劉從進(jìn)宋潔平毛應(yīng)啟梁王淵愷朱匯慶張光明劉興黨

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脛骨內(nèi)注射大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛模型的顯像研究

劉從進(jìn)1宋潔平2毛應(yīng)啟梁3王淵愷1朱匯慶1張光明1劉興黨1

【摘要】目的：探討脛骨內(nèi)注射法建立的大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型骨病灶的影像學(xué)確認(rèn)方法。方法：將Walker 256大鼠乳腺癌腹水瘤注射入Wistar大鼠脛骨腔內(nèi)，制作乳腺癌骨癌痛模型；以脛骨內(nèi)注射等量PBS溶液作為對(duì)照組。使用von-Frey法，測量大鼠后足機(jī)械痛覺閾值，觀察各組疼痛變化。對(duì)模型組和對(duì)照組進(jìn)行99mTc-MDP骨顯像和CT成像，觀察骨病灶的骨代謝變化及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：造模的第3～5天，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛大鼠的機(jī)械痛覺閾值較基礎(chǔ)值明顯下降（P ＜0.01），并持續(xù)下降83.2%左右，至第9天左右達(dá)到最痛（P ＜0.001），后下降曲線趨于緩慢變化。造模3～5天后，模型組機(jī)械痛覺閾值顯著低于對(duì)照組（P ＜0.01），這個(gè)差別持續(xù)增大至第9天左右。99mTc-MDP骨顯像顯示所有模型組大鼠脛骨種植腫瘤細(xì)胞處放射性攝取顯著高于對(duì)側(cè)，CT見造模側(cè)脛骨上段骨質(zhì)破壞，對(duì)側(cè)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見其他部位骨病灶存在。而對(duì)照組所有大鼠骨顯像示兩側(cè)脛骨放射性分布對(duì)稱，CT顯示兩側(cè)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論：脛骨內(nèi)注射法大鼠骨癌痛模型疼痛確切。99mTc-MDP骨顯像以及CT可以從骨代謝和骨結(jié)構(gòu)評(píng)估骨癌痛模型病灶的發(fā)生，是確認(rèn)此類骨轉(zhuǎn)移疼痛模型造模的成功較好的影像學(xué)方法。

【關(guān)鍵詞】骨癌痛模型；99mTc-MDP；骨顯像；X線計(jì)算機(jī)，體層攝影術(shù)；機(jī)械痛覺閾值

腫瘤骨轉(zhuǎn)移疼痛是影響晚期腫瘤患者生命質(zhì)量的重要因素，是臨床和研究中比較受到關(guān)注的方向之一［1-3］。使用合適穩(wěn)定的動(dòng)物模型是基礎(chǔ)研究的重要方法，以骨轉(zhuǎn)移疼痛為主要研究目的、通過向雌性大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞是比較成熟的造模方法［4-5］。臨床上核素骨顯像和CT在骨病灶檢出上具有各自的優(yōu)勢，本研究中核素骨顯像和CT在脛骨內(nèi)注射骨轉(zhuǎn)移模型中同樣具有顯像識(shí)別價(jià)值，有了更多的體內(nèi)顯像手段，有助于我們對(duì)模型制作進(jìn)行更直接的影像學(xué)評(píng)估。

方 法

1.材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性Wistar大鼠（體重70～-80g，140～160g），購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于12h/12h晝夜交替，室溫22±1℃環(huán)境中，自由攝食和飲水，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次行為實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練，以排除應(yīng)激干擾。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處理。32只大鼠隨機(jī)分2組：模型大鼠24只，對(duì)照組8只。

1.2腫瘤細(xì)胞來源：Walker256 大鼠乳腺癌細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3. 試劑/藥品：99mTc-MDP購買自上海欣科醫(yī)藥有限公司。

1.4. 儀器設(shè)備：SPECT/CT：SymbiaT16，Siemens， 美國

2.方法

2.1 動(dòng)物模型制作：參照文獻(xiàn)［5］培養(yǎng)獲得Walker256腹水瘤細(xì)胞。

大鼠使用10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，以大鼠腳趾對(duì)有齒鑷鉗夾無反應(yīng)為麻醉滿意指標(biāo)。微量進(jìn)樣器依次吸入：1μl空氣、2μl明膠海綿水溶液、lμl空氣、4μl腫瘤細(xì)胞或者PBS溶液（用于對(duì)照組）。酒精消毒待手術(shù)部位皮膚后，使用文獻(xiàn)中［5］的改良法，不暴露脛骨平臺(tái)，用7號(hào)針頭在右膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠(yuǎn)端鉆約1cm，然后將準(zhǔn)備好的微量進(jìn)樣器的內(nèi)容物注射入對(duì)應(yīng)的各組骨髓腔內(nèi)。最后均推入2μl凝膠海綿溶液封口。

2.2 von Frey機(jī)械痛覺超敏測定：大鼠置于不銹鋼鋼絲網(wǎng)底的特制有機(jī)玻璃盒子中，保持環(huán)境安靜，室溫21～23℃，讓大鼠適應(yīng)20min后，根據(jù)Dixon介紹的up-and-down法：將一系列von Frey細(xì)絲按照一定的順序刺激大鼠腳掌中部皮膚，觀察大鼠縮足反應(yīng)。大鼠對(duì)von Frey細(xì)絲的刺激有縮足動(dòng)作稱為陽性反應(yīng)，反之成為陰性反應(yīng)。刺激從2.0g開始，當(dāng)陽性反應(yīng)時(shí)，改用低一級(jí)刺激，當(dāng)陰性反應(yīng)時(shí)，改用高一級(jí)的刺激。從第一次陽性反應(yīng)后再測試5次，然后用軟件計(jì)算出50% von Frey反應(yīng)閾值作為機(jī)械性痛覺閾值。

2.399mTc-MDP骨顯像、CT掃描及圖像分析：造模后10d行99mTc-MDP骨顯像。大鼠10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉后，行尾靜脈給藥，每只大鼠1mCi的99mTc-MDP，2h后，再行腹腔麻醉，并將大鼠固定于硬紙板上，使用Siemens symbiat16 SPECT/CT行靜態(tài)骨掃描顯像。采集參數(shù)：Count：1000Kcts；zoom：1.23；Matrix-Size：256×256。采集結(jié)束后使用工作站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到可視的骨掃描顯像。觀察組件放射性攝取差異。在Image J （National Institute of Health，USA）軟件中使用ROI方法比較分析兩側(cè)后肢脛骨上段放射性計(jì)數(shù)。

骨顯像結(jié)束后即刻行CT掃描。使用SiemensSymbia T16 SPECT/CT的16排CT掃描，采集參數(shù)：120kV，100mAs。窗寬窗位設(shè)為骨窗。圖像分析：視覺觀察，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)破壞記為陽性，否則為陰性。

結(jié) 果

1.機(jī)械疼痛閾值

實(shí)驗(yàn)組大鼠的基礎(chǔ)痛覺閾值（BSL：造模前1周內(nèi)3次測痛結(jié)果平均值）右側(cè)為11.05±0.35g，左側(cè)為11.40±0.25g，對(duì)照組兩側(cè)基礎(chǔ)痛覺閾值分別為11.77±0.34g和11.63±0.13g，各組數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。模型組造模側(cè)（右側(cè)）肢體的疼痛隨后迅速加重，至第3天即明顯低于對(duì)側(cè)及對(duì)照組的左右側(cè)（P ＜0.01）。至第7～9天，疼痛基本達(dá)到最低水平位置，變化趨于穩(wěn)定，在第9天，痛覺閾值已降低至1.86±1.10g，下降了約83.2%。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)后肢雖沒有進(jìn)行造模手術(shù)，但觀察到與造模側(cè)同步的疼痛感覺變化，幅度上略好于造模側(cè)。對(duì)照組兩側(cè)后肢痛覺閾值隨著測痛次數(shù)的增加，出現(xiàn)輕微的下降，并在第13天時(shí)左側(cè)后肢有比基礎(chǔ)值統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的降低（P ＜0.05）。見圖1。

2.99mTc-MDP骨顯像

造模第10天使用西門子Symbia T16 SPECT進(jìn)行大鼠靜態(tài)顯像（圖2），圖像導(dǎo)出DICOM格式后用Image J計(jì)算右側(cè)與左側(cè)脛骨上段放射性攝取比值（R/L），對(duì)照組比值為：1.03±0.06，而模型組比值為：1.23±0.11，兩組均數(shù)比較P＜0.001。

3.CT骨形態(tài)及離體骨組織形態(tài)

造模第10天，使用西門子Symbia T16所帶CT對(duì)大鼠進(jìn)行X線斷層顯像，如圖3所示，模型組均見到造模側(cè)骨質(zhì)破壞，其中1只大鼠造模處見軟組織腫塊，而對(duì)側(cè)（左側(cè)）骨結(jié)構(gòu)未見異常。對(duì)照組兩側(cè)脛骨CT顯像均未見異常。第28天處死大鼠取離體脛骨，可見模型組造模脛骨色澤黯啞，表面不光滑，骨質(zhì)破壞，變脆易折斷。對(duì)照組脛骨色澤光亮，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)完整。

圖1 造模術(shù)后兩組大鼠左右后肢機(jī)械痛覺閾值變化。模型組造模側(cè)肢體機(jī)械痛覺閾值顯著下降，同時(shí)對(duì)側(cè)同步下降，出現(xiàn)鏡像疼痛。對(duì)照組隨著測痛次數(shù)增加，痛覺閾值略有下降。Model：實(shí)驗(yàn)組，Control：對(duì)照組。R：右側(cè)后肢（造模側(cè)），L：左側(cè)后肢。

圖299mTc-MDP骨顯像。 A.對(duì)照組，兩側(cè)脛骨放射性攝取基本對(duì)稱。B.模型組，右側(cè)脛骨放射性攝取顯著高于對(duì)側(cè)。

圖3 大鼠CT顯像及離體骨組織形態(tài)。A.對(duì)照組，CT見兩側(cè)脛骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，離體右脛骨見形態(tài)正常，骨表面光滑，色澤光亮。B.模型組，CT見右側(cè)脛骨骨質(zhì)破壞，左側(cè)正常；離體右側(cè)脛骨色澤黯啞，表面不光滑，骨質(zhì)破壞。

討 論

骨癌痛模型是研究腫瘤骨轉(zhuǎn)移疼痛的主要工具，目前造模包括心內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞、靜脈注射腫瘤細(xì)胞和脛骨內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞三種主要的方法。前兩種方法主要在裸鼠中開展，模型成功率較低，且容易引起其他臟器部位轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移灶位置不確切，模型動(dòng)物存活時(shí)間短等局限。脛骨內(nèi)注射相對(duì)前兩種方法在機(jī)制上不能完全代表血運(yùn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但其造模成功率高，轉(zhuǎn)移部位確切，誘發(fā)的轉(zhuǎn)移性疼痛顯著，且模型動(dòng)物存活時(shí)間較長［6-7］。對(duì)以疼痛為研究目的的研究具有非常高的價(jià)值。本試驗(yàn)中使用了毛應(yīng)啟梁等發(fā)表的改良造模方法，用7號(hào)針脛骨平臺(tái)經(jīng)皮鉆孔，避免暴露脛骨，減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模創(chuàng)傷。使用明膠封閉腫瘤細(xì)胞在微量注射器后進(jìn)行注射，有效防止腫瘤細(xì)胞在皮下骨外種植，本試驗(yàn)中僅1例大鼠造模處出現(xiàn)軟組織腫塊，造模時(shí)腫瘤細(xì)胞播撒或脛骨內(nèi)腫瘤擴(kuò)張至脛骨外可能。

在使用von Frey觀察大鼠后肢疼痛時(shí)，可以明確腫瘤骨轉(zhuǎn)移模型的疼痛發(fā)生，第7天后疼痛趨向穩(wěn)定。同時(shí)可以觀察到非造模側(cè)后肢疼痛伴隨發(fā)生，考慮認(rèn)為鏡像疼痛，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］，這種現(xiàn)象機(jī)制尚不清楚，體液機(jī)制認(rèn)為是體液內(nèi)炎癥因子致使對(duì)側(cè)脊髓神經(jīng)根的炎癥刺激反應(yīng)，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)里將對(duì)脊髓組織的炎癥因子進(jìn)行分析比較。對(duì)照組大鼠出現(xiàn)痛覺閾值輕微的降低，考慮認(rèn)為是反復(fù)von Frey纖維針刺激大鼠足底后引起的痛覺過敏。

99mTc-MDP骨顯像，在臨床中應(yīng)用廣泛，是腫瘤骨轉(zhuǎn)移診斷的重要手段。其對(duì)骨病灶高敏感性，能夠發(fā)現(xiàn)較早的骨轉(zhuǎn)移病灶，但特異性相對(duì)較差。本試驗(yàn)中使用臨床使用的SPECT/CT設(shè)備，在150g左右的大鼠顯像上，使用低能高分辨準(zhǔn)直器，顯像能力尚不能達(dá)到足夠清晰，使用針孔準(zhǔn)直器有可能改善圖像質(zhì)量［9］。西門子Symbia T16所帶CT為16排診斷級(jí)別CT，在大鼠斷層顯像中，能夠清晰顯示脛骨橫斷面的結(jié)構(gòu)，診斷骨質(zhì)破壞的結(jié)果與后續(xù)離體組織隨訪一致，診斷準(zhǔn)確性高。

近年來，micro-SPECT的應(yīng)用愈來愈廣泛，對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是非常有價(jià)值的設(shè)備。但很多基礎(chǔ)研究者對(duì)核醫(yī)學(xué)的相關(guān)設(shè)備和技術(shù)手段缺乏足夠的了解，較少有作者使用骨顯像的方法驗(yàn)證骨癌痛模型，故核醫(yī)學(xué)在輔助基礎(chǔ)研究中尚有很多可以拓展的空間。尤其是micro-SPECT/CT和micro-PET/CT等混合顯像設(shè)備，能夠從功能代謝以及微小解剖結(jié)構(gòu)上幫助研究者觀察活體內(nèi)的組織內(nèi)在變化。

參 考 文 獻(xiàn)

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Chin Comput Med Imag，2016，22：269-273

1 Department of Nuclear Medicine， Huashan Hospital of Fudan University

2 Department of Nuclear Medicine， Dongfang Hospital of Tongji University

3 Shanghai Medical College of Fudan University

Same contribution as the frst author： LIU Cong-jin，SONG Jie-ping

Address： 12 Wulumuqi Middle Rd， Shanghai 200040，P.R.C.

Address Correspondence to LIU Xing-dang （E-mail： xingdliu@yahoo.com）Foundation items： 1. Natural Science Foundation of China No. 81201113；2. Shanghai Municipal Commission of Health and Family Plan Youth Research Project No. 20124Y069

中圖分類號(hào)：R445.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-5741（2016）-03-0269-05

收稿時(shí)間：（2016.02.04；修回時(shí)間：2016.04.07）

作者單位：1 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科2 同濟(jì)大學(xué)大學(xué)附屬東方醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科3 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合系并列第一作者：劉從進(jìn)，宋潔平

通信地址：上海市烏魯木齊中路12號(hào)， 上海 200040

通信作者：劉興黨（電子郵箱：xingdliu@yahoo.com）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金 No. 81201113；上海市衛(wèi)計(jì)委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20124Y069）

Bone Imaging Study in Rat Bone Metastatic Pain Model via Tibia Injection

LIU Cong-jin1， SONG Jie-ping2， MAO Ying-qi-liang3， WANG Yuan-kai1，ZHU Hui-qing1， ZHANG Guang-ming1， LIU Xing-dang1

【Abstract】Purpose： To investigate the imaging methods to confirm bone lesions in rat bone metastatic pain model via tibia injection of breast cancer cells. Methods： Bone cancer pain model of breast cancer were made by injection of walker 256 mammary carcinoma cells cultured in ascites into Wistar rats' tibial cavity； The other group of rats were injected with equal volume of PBS solution into tibial cavity which was take as the control group. von-Frey method was used to measure the mechanical pain threshold of the rat back feet to observe the changes of pain in each group.99mTc-MDP bone imaging and CT imaging were performed in the model group and control group to observe the changes of bone metabolism and bone structure. Results： Three to fve days after the model was made，the mechanical pain threshold of the breast cancer bone metastasis pain rats model was decreased signifcantly when compared to the basic values （P ＜0.01）， and was continued to decline by about 83.2%， on 9th day the pain was reached the most heavy degree （P ＜0.001）， and after that the decline curve was changed slowly. Three to fve days after the model was made， the mechanical pain threshold in the model group was signifcantly lower than thatin the control group （P ＜0.01）. The difference was enlarged to the biggest while in the following 9 days. The results of99mTc-MDP bone scintigraphy showed that the location of tibia planted tumor cells in model group had signifcantly higher radioactivity than the contralateral tibia bone. CT scans showed bone destruction in the same side tibia. The bone structure of the other side of tibia was normal. While in the control group bone imaging showed that both sides of the tibia had similar radioactivity， and CT scans showed normal bone structure in both sides. Conclusion： Intratibia injection method of rat bone cancer model can arise exactly pain sites.99mTc-MDP bone scintigraphy and X-ray CT imaging can evaluate the occurrence of lesions of bone cancer pain from bone metabolism and bone structure.99mTc-MDP bone scintigraphy and X-ray CT imaging are suitable imaging methods to confrm such intratibia injection bone metastasis pain rat model..

【Key words】Bone cancer pain model；99mTc-MDP； Bone scintigraphy； X-ray computed，tomography； Mechanical pain threshold