張歲芳，朱 丹，馬 倩，侯麗霞，尹鵬飛，劉 新

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東青島 266109）

葡萄VvMSA基因的克隆及表達(dá)特性分析

張歲芳，朱 丹，馬 倩，侯麗霞，尹鵬飛，劉 新

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東青島 266109）

為了解VvMSA基因的功能，以抗性葡萄品種Vidal Blanc組培苗為試材，克隆得到VvMSA基因，對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用實時定量PCR分析了其組織表達(dá)特性和多種非生物脅迫和信號應(yīng)答表達(dá)特性。結(jié)果表明，VvMSA基因片段大小為450 bp，編碼149個氨基酸序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，VvMSA蛋白分子量約為16.703 kDa，等電點為5.68，不穩(wěn)定系數(shù)為41.71，推測為不穩(wěn)定蛋白。VvMSA含有65個氨基酸組成的ABA/WDS保守結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化上屬于單獨一個分支，它和已報道過的番茄LeASR1分別屬于同一個祖先進(jìn)化出的2個分支。實時熒光定量PCR分析顯示，VvMSA在葡萄不同組織中均有表達(dá)，花中表達(dá)量最高。多種逆境脅迫因子如鹽、干旱和低溫等能誘導(dǎo)VvMSA不同程度的上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫3 h時誘導(dǎo)表達(dá)量最高。同時，VvMSA受逆境脅迫信號分子NO和H2S不同程度誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，而SA則抑制VvMSA表達(dá)。激素ABA、GA3、IAA和ET均能不同程度誘導(dǎo)VvMSA表達(dá)上調(diào)，并且VvMSA鹽處理下的表達(dá)模式與ABA誘導(dǎo)的類似。綜合以上結(jié)果推斷VvMSA可能通過調(diào)控ABA信號途徑來調(diào)節(jié)葡萄對鹽脅迫應(yīng)答。

葡萄；VvMSA；基因克??；表達(dá)分析

葡萄（Vitis vinifera L.）屬于葡萄科葡萄屬，落葉藤本植物，其果實屬于漿果，葡萄皮薄而多汁，酸甜味美，營養(yǎng)豐富。葡萄漿果具有優(yōu)良的釀酒特性和較高的食用價值，此外，還可以制干、制汁、制罐頭等。我國的主栽葡萄品種為歐亞種，其抗逆性差。近年來由于葡萄基因組測序完成，利用分子生物學(xué)手段研究葡萄品質(zhì)、生長發(fā)育以及抗逆分子機理也成為焦點，如參與葡萄抵御低溫過程的VvIPK2［1］和VvBAP1［2］、葡萄灰霉病菌Flipper轉(zhuǎn)座子的研究［3］、VvFT/TFL在山葡萄開花中的表達(dá)［4］等。

ASR（Abscisic acid，stress，ripening-induced）基因是近年來植物中發(fā)現(xiàn)的一類受到脫落酸 （Abscisic acid，ABA）、逆境（干旱、鹽、冷害、有限光照等）以及成熟誘導(dǎo)的基因［5-7］。自Iusem等1993年首次從番茄中分離了番茄ASR1后，該基因作為植物應(yīng)答一系列脅迫的潛在關(guān)鍵調(diào)控子，開始被人們所關(guān)注［8-10］。隨后，陸續(xù)從番茄中得到了其他ASR基因序列。至今，已經(jīng)有很多雙子葉和單子葉植物ASR基因被克隆出來［11］，包括荔枝［12］、煙草［13］、大豆［14］、甘蔗［15］、葡萄［16］和香蕉［17］等，但其命名較為混亂，例如，在葡萄中命名為VvMSA，火炬松中命名為LP3。

研究表明，幾乎所有已知的ASR都包含2個高度保守的區(qū)域。第1區(qū)域是一個短的N端伸展結(jié)構(gòu)，含6～7個組氨酸殘基，可能構(gòu)成一個鋅結(jié)合位點，具體功能尚未研究透徹［18］；第2個區(qū)域是一個長的C端核定位信號區(qū)域［19］，對應(yīng)80個氨基酸。這個區(qū)域高度保守，含有1個ABA/WDS（Abscisicacid/water deficit stress）保守結(jié)構(gòu)域。且ASR蛋白分子量小，富含His、Glu和Lys，具有很強的親水性。不同物種中，ASR家族基因的數(shù)目具有較大差別，目前已知：玉米中有9個家族成員［20］，是已知成員數(shù)最多的物種。番茄中有5個成員［21］，香蕉中至少有4個成員［22］，而葡萄中只有1個成員［16］。但是，在模式植物擬南芥中，沒有ASR家族成員［23］。研究發(fā)現(xiàn)，同一個ASR家族的不同成員可在不同器官中表達(dá)，其表達(dá)特性有所差異。如：ASR在杏、甜瓜和柚的果實中表達(dá)［24］，在松樹根部、番茄、水稻和玉米的葉片、馬鈴薯塊莖以及百合花粉中表達(dá)［25］。番茄ASR1蛋白有類似于分子伴侶的活性［26］，對干旱脅迫敏感，而番茄ASR2蛋白則可能參與韌皮部伴胞細(xì)胞的新陳代謝［27］。但目前尚未系統(tǒng)研究葡萄中該基因的表達(dá)特性，探明葡萄ASR基因的組織表達(dá)特性和誘導(dǎo)表達(dá)特性，將為葡萄優(yōu)質(zhì)抗逆品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為葡萄抗性品種Vidal Blanc，使用其一年生枝條的新梢為供試外植體，經(jīng)外植體的消毒處理后接種于生根培養(yǎng)基上，于正常光照培養(yǎng)條件下獲得無菌組培苗，并通過擴繁獲得大量所需的植物試材，具體消毒和培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)［2］。

1.2 材料處理

取生長4周齡優(yōu)質(zhì)高抗葡萄品種Vidal Blanc的組培苗，分別用NaCl（150 mmol/L）、4℃、甘露醇（Mannitol 200 mmol/L）、水楊酸（Salicylic acid，SA 1 mmol/L）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）供體硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP 0.1 mmol/L）、硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）供體硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaHS 0.1 mmol/L）、過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O20.1%）、乙烯（Ethylene，ET）前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-am inocyclopropanecarboxylic acid，ACC 100μmol/L）、脫落酸（Abscisic acid，ABA 100μmol/L）、赤霉素（Gibberellin，GA3100μmol/L）、生長素（Auxin，IAA 50 mmol/L）處理，處理0，3，6，9，12，24 h后，取葉片液氮速凍用于提取總RNA，研究基因相對表達(dá)量［2］。

取Vidal Blanc盆栽苗一年生枝條的根、卷須、莖、幼葉、功能葉、花芽、花、幼果、轉(zhuǎn)色期果實和成熟果實，提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA。實時熒光定量PCR檢測VvMSA相對表達(dá)量變化，研究VvMSA基因組織表達(dá)特異性。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA合成 使用CTAB法提取葡萄總RNA［1］，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.2 VvMSA基因的克隆 根據(jù)品種白玉霓VvMSA同源序列，使用引物設(shè)計軟件（Primer 5.0）設(shè)計特異性引物：Sense：5′-GCTCTAGACTCTCTC GTTTCTACAGCTAATTTGATC-3′，包含XbaⅠ酶切位點（下劃線）Anti-sense：5′-GGGGTACCCTAGAAAAG ATGGTGATGCTTCTTTCC-3′，包含KpnⅠ酶切位點（下劃線）。由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s；72℃45 s；72℃10 m in，4℃保存，其中變性、退火、延伸為30個循環(huán)。使用TaKaRa膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆送上海桑尼生物工程有限公司測序。

1.3.3 VvMSA序列生物信息學(xué)分析 使用軟件DNAStar對目的氨基酸序列進(jìn)行了理化性質(zhì)分析；通過MEGA5.0軟件分析了VvMSA蛋白與其他植物ASR家族蛋白的同源性。使用在線分析軟件NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和ProtScale（http：//web.web.expasy.org/protscale）對VvMSA氨基酸序列分別進(jìn)行磷酸化位點和疏水性/親水性分析［28］。

1.3.4 VvMSA基因表達(dá)特性分析 使用實時熒光定量PCR檢測VvMSA基因相對表達(dá)量變化。根據(jù)VvMSA基因序列設(shè)計定量引物：Sense：5′-CACAA GTCGGAGAAAGACC-3′，Anti-sense：5′-GAGACCCA GGAAACAAGAC-3′；Actin sense：5′-AATGAGAGAT GGCTGGAAGAG-3′，Anti-sense：5′-TACGAGCAAGA GCTGGAAA-3′。實時熒光定量PCR條件為：95℃60 s；95℃10 s；56℃20 s；72℃20 s，40個循環(huán)。Melt曲線從72～99℃，第1步維持45 s，以后每升高1℃維持5 s。每個樣品3次重復(fù)。Actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法［29］計算VvMSA相對表達(dá)量。所有試驗結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvMSA基因克隆

從抗性葡萄品種Vidal Blanc的cDNA模板中擴增得到目的基因VvMSA，如圖1-A所示：在約500 bp處有一條清晰的條帶。將VvMSA PCR產(chǎn)物回收連接pMD19-T載體，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定（圖1-B），將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送交測序。由測序可知，VvMSA基因全長序列450 bp，編碼149個氨基酸。由DNAStar軟件分析結(jié)果可知，與GenBank中所公布的白玉霓品種的基因序列一致性為98.67%，其中GenBank中所提交的基因序列第61位的G、179位的C、231位的A、240位的A、336位的C、345位的T在擴增目的片段中分別為T、G、C、C、T、G。2個品種之間氨基酸序列一致性為98.66%，其中第21位和第60位的氨基酸在品種白玉霓中分別是S和G，而在品種Vidal Blanc中均為A。

圖1 VvMSA基因CDS序列擴增（A）和重組質(zhì)粒的酶切鑒定（B）Fig.1 PCR am p lification p roduction of VvMSA CDS and restriction d igestion analysis of recom binan t p lasm ids

2.2 VvM SA的生物信息學(xué)分析

2.2.1 VvMSA蛋白的序列分析 ProtParam軟件分析結(jié)果表明，VvMSA的分子式組成為C773H1083N213O237S1，氨基酸數(shù)為149，分子量約為16.703 kDa，等電點為5.68，不穩(wěn)定系數(shù)為41.71（40以下為穩(wěn)定蛋白），推測為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸含量相對較多，而精氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸和甲硫氨酸含量相對較少，蛋白中不包含半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸。Conserved Domains軟件分析葡萄VvMSA保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果顯示，在VvMSA中存在由65個氨基酸組成的ABA/WDS保守結(jié)構(gòu)域（圖2-A）。

利用ClustalX對氨基酸序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，葡萄VvMSA與多種植物具有同源性，含有共同保守結(jié)構(gòu)域ABA/WDS，VvMSA和番茄LeASR1以及甜橙CsASR相似性較高為81.2%和82.6%，桃PpASR次之為79.7%。利用MEGA5.0進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，其在進(jìn)化上屬于單獨一個分支，和番茄LeASR1是由同一個祖先進(jìn)化出的2個分支，此后，又與LeASR2、StDS2、LeASR3、NtASR、FaASR、PpASR、McASR在進(jìn)化上產(chǎn)生分支（圖2-B）。

2.2.2 VvMSA氨基酸序列的磷酸化修飾預(yù)測 蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)的一種調(diào)節(jié)方式，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。目前，研究的主要磷酸化部位有：絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸結(jié)合位點。利用在線軟件NetPhos對VvMSA氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)其存在3個絲氨酸、4個蘇氨酸和4個酪氨酸的磷酸化位點（圖3）。

2.2.3 VvMSA氨基酸序列疏水性/親水性預(yù)測和分析 疏水/親水間的平衡是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要特征，預(yù)測氨基酸序列的疏水性/親水性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能的研究具有一定幫助。由ProtScale分析VvMSA氨基酸序列的親/疏水性，可知VvMSA的N端為親水結(jié)構(gòu)，中部有2個疏水區(qū)域，C端也為親水結(jié)構(gòu)，且親水能力較強。整個氨基酸表現(xiàn)出較強的親水性（圖4）。

2.3 VvMSA基因的表達(dá)特異性分析

2.3.1 VvMSA的組織表達(dá)特性分析 以葡萄品種Vidal Blanc為試材，熒光定量PCR分析VvMSA在不同組織器官中的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，在根、莖、幼葉、功能葉、卷須、花芽、梢尖、花、幼果、轉(zhuǎn)色果和成熟果中均檢測到VvMSA表達(dá)，但是相對表達(dá)量存在差異，花中VvMSA相對表達(dá)量最高（圖5），推測VvMSA參與葡萄的開花進(jìn)程。

2.3.2 幾種逆境因子對VvMSA表達(dá)量的影響 經(jīng)鹽、4℃低溫和甘露醇處理Vidal Blanc組培苗，實時熒光定量PCR檢測VvMSA的相對表達(dá)量。由圖6可知，甘露醇、鹽和低溫均可不同程度的誘導(dǎo)VvMSA的表達(dá)上調(diào)，其中鹽誘導(dǎo)VvMSA表達(dá)最為明顯。在處理后3 h相對表達(dá)量達(dá)到最大，約為對照的22倍。而低溫和甘露醇誘導(dǎo)分別在6，12 h達(dá)到最大值。由此推測VvMSA可能參與葡萄抵御多種非生物脅迫逆境，特別是鹽脅迫的過程。

圖2 葡萄與其他物種中ASR氨基酸序列比對（A）和同源進(jìn)化樹（B）分析Fig.2 Am ino acid sequence alignm ent of ASR hom ologs in grapevine and other species

圖3 VvM SA氨基酸序列的磷酸化修飾預(yù)測Fig.3 Phosphory lation p red iction of translated am ino acid sequence of VvM SA

圖4 VvM SA氨基酸序列的疏水性/親水性預(yù)測Fig.4 Analysis of VvM SA hyd rophobic/hyd rophilic nature

圖5 VvMSA在葡萄不同組織中表達(dá)特性分析Fig.5 Characterization of VvMSA expression pattern in tissues of grape

圖6 幾種逆境因子對葡萄葉片VvMSA相對表達(dá)量的影響Fig.6 Quantitative RT-PCR analysis of VvMSA exp ression in grape leaves under different abiotic som e stresses

2.3.3 幾種逆境信號分子對VvMSA表達(dá)量的影響植物對逆境脅迫的響應(yīng)是一個復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，本試驗研究了多種逆境信號分子對VvMSA表達(dá)量的影響。從圖7可以看出，逆境相關(guān)的信號物質(zhì)H2S供體NaHS、NO供體SNP均可誘導(dǎo)Vidal Blanc葉片中VvMSA相對表達(dá)量的增加，并分別在12，3 h的相對表達(dá)量達(dá)到最大值；但H2O2對VvMSA相對表達(dá)量幾乎沒有影響，而SA對VvMSA的表達(dá)有一定的抑制效應(yīng)。推測H2S和NO均可能參與VvMSA介導(dǎo)的葡萄抵御非生物脅迫的過程。

圖7 幾種逆境相關(guān)信號物質(zhì)對葡萄葉片VvMSA相對表達(dá)量的影響Fig.7 Transcription analysis of VvMSA under the treatm ent of d ifferen t stress related signaling m olecules

2.3.4 幾種激素對VvMSA表達(dá)量的影響 植物對激素的響應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，既可以影響果實成熟進(jìn)程，也可以影響果實的品質(zhì)。本試驗研究了多種激素對VvMSA表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABA可明顯誘導(dǎo)Vidal Blanc葉片中VvMSA相對表達(dá)量上升，上升了4.4倍，并在3 h相對表達(dá)量達(dá)到最大；IAA和GA3均可誘導(dǎo)VvMSA的表達(dá)，但是上升幅度較小（圖8），而ET對VvMSA的誘導(dǎo)在處理12 h后開始上升。推測，VvMSA參與了植物激素誘導(dǎo)葡萄成熟過程。

圖8 幾種激素對VvMSA相對表達(dá)量的影響Fig.8 Transcrip tion analysis of VvMSA under the treatm ent of different horm ones

3 討論

ASR蛋白是一類能被逆境誘導(dǎo)的低分子量的植物特異蛋白，含有共同序列特征ABA/WDS序列標(biāo)簽。有報道NaCl和干旱處理后，番茄的ASR基因表達(dá)量上升，過表達(dá)ASR1基因增加了煙草對鹽的耐受能力，轉(zhuǎn)基因植株比對照植株更少積累了Na離子，同時還誘導(dǎo)一些逆境相關(guān)基因的表達(dá)［30］。水稻ASR基因OsASR1受鹽、干旱和ABA誘導(dǎo)，將該基因在水稻中過表達(dá)，能夠增強水稻對冷脅迫的抗性。OsASR1基因轉(zhuǎn)入酵母后，酵母對NaCl、H2O2、水楊酸和高溫等的耐受性有所上升。百合LLA23基因，在花粉成熟后期開始積累，其表達(dá)受SA和甘露醇的誘導(dǎo)［23］。ASR還參與了植物抵御金屬離子脅迫和生物脅迫，如：鋁脅迫時水稻ASR5基因表達(dá)上升，敲除ASR5后表現(xiàn)出鋁敏感［31］。

葡萄中至今只發(fā)現(xiàn)了1個ASR蛋白，葡萄ASR基因VvMSA可以與葡萄己糖轉(zhuǎn)運蛋白VvHT1結(jié)合，且正調(diào)控VvHT1。并且發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄品種白玉霓VvMSA表達(dá)在幼果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期呈現(xiàn)出高低高的表達(dá)模式，同時VvMSA的表達(dá)還可受蔗糖誘導(dǎo)，且這種糖誘導(dǎo)可被ABA強烈增強［16］。已證實，ASR1定位于細(xì)胞質(zhì)和核［32］；原位雜交試驗顯示VvMSA在韌皮部特異性表達(dá)［33］。但目前尚不清楚其組織表達(dá)特性和誘導(dǎo)表達(dá)特性。本試驗從抗性葡萄Vidal Blanc組培苗中克隆了VvMSA基因，與數(shù)據(jù)庫中的白玉霓的VvMSA的基因序列一致性為98.67%，其中GenBank中所提交葡萄品種白玉霓的基因序列第61位的G、179位的C、231位的A、240位的A、336位的C、345位的T在擴增目的片段中分別為T、G、C、C、T、G；所編碼的氨基酸序列一致性為98.66%，其中GenBank中所提交的氨基酸序列第21位為絲氨酸（Ser），第60位為甘氨酸（Gly），葡萄品種Vidal Blanc中對應(yīng)位置均為丙氨酸（A la）。利用熒光定量PCR技術(shù)分析葡萄VvMSA的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，VvMSA在花中的表達(dá)量較高，在根、莖、功能葉以及在果實中均有表達(dá)。Cakir等［16］在2003年發(fā)現(xiàn)幼果中表達(dá)量較高，在轉(zhuǎn)色期下降，隨后在成熟期又增加，呈現(xiàn)出高低高的變化趨勢。本試驗進(jìn)一步證明，該基因能響應(yīng)于逆境脅迫以及逆境相關(guān)的信號分子和果實成熟相關(guān)激素，其中NaCl脅迫之后表達(dá)量上升，在3 h時約為對照22倍，H2S能夠在12 h誘導(dǎo)VvMSA表達(dá)量達(dá)到最高，且葡萄成熟相關(guān)激素ABA也誘導(dǎo)了該基因表達(dá)上調(diào)，在3 h最高，上調(diào)了4.4倍。綜合來看，VvMSA參與了葡萄抗逆和成熟過程以及花的發(fā)育過程。但是具體調(diào)控的分子機制尚不清楚，有待于進(jìn)一步試驗研究。

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Gene Cloning and Expression Analysis of VvMSA in Vitis vinifera

ZHANG Suifang，ZHU Dan，MA Qian，HOU Lixia，YIN Pengfei，LIU Xin
（College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China）

To investigate the function of VvMSA，the full-length cDNA of VvMSA was cloned from Vitis vinifera cultivar Vidal Blanc tissue culture seedlings.Bioinformatic analysis and quantitative Real-time PCR was used to analyze its characteristics.The results showed that VvMSA amplified fragment size of450 bp encoding 149 amino acids with molecular weight 16.703 kDa，isoelectric point 5.68.VvMSA was an unstable hydrophilic protein and contained a conserved domain ABA/WDS encoding by 65 amino acids.VvMSA and the known homolog LeASR1 in tomato belongs to different sub-fam ilies.Real-time PCR analysis showed that the VvMSA was expressed in all tested tissues with the highest expression in flower.VvMSA was induced by salt，drought and cold stress in different levels，and highest expression level was showed after 3 h salt treatment.In addition，VvMSA was also induced by nitric oxide（NO），hydrogen sulfide（H2S），abscisicacid（ABA）gibberellin（GA3），auxin（IAA）and ethylene（ET），while salicylic acid（SA）inhibited its expression.The expression pattern of VvMSA by salt treatment was sim ilar with the expression pattern by ABA treatment.In total，these results suggested that the VvMSA was involved in salt resistance by ABA signaling.

Vitis vinifera；VvMSA；Gene clone；Expression analysis

Q78；S663.03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0058-07

10.7668/hbnxb.2016.03.009

2016-02-16

國家自然科學(xué)基金項目（31401844；31572107；31540090）；山東省科技攻關(guān)項目（2013GNC11016）；山東省高等學(xué)?？萍加媱澔痦椖浚↗14LE12）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金項目（111339）

張歲芳（1990-），女，山東菏澤人，在讀碩士，主要從事葡萄分子生物學(xué)研究。

劉 新（1966-），女，山東萊陽人，教授，博士，主要從事植物逆境生理學(xué)和分子生物學(xué)研究。