萬鈺茜,陳梁,沈衛(wèi)東(.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 003;.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 003)

針刺對Y123F雄性肥胖小鼠糖脂代謝及瘦素的影響

萬鈺茜1,陳梁1,沈衛(wèi)東2
(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203)

目的探討針刺干預(yù)對Y123F雄性肥胖小鼠的體重、糖脂代謝及肝臟的影響。方法將11只小鼠隨機(jī)分為兩組,實驗組6只,對照組5只,實驗組選取中脘和雙側(cè)后三里穴進(jìn)行13 d的針刺干預(yù),對照組與實驗組以同樣的方式固定,但不針刺。結(jié)果實驗組小鼠的體重、血糖、血清瘦素水平與對照組比較,均有顯著性差異(P＜0.05);而高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)以及總膽固醇(TC)水平與對照組比較,則無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論針刺干預(yù)能夠有效改善Y123F雄性小鼠的肥胖程度、高血糖、血清高瘦素水平,并改善肝臟質(zhì)量,但對小鼠脂代謝并無明顯改善。

Y123F小鼠;瘦素;肥胖;針刺;糖脂代謝

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture intervention on body weight,glycolipid metabolism and the liver inmale obese Y123Fmice.M ethodElevenm icewere random ized into two groups,an experiment group of 6mice and a control group of 5m ice.In the experimentgroup,point Zhongwan(CV12)and bilateralpoints Housanli(ST36)were given 13 days of acupuncture intervention.In the control group,m ice were fastened in the same way as in the experiment group but not given acupuncture.ResultTherewere statistically significant differences in body weight,and blood sugar and serum leptin levels(P＜0.05)but no statistically significant differences in high density lipoprotein(HDL-C),low density lipoprotein(LDL-C)and triglyceride(TG)(P＞0.05)between the experiment and control groups.ConclusionAcupuncture intervention can effectively reduce the degree of obesity and high blood sugar and serum leptin levels and improve liver quality but notmarkedly ameliorate lipidmetabolism inmaleY123Fm ice.

[Keywords]Y123Fm ice;Leptin;Obesity;Acupuncture;Glycolipidmetabolism

隨著肥胖人群的日趨增多,胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓等多種肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)病率逐年升高,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,肥胖者發(fā)病死亡率遠(yuǎn)高于正常體重患者[1],因此肥胖已成為近年醫(yī)學(xué)界研究的熱點。針灸作為一種傳統(tǒng)的治療方法,在對肥胖及其伴隨癥狀的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[2-5],針灸減肥作用機(jī)制很多,如中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)、體液調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等[6-9],其中中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制是目前的研究熱點。主流思想認(rèn)為,針刺對肥胖機(jī)體作用主要通過對神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的調(diào)整,減少能量的攝入,增加能量的消耗,糾正代謝異常及失衡狀態(tài),從而達(dá)到減肥的目的[10]。Y123F小鼠是中科院營養(yǎng)所劉勇研究組利用基因敲入技術(shù),將瘦素受體基因中,三個酪氨酸(Y)位點985、1077和1138位突變?yōu)楸奖彼?F),該小鼠表現(xiàn)為血清高瘦素水平,血糖、血脂高及脂肪肝癥狀,成年后肥胖和生殖功能異常[11]。本實驗以Y123F雄性成年肥胖小鼠為動物模型,選取中脘和雙側(cè)后三里穴進(jìn)行13 d的針刺干預(yù),觀察針刺干預(yù)后小鼠的體重,糖脂代謝,血清瘦素水平以及肝臟組織的變化,探討針刺對糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用以及對瘦素水平的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

采用基因敲入技術(shù),將C57BL小鼠瘦素受體Ob-Rb的胞內(nèi)端985、1077和1138位的三個酪氨酸(Y)都突變?yōu)楸奖彼?F),培育出品系為Y123F的瘦素受體點突變小鼠模型,純合子雄性成年小鼠,野生型小鼠選取相同周齡成年C57BL/6雄性小鼠,由上海市計劃生育科學(xué)研究所施惠娟課題組提供。飼養(yǎng)溫度(23±3)℃,濕度(35±5)%。晝夜12 h進(jìn)行循環(huán),早晨6:30為亮燈時間,飼養(yǎng)用食物為符合國際標(biāo)準(zhǔn)的普通食物,購于上海普路騰生物科技有限公司。所有小鼠實驗操作均遵循Insti tutional Animal Care以及Use Commit tee of the Inst itute for Nut ri tional Sciences有關(guān)細(xì)則。

1.2器械

一次性無菌針灸針(0.18 mm×13 mm)。

1.3儀器設(shè)備

ZHWY-211 Incubator Shaker(Hangzhou Chincan Trading Co.,Ltd.);MK3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司];移液器(上海華運(yùn)分析儀器有限公司);電子計重天平(上海友中衡電子有限公司);電子天平儀器(普力斯特/PTY-A60)。

1.4試劑

葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);人甘油三酯(TG)ELISA試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司);人高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒(上海拜力生物科技有限公司);人低密度脂蛋白(LDL) ELISA檢測試劑盒[卡邁舒生物技術(shù)(上海)有限公司];人總膽固醇(TC)ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司);瘦素檢測試劑盒(上海睿廷生物科技有限公司)。

1.5實驗方法

將11只純合子小鼠隨機(jī)分為兩組,實驗組6只,對照組5只。針刺時間固定在每日中午13:00—16:00,由專人操作。

將實驗組小鼠放入自制的小鼠固定器中,用75%乙醇棉球消毒后,采用直徑0.18mm針灸針直刺雙側(cè)后三里穴3 mm,中脘穴3 mm,由固定的實驗員行針,以小鼠胡須輕微抖動為宜,每隔1min行針1次,每次1min,每穴刺激時間為10 min,每日1次,連續(xù)治療13 d。

對照組小鼠采取同樣的方式每日固定10 min。環(huán)境溫度控制在25～30℃,所有小鼠均采用同樣的飼料喂養(yǎng),自由攝食和飲水。

1.6指標(biāo)檢測

實驗過程中,每天更換小鼠的食物和水,記錄小鼠的飲食和飲水量,每日13:00記錄小鼠的體重。實驗結(jié)束后第2天小鼠斷食6 h,眼眶取血,4℃放置過夜,分離血清與血漿,采用酶聯(lián)檢測法,測定血清中葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂蛋白及瘦素含量。

1.7肝臟組織的HE染色

1.7.1肝臟的固定與石蠟切片

取小鼠肝臟組織塊(約200 mg)在10%中性福爾馬林中固定過夜后,在濃度由低到高的一系列乙醇溶液中逐漸脫去組織中的水分。再將組織塊置于二甲苯中替換出其中的乙醇。加熱石蠟塊,將已經(jīng)透明的組織塊置于已經(jīng)融化的石蠟中,放入融蠟箱中保溫,待石蠟完全侵入組織塊。準(zhǔn)備組織包埋容器,倒入已經(jīng)融化的石蠟,迅速夾取已經(jīng)浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻后,凝固成塊即可。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上,切成8mm厚薄片,漂在熱水中燙平后,貼到載玻片上,置于45℃烘箱中烘干。

1.7.2石蠟切片的HE染色

上述制作好的石蠟切片在二甲苯中脫蠟5～10 min,移入二甲苯和純乙醇(1:1)混合液中5 min,再依次經(jīng)過100%、95%、85%、70%各級乙醇,分別放置2～5 min,最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。蘇木精染液染色5～15 min,水洗玻片上多余染液,0.5～1%鹽酸乙醇溶液(70%乙醇配制)分色片刻。鏡檢控制,直至細(xì)胞及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止,約數(shù)10秒鐘。流水沖洗15～30min,蒸餾水短洗。放入0.1～0.5%伊紅染液染色1～5min(每100mL染液中加入1～2滴冰醋酸)。然后依次經(jīng)過70%、85%、95%、100%的各級乙醇溶液脫水,分別放置2～3min(在95%以下濃度的乙醇溶液中伊紅易脫色,應(yīng)適當(dāng)縮短時間)。二甲苯透明2次,共約10 min。最后進(jìn)行封片,擦去切片周圍多余二甲苯,迅速滴加適量中性樹膠,再加蓋玻片封固。放置片刻后,于鏡下檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1針刺干預(yù)后小鼠體重變化

在為期13 d的針刺過程中,實驗組小鼠體重較對照組有明顯的下降。詳見表1。

表1各組干預(yù)后小鼠體重變化　(±s,g)

表1各組干預(yù)后小鼠體重變化　(±s,g)

注:與對照組比較1)P＜0.01

組別　n　　干預(yù)前　　干預(yù)后　　體重改變值實驗組　6　38.42±5.78　37.58±5.84　　﹣0.67±1.541)對照組　5　35.90±5.35　38.80±5.24　6.13±2.98

2.2針刺干預(yù)后小鼠血糖的變化

Y123F小鼠表現(xiàn)為高血糖狀態(tài),針刺后實驗組小鼠血糖降低,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與野生型相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2　各組干預(yù)后小鼠血糖的變化　(±s,mmol/L)

表2　各組干預(yù)后小鼠血糖的變化　(±s,mmol/L)

注:與對照組比較1)P＜0.05

組別　n　　血糖實驗組　6　4.43±1.951)對照組　5　8.69±2.79野生型　4　2.91±0.00

2.3針刺干預(yù)后小鼠血脂的變化

Y123F小鼠同時也表現(xiàn)為高血脂狀態(tài),針刺后實驗組小鼠高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3　各組干預(yù)后小鼠血脂的變化　(±s,mmol/L)

表3　各組干預(yù)后小鼠血脂的變化　(±s,mmol/L)

組別　　高密度脂蛋白 低密度脂蛋白　　總膽固醇　　甘油三酯實驗組　1.16±0.18　1.83±0.48　2.86±0.35　1.70±0.62對照組　1.33±0.35　1.85±0.44　3.20±0.52　1.10±0.20

2.4各組小鼠肝臟病理學(xué)變化

2.4.1肉眼觀察

實驗組小鼠肝臟肝色暗紅,邊緣鈍厚,質(zhì)地柔韌。對照組小鼠肝臟外觀與實驗組小鼠肝臟區(qū)別不大,體積增大,邊緣鈍厚,質(zhì)地變軟。

2.4.2光鏡觀察

實驗組小鼠可見零星脂肪空泡。對照組小鼠脂肪變細(xì)胞體積增大,胞漿內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的脂肪空泡,胞核被推向周邊,呈氣球樣變。詳見圖1、圖2。

圖1　實驗組光鏡下肝臟病理學(xué)變化(×100)

圖2　對照組光鏡下肝臟病理學(xué)變化(×100)

2.5針刺干預(yù)后小鼠血清瘦素水平的變化

成年 Y123F小鼠表現(xiàn)為血清高瘦素現(xiàn)象(hyper leptinemia),針刺干預(yù)后,Y123F小鼠的血清瘦素水平明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,兩組小鼠的血清瘦素水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。詳見表4。

表4　各組干預(yù)后小鼠血清瘦素水平的變化(±s,ng/mL)

表4　各組干預(yù)后小鼠血清瘦素水平的變化(±s,ng/mL)

注:與對照組比較1)P＜0.05;與野生型比較2)P＜0.001

組別　n　　瘦素實驗組　6　30.33±11.931)2)對照組　5　54.40±2.70野生型　4　0.19±0.08

3　討論

肥胖病也稱肥胖癥,是指人體攝食過多,而消耗能量的體力活動減少,使攝入的能量超過消耗的能量,過多的熱量在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹敬罅啃罘e起來,使脂肪組織的量異常增加,超過標(biāo)準(zhǔn)體重20%者,稱為肥胖[12]。據(jù)我國2004年10月衛(wèi)生部、科技部、國家統(tǒng)計局發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與健康現(xiàn)狀》[13]顯示,我國成人超重率為22.8%,肥胖率為7.1%,估計人數(shù)分為2.0億和6000多萬。1994年Zhang Y等[14]在小鼠中成功克隆了肥胖相關(guān)基因瘦素(OB),瘦素通過瘦素受體(Ob-R)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在糖脂代謝與能量代謝平衡中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。Ob-Rb是小鼠瘦素受體5種亞型中的一種,其胞內(nèi)端有3個重要的酪氨酸位點985、1077、1138,這3個酪氨酸位點的磷酸化在胞內(nèi)瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的作用[15-16]。Y123F小鼠是采用基因敲入技術(shù),將Ob-Rb的985、1077和1138位的3個酪氨酸(Y)都突變?yōu)楸奖彼?F),導(dǎo)致該小鼠下丘腦中的STAT3等酪氨酸依賴型信號傳導(dǎo)通路不能被激活,呈現(xiàn)出高瘦素現(xiàn)象,另外,Y123F小鼠還表現(xiàn)為一定程度的食欲亢盛,表現(xiàn)為成年后肥胖,血糖和血脂高。但與瘦素受體 Ob-Rb完全缺失的 db/db小鼠[17]相比,Y123F小鼠的肥胖程度和代謝紊亂程度較低,此外,Y123F小鼠與db/db小鼠一樣,都表現(xiàn)為雄性不育。因Y123F肥胖小鼠模型更接近人類的病理特征,所以是研究遺傳性肥胖的理想對象。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肥胖癥乃過食肥甘厚味,久坐少動,脾失健運(yùn),水濕停滯,聚濕成痰,痰濕流溢肌膚所致,其本質(zhì)是本虛標(biāo)實,以氣虛陽虛為本,以多痰多濕為標(biāo)。針灸作為中醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)治療手法,對于肥胖的治療已取得相當(dāng)有效的進(jìn)展,已有實驗[18]證明針灸減肥具有療效顯著、安全簡單、無毒副反應(yīng)的優(yōu)點?，F(xiàn)代研究表明針灸減肥的機(jī)制主要有神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用、胃腸調(diào)理功能、改善新陳代謝及改善內(nèi)分泌系統(tǒng)功能4個方面。中脘為胃之募穴,八會穴之一,腑會穴,是脾胃生化輸布的樞紐、營衛(wèi)氣血之源,且痰濕生于脾,腑以通為順,故刺中脘,可使三焦氣化,散布精微于五臟六腑,行氣化痰濕[19-21]。實驗研究[22]亦證實針刺中脘對胃腸功能有調(diào)整作用。足三里屬足陽明胃經(jīng)合穴,具有健脾和胃、利濕化痰的作用,針刺足三里可以起到抑制饑餓中樞、降低食欲、加快胃腸道蠕動的作用,改善肥胖狀態(tài)[23-24]。

本次實驗結(jié)果證明,針刺小鼠中脘及雙側(cè)后三里能夠有效地降低Y123F小鼠的體重、飲食量和血糖水平,針刺干預(yù)后實驗組小鼠與對照組小鼠相比,血糖差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但針刺干預(yù)后,總膽固醇(TC)含量、甘油三酯(TG)含量、低/高密度脂蛋白(LDL-C/HDL-C)含量,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外,針刺干預(yù)后,能顯著降低Y123F小鼠的血清高瘦素水平,并改善肝臟細(xì)胞質(zhì)量。

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Effectof Acupunctureon Glycolipid Metabolism and Leptin in Male Obese Y123FM ice

WAN Yu-qian1,CHEN Liang1,SHEN Wei-dong2.1.ShanghaiUniversity ofTraditional Chinese Medicine,Shanghai201203,China;2.ShanghaiUniversity ofTraditional ChineseMedicine Shuguang Hospital,Shanghai201203,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0214

1005-0957(2016)02-0214-04

上海中醫(yī)藥大學(xué)杏林團(tuán)隊培養(yǎng)計劃以及海外及港澳學(xué)者合作研究基金項目(81328005)

萬鈺茜(1989-),女,2012級碩士生

沈衛(wèi)東(1967-),男,教授,Emai l:shenweidong1018@ hotmai l.com

2015-05-20