acupuncture and Moxibustion on Serum IL-7 and IL-18 Contents in Mice Undergone Chemotherapy with

LIU Hai-wei1,LU Mei2,CAO Da-ming2,YU Dong-dong1,TENG Ying-chun1.1.HubeiUniversity ofChinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.Henan University ofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou 450046,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0223

1005-0957(2016)02-0223-04Cyclophospham ide

國家自然科學基金項目(81072884)

劉海偉(1984-),男,2013級博士生

路玫(1958-),女,教授

2015-05-12