張寶娜，張鵬鈺，王同朝，王 翔，尹 鈞，衛(wèi) 麗

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002）

普通小麥春化處理過(guò)程中wcor14a基因的表達(dá)分析

張寶娜1，張鵬鈺1，王同朝1，王 翔2，尹 鈞2，衛(wèi) 麗2

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002）

為進(jìn)一步完善普通小麥春化特性理論基礎(chǔ)，從不同春化特性小麥品種RNA-Seq結(jié)果中篩選得到一個(gè)春化誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的EST序列Unigene3230，經(jīng)NCBI比對(duì)與小麥wcor14a基因序列一致。為進(jìn)一步明確該基因在春化過(guò)程中的功能，利用熒光定量PCR分析了wcor14a基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，wcor14a基因能夠響應(yīng)低溫、ABA、干旱等非生物脅迫。對(duì)wcor14a基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種中的表達(dá)分析表明，該基因在不同發(fā)育特性小麥品種中的表達(dá)總體表現(xiàn)為春性＞半冬性＞冬性＞強(qiáng)冬性，而且表達(dá)時(shí)間表現(xiàn)為冬性和強(qiáng)冬性早于春性和半冬性。

小麥；非生物脅迫；春化；表達(dá)分析

小麥?zhǔn)呛幽鲜≈饕募Z作物，總產(chǎn)占全國(guó)的1/4，因而河南省小麥生產(chǎn)對(duì)我國(guó)糧食安全起了重要的作用。小麥的發(fā)育特性決定了其種植區(qū)域［1］。近年來(lái)，人們通過(guò)對(duì)擬南芥等植物開花調(diào)控機(jī)制的研究，提出了4種重要的開花途徑即自主開花途徑、光周期促進(jìn)途徑、春化途徑和赤霉素（GA）途徑［2］。日照長(zhǎng)短和溫度對(duì)植物的開花時(shí)間有著強(qiáng)烈的影響，而植物就是通過(guò)春化途徑和光周期途徑來(lái)分別感知和應(yīng)答溫度和光照的外界環(huán)境刺激［3-5］。我國(guó)麥區(qū)分布較廣，除春麥區(qū)外，冬麥區(qū)小麥品種發(fā)育特性的差異主要表現(xiàn)在對(duì)春化條件的要求有所不同［6-7］。春性小麥和冬性小麥在滿足春化發(fā)育條件后都表現(xiàn)出長(zhǎng)日促進(jìn)發(fā)育的特性［8］，導(dǎo)致很多優(yōu)良品種只能在特定的區(qū)域內(nèi)種植，造成品種利用的局限性。因此，如何改變小麥品種發(fā)育特性，擴(kuò)大品種利用范圍、提高品種利用效率是當(dāng)前亟須解決的重大科技問(wèn)題。

小麥春化發(fā)育特性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜生理過(guò)程［9］。尹均課題組先后擴(kuò)增和比對(duì)了普通小麥春化基因VRN-A1，VRN-B1、VRN-D1和VRN-A2、VRN-B2、VRN-D2的DNA和cDNA的序列差異，并進(jìn)一步明確了目前黃淮地區(qū)推廣品種VRN1和VRN2的基因組成［10-12］。就目前普通小麥春化基因研究結(jié)果看，只能區(qū)分出春性、冬性品種，但不能區(qū)分春性與強(qiáng)春、冬性和強(qiáng)冬性品種之間的基因型差異。因而需要挖掘新的春化相關(guān)基因與分子標(biāo)記，進(jìn)一步揭示春化作用的調(diào)控機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一個(gè)快速和直接研究基因本身的方法［13］。基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)［14-16］。為進(jìn)一步探索普通小麥春化基因?qū)π←湴l(fā)育的調(diào)控，明確不同發(fā)育特性小麥春化基因的基因型，尹均課題組通過(guò)I llumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)春性品種遼春10號(hào)、冬性品種京841春化和未春化處理的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中篩選出1個(gè)EST序列Unigene3230，經(jīng)比對(duì)分析該序列與小麥wcor14a基因序列一致。小麥wcor14基因是禾谷類植物中最典型的冷調(diào)節(jié)基因［17］，能夠響應(yīng)低溫、強(qiáng)光照，該基因編碼的蛋白WCOR14屬于LEA蛋白（Late embryo genesis abundant proteins，LEA proteins）的第Ⅱ亞類家族成員［18］，是小麥細(xì)胞葉綠體中的冷應(yīng)答蛋白。目前有關(guān)wcor14a基因只限于冷脅迫方面的研究，而春化處理過(guò)程中的表達(dá)鮮見報(bào)道。為此，本研究分析了wcor14a基因在不同春化發(fā)育特性的小麥春化過(guò)程中的表達(dá)特性，并分析了該基因在低溫、ABA、PEG、高鹽等非生物脅迫下的表達(dá)模式，以期深入探討wcor14a基因在小麥春化階段的功能，為進(jìn)一步完善小麥的春化機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試材料遼春10（LC10，春性）、豫麥49-198（Y49-198，半冬性）、京841（J841，冬性）和肥麥（FM，強(qiáng)冬性），均由國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心提供。挑取各品種大小均勻的種子，消毒后于25℃浸泡12 h，放置在25℃的培養(yǎng)箱萌動(dòng)后，各品種取適量移至培養(yǎng)皿放入4℃春化箱進(jìn)行低溫處理，分別于處理0，7，14，21，28，35，42，49 d取小麥葉片，經(jīng)液氮處理存放于-80℃冰箱備用。

非生物脅迫處理方法：取適量萌動(dòng)的J841種子，移入光照培養(yǎng)箱（25℃，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度350μmol/（m2·s））進(jìn)行培養(yǎng)，材料長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，分別進(jìn)行ABA（100μmol/L）、PEG 6000（20%）、NaCl（100μmol/L）和冷（4℃）處理。分別剪取上述處理后0，3，6，9，12，24，36，72 h的葉片，迅速用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱備用，每次取樣時(shí)間盡可能縮短以避免基因節(jié)律表達(dá)對(duì)表達(dá)分析結(jié)果的影響。

試驗(yàn)所用大腸桿菌菌株（E.coli）DH5α、pMD19-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均由TaKaRa（大連）試劑公司提供；所用引物自行設(shè)計(jì)及測(cè)序工作由英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行。

1.2 DNA、總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

取上述冷凍保存的小麥葉片材料，采用改良的CTAB法［19］提取小麥葉片基因組DNA，260/280 nm吸光值測(cè)定DNA濃度和純度，調(diào)整質(zhì)量濃度至100 ng/μL，用于目的基因的克隆。采用TRIzol（TaKaRa）試劑提取材料的總RNA。提取完成后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性；用便攜式紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260/280 nm吸光值確定其純度及濃度，測(cè)定其OD260、OD280值。1μg總RNA用于cDNA第1鏈的合成。

1.3 不同發(fā)育特性小麥品種wcor14a基因序列分析

根據(jù)Unigene 3230 cDNA的序列設(shè)計(jì)引物（Unigene3230F1：5′-ACTACTGACTCAGCTCCTCCACC-3′；Unigene3230R1：5′-CAGCCTATTCTAGCAACTTTTC G-3′），以不同發(fā)育特性小麥品種cDNA和J841 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，反應(yīng)體系均為20μL，包括：5 U/μL La Taq聚合酶0.2μL、10×LA PCR BufferⅡ2μL、10 mmoL/L的dNTP m ixture、10μmol/L引物各1μL和模板100μg，用ddH2O補(bǔ)齊至20μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 m in；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 m in，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 m in。連接轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后送往公司測(cè)序，利用DNAMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 熒光定量qRT-PCR

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，前引物：F2：5′-TGGGATGCCACCAAAGACG-3′，后引物R2：5′-CGCCAACTGAATAACTGATACGC-3′。以小麥看家基因β-Actin的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物βactin F：5′-TTTGAAGAGTCGGTGAAGGG-3′和β-actin R：5′-TTTCATACAGCAGGCAAGCA-3′。Real-time PCR反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Prem ix Ex Taq TMⅡ10μL、cDNA模板2μL、Real-time PCR Primers（10μmoL/L）1.6μL，加ddH2O至20μL。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，在60℃反應(yīng)步驟時(shí)收集熒光信號(hào)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)以校正PCR模板的拷貝數(shù)。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定每個(gè)基因相應(yīng)的Ct值，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果計(jì)算采用相對(duì)定量方法，相對(duì)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育特性小麥品種wcor14a基因序列分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的Unigene3230拼接序列的正確性，以該序列5′、3′端設(shè)計(jì)特異性引物，以J841 cDNA為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的特異片段，測(cè)序結(jié)果表明與Unigene3230拼接序列一致（圖1）。J841基因組Unigene3230序列與其cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因DNA為774 bp，cDNA為677 bp，開放閱讀框?yàn)?23 bp，編碼140個(gè)氨基酸，5′端UTR 42 bp，3′端UTR 212 bp，基因組序列中有1個(gè)97 bp的內(nèi)含子。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)，與小麥wcor14a基因（GB：AF207545.1）序列一致。

圖1 Unigene3230基因DAN及cDNA的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR am p lification of unigene3230 from DNA and cDNA level in w heat

圖2 不同發(fā)育特性小麥品種wcor14a基因序列比對(duì)Fig.2 Sequences alignm ent of wcor14a gene in wheat varieties w ith d ifferent developm ental characteristics

以不同發(fā)育特性小麥品種cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果表明，該基因在不同發(fā)育特性小麥品種中序列高度保守（圖2）。

2.2 非生物脅迫下小麥wcor14a基因的表達(dá)特性分析

由圖3可知，在ABA脅迫處理下，小麥wcor14a基因的表達(dá)量迅速上升，處理3 h時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的4.7倍，之后呈下降趨勢(shì)；6 h之后表達(dá)量均低于對(duì)照，處理6～72 h，對(duì)照表達(dá)量分別是ABA脅迫處理的2.7，3.6，10.1，7.0，10.6，5.4倍。由此可知，小麥wcor14a基因在ABA脅迫下呈負(fù)調(diào)控。高鹽處理下，0～6 h小麥wcor14a基因的表達(dá)與對(duì)照相差不大，9 h后隨著高鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，9，12，24，36，72 h表達(dá)量分別是對(duì)照組的62.8%，11.5%，8.6%，38.2%，25.8%，說(shuō)明隨著高鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥wcor14a基因表達(dá)受到抑制。在PEG處理下，小麥wcor14a基因的表達(dá)量0～6 h與對(duì)照相差不大，處理9，12 h對(duì)照表達(dá)量分別是PEG處理的1.95，0.65倍，處理24 h時(shí)小麥wcor14a基因的表達(dá)急劇下降，處理24，36，72 h對(duì)照表達(dá)量分別是PEG處理的5.3，5.7，1.7倍。由此可知，隨著PEG脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥wcor14a的表達(dá)受PEG脅迫抑制。低溫處理下，小麥wcor14a基因的表達(dá)呈逐漸上升的趨勢(shì)，處理12 h后隨低溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量降低。低溫脅迫處理36～72 h時(shí)，小麥wcor14a的表達(dá)量急劇降低，但相對(duì)表達(dá)量仍然是對(duì)照的56.9倍。由此可知，小麥wcor14a基因能夠響應(yīng)低溫脅迫。

圖3 不同非生物脅迫下小麥wcor14a基因的表達(dá)Fig.3 Exp ression patterns of w cor14a gene under d ifferen t abiotic stress

2.3 小麥wcor14a基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種中的表達(dá)特性分析

wcor14a基因在不同發(fā)育特性小麥品種春化處理過(guò)程中的表達(dá)如圖4所示。春化處理過(guò)程中，wcor14a基因在春性品種LC10中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，春化處理第28天達(dá)到最大值，隨后表達(dá)水平下降。而半冬性品種YM49-198在春化處理第35天達(dá)到最大值。在冬性品種J841和強(qiáng)冬性品種肥麥中，最大值出現(xiàn)在第21天，隨后下降。春性品種LC10號(hào)只在第28天出現(xiàn)一個(gè)峰值，其余3個(gè)冬性品種整體上基本呈先波動(dòng)上升后下降的趨勢(shì)。wcor14a基因在4個(gè)小麥品種中的表達(dá)量最大值總體表現(xiàn)為春性＞半冬性＞冬性＞強(qiáng)冬性。春性小麥遼春10號(hào)和半冬小麥豫麥49-198分別在第28，35天wcor14a基因表達(dá)量達(dá)到最大值，而在冬性京841和強(qiáng)冬性品種肥麥中，wcor14a基因在第21天表達(dá)量達(dá)到最大值，wcor14a基因在不同春化特性小麥品種中的表達(dá)時(shí)間上，表現(xiàn)為冬性和強(qiáng)冬性早于春性和半冬性。

圖4 w cor14a基因在不同發(fā)育特性小麥品種的表達(dá)Fig.4 Exp ression of wcor4a gene in wheat varieties w ith d ifferent developm ental characteristics under vernalization treatm ent

3 結(jié)論與討論

春化階段是小麥生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中一個(gè)重要階段，冬小麥必須經(jīng)過(guò)春化處理才能正常開花結(jié)實(shí)。小麥在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中，形成了較為完整的適應(yīng)低溫環(huán)境的機(jī)制。在低溫環(huán)境下，小麥由最初感受低溫區(qū)域通過(guò)各種復(fù)雜的信號(hào)途徑，將低溫信號(hào)逐級(jí)傳遞來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，最終引起細(xì)胞產(chǎn)生低溫響應(yīng)及生理生化的改變，使小麥適應(yīng)低溫環(huán)境［3］。春化作用與冷馴化都需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的低溫處理，但兩者對(duì)低溫和處理時(shí)間要求卻不相同［3，20-21］。研究表明，小麥wcor14a基因編碼COR蛋白（Cold-regulated proteins），該類蛋白是禾谷類中典型的冷調(diào)節(jié)蛋白［17］，能夠響應(yīng)低溫、強(qiáng)光照，是小麥細(xì)胞葉綠體中的冷應(yīng)答蛋白。研究表明，該家族蛋白與植物的逆境脅迫有關(guān)［12］。本試驗(yàn)中，小麥wcor14a在低溫脅迫下表達(dá)量上升，在低溫脅迫過(guò)程中，表達(dá)量明顯高于對(duì)照，與前人研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因?qū)Φ蜏氐拿舾行浴?/p>

本研究結(jié)果表明，小麥wcor14a基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種春化處理過(guò)程中的表達(dá)均呈拋物線狀，春性小麥、半冬性小麥分別在春化處理第28，35天wcor14a基因的表達(dá)達(dá)到最大值，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而在冬性和強(qiáng)冬性小麥春化處理過(guò)程中，均于第21天達(dá)到最大值，但總體來(lái)說(shuō)，wcor14a基因在春性、半冬性品種中的表達(dá)量高于冬性和強(qiáng)冬性品種，與VRN1在春性和冬性小麥品種中的表達(dá)趨勢(shì)相似。小麥春化發(fā)育受多基因的調(diào)控，其中VRN1是春化作用的關(guān)鍵基因［22-23］，小麥中還有耐冷（Freezing tolerance，F(xiàn)r）的QTL位點(diǎn)，如Fr1、Fr2等，F(xiàn)r1和VRN1是緊密連鎖的，F(xiàn)r1/VRN1在小麥低溫脅迫或春化過(guò)程中起重要作用［17］。有研究表明，在低溫脅迫處理下，F(xiàn)r1/VRN1調(diào)控CBF/DREB1的表達(dá)，CBF是小麥種參與冷馴化的轉(zhuǎn)錄因子，可以進(jìn)而促進(jìn)COR基因的表達(dá)［21，24］，進(jìn)一步闡明了在低溫脅迫處理下，COR基因的表達(dá)受多因子的調(diào)控，是多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果［25］。

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Expression Analysis of wcor14a Gene in Comm on W heat under Vernalization Treatm ent

ZHANG Baona1，ZHANG Pengyu1，WANG Tongchao1，WANG Xiang2，YIN Jun2，WEI Li2
（1.College of Agricultural Science，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.National Engineering Research Centre for Wheat，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

In order to study the theoretical basis of common wheatwith different vernalization characteristics，an EST Unigene3230 was discovered from high-throughput sequencing results from transcripts of wheat varieties with different vernalization characteristics，and its sequence is consistentwith wcor14a gene by sequence alignment from NCBI.In order to explore the functions of wcor14a in the process of vernalization，wcor14a expression patterns were analyzed using fluorescence quantitative RT-PCR under abiotic stress treatments.The result showed that wcor14a gene could response to low temperature，exogenous ABA，and drought stress treatments.What′smore，the expression patterns of wcor14a gene in wheat varieties with different vernalization characteristics were analyzed，and the result revealed that wcor14a gene was expressed in wheat varieties and the relative expression level was spring wheat＞semi-winter wheat＞winter wheat＞strong winter wheat，and the expression time of winter and strong winter wheat was earlier than spring and sem i-winter wheat.

Wheat；Stress；Vernalization；Expression analysis

S512.03；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0163-06

10.7668/hbnxb.2016.03.024

2016-03-20

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（132102110044）

張寶娜（1988-），女，河南杞縣人，在讀碩士，主要從事小麥生理生態(tài)研究。

衛(wèi) 麗（1966-），女，河南商丘人，研究員，博士，主要從事小麥發(fā)育分子調(diào)控研究。