王卉，邵東旭，何節(jié)玉，孫宏元（瓊州學(xué)院食品科學(xué)與工程系，海南三亞572022）

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Nisin復(fù)合微粒的制備及其抗菌穩(wěn)定性的研究

王卉，邵東旭，何節(jié)玉，孫宏元
（瓊州學(xué)院食品科學(xué)與工程系，海南三亞572022）

摘要：乳酸鏈球菌素（Nisin）在應(yīng)用中生物活性受到許多化學(xué)和物理因素的影響，采用殼聚糖（CS）/果膠（PE）復(fù)合凝聚物對(duì)Nisin進(jìn)行包埋，研究反應(yīng)的條件及復(fù)合微粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并考察包封Nisin經(jīng)高溫和胰蛋白酶處理后的抗菌穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明：在pH6、CS/PE質(zhì)量比0.6、Nisin濃度1.5%時(shí)，Nisin包封率為87.3%，果膠的羧酸和殼聚糖的氨基通過靜電相互作用，包封Nisin的顆粒基本成球形，大小約在100 nm～800 nm之間。經(jīng)120℃處理20 min后，包封Nisin抗菌率是游離Nisin的4倍。當(dāng)胰蛋白酶與Nisin反應(yīng)10 min后，游離的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，反應(yīng)60min后，抗菌率還有29%，說明CS/PE壁材對(duì)Nisin的抗菌性起到很大的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：乳酸鏈球菌素；果膠；殼聚糖；抗菌穩(wěn)定性

乳酸鏈球菌素（Nisin）對(duì)大部分革蘭氏陽性細(xì)菌和芽孢的生長(zhǎng)和繁殖有抑制作用，是公認(rèn)的高效、無毒的天然食品防腐劑，能有效延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，因此受到越來越多的重視［1］。但Nisin在應(yīng)用中存在穩(wěn)定性差，生物活性受到許多化學(xué)和物理因素的影響，如溫度、pH值和鹽等，并能與食品中的蛋白質(zhì)、脂肪、酶等組分發(fā)生反應(yīng)［2-3］，導(dǎo)致Nisin抑菌能力降低。Nisin被用于鮮肉防腐，會(huì)受到肉中蛋白酶的分解，需增加添加量才能達(dá)到保鮮效果［4］。包埋技術(shù)能有效地解決Nisin穩(wěn)定性的問題，包封壁材能降低食品生產(chǎn)加工過程中不同環(huán)境對(duì)Nisin的破壞，保證Nisin抑菌性能。主要的包封材料有脂質(zhì)體［5］，海藻酸鈉［6］、聚乳酸［7］和殼聚糖［8］等。

基于靜電相互作用的聚電解質(zhì)復(fù)合反應(yīng)是發(fā)生在兩種或兩種以上大分子之間的的自聚集現(xiàn)象，若體系中同時(shí)存有被包埋的芯材物質(zhì)，可形成包埋微粒［9］。其包埋方面的特性能保護(hù)和控制釋放有效成分，提高產(chǎn)品品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)、食品調(diào)味品、生物醫(yī)藥、化妝品以及紡織品等領(lǐng)域［10］。目前使用的天然聚陽離子主要有殼聚糖（CS）、多肽等，聚陰離子主要是天然多糖，如海藻酸鈉、阿拉伯膠、果膠、聚陰離子纖維素、硫酸葡聚糖等。

本論文利用殼聚糖為聚陽離子，低酯果膠為聚陰離子制備包封Nisin的復(fù)合微粒，考察反應(yīng)條件對(duì)形成復(fù)合物的影響，研究包封Nisin的抗菌穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

殼聚糖（脫乙酰度≥95%）：廣東省齊云生物技術(shù)有限公司；低酯果膠（酯化度30%～40%）：浙江衢州果膠有限公司；乳酸鏈球菌肽（食品級(jí)）：浙江新銀象生物工程有限公司；胰蛋白酶（食品級(jí)，活力10 000 IU/g）：鄭州鴻祥化工有限公司；其他試劑均為分析純。

UV2550紫外可見分光光度計(jì)、IRAffinity-1傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津；PHS-2C酸度計(jì)：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；HitachiH-600透射電子顯微鏡：日本日立公司。

1.2方法

1.2.1CS/PE最佳質(zhì)量比的測(cè)定

配制濃度為1 mg/mL果膠的水溶液，濃度1 mg/mL的殼聚糖溶液用0.5%的醋酸配制，在20℃下，邊攪拌邊將殼聚糖溶液逐滴加入果膠溶液中，于500 nm處測(cè)定溶液吸光度隨果膠滴加量的變化，該波長(zhǎng)下殼聚糖和果膠均沒有吸收，確定最佳CS/PE的質(zhì)量比。

1.2.2pH對(duì)形成CS/PE復(fù)合物的影響

分別調(diào)節(jié)果膠水溶液（5 mg/mL）與殼聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）的pH為2、3、4、5、6、7，按最佳質(zhì)量比將殼聚糖加入到果膠溶液，反應(yīng)10 min，將復(fù)凝聚產(chǎn)物超速離心，過濾沉淀，干燥，計(jì)算復(fù)凝聚反應(yīng)的產(chǎn)率，以反應(yīng)產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)找出最佳的反應(yīng)pH值。

1.2.3Nisin/CS/PE復(fù)合微粒的制備和測(cè)定

1.2.3.1Nisin/CS/PE復(fù)合微粒的制備

分別調(diào)節(jié)果膠水溶液（5 mg/mL）與殼聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）至最佳反應(yīng)pH值，在殼聚糖溶液中加入吐溫80（殼聚糖添加量的5%）和Nisin（Nisin的濃度為0.5%、1.0%、2.0%），攪拌均勻，制備Nisin乳液。將Nisin乳液和果膠溶液同時(shí)滴加到攪拌的蒸餾水中，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)10 min，所得Nisin/CS/PE分散液置于4℃下待用。

1.2.3.2Nisin包埋率的測(cè)定

將Nisin/CS/PE分散液離心分離，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法［11］檢測(cè)上清液中Nisin的量來計(jì)算包封率。

1.2.3.3紅外光譜測(cè)定

將樣品置于紅外干燥箱中除水干燥后，與KBr混勻研磨成粉狀，壓片，用IRAffinity-1傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定，以空白KBr為背景于400 cm-1～4 000 cm-1間掃描。掃描次數(shù)為30次，分辨率為4 cm-1。

1.2.3.4電子透射電鏡

將少量Nisin/CS/PE分散液直接滴在銅網(wǎng)上，待水分基本揮發(fā)干凈后，磷鎢酸染色。用濾紙吸走多余的染體，自然干燥，用透射電子顯微鏡（HitachiH-600）觀察納米粒子的形態(tài)和大小。

1.2.4溫度對(duì)Nisin抗菌能力的影響

配制濃度250 μg/mL、pH 6的Nisin水溶液，用水稀釋Nisin/CS/PE分散液使Nisin濃度為250 μg/mL，將Nisin水溶液和包封Nisin的分散液分別在不同溫度（60、90、120℃）下保持20 min，測(cè)定抗菌率。

1.2.5胰蛋白酶對(duì)Nisin抗菌能力的影響

在Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（濃度為250 μg/mL，pH 6）中加入20 μg/mL的胰蛋白酶，于37℃，200 r/min搖床振蕩10、30、60、90 min，反應(yīng)結(jié)束后在100℃滅酶10 min，測(cè)定抗菌率。

1.2.6Nisin抗菌率測(cè)定

制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，在10mL適宜菌含量的金黃色葡萄球菌菌液中，分別加入0.2mL處理的Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（濃度為250 μg/mL，pH 6），混合均勻后，取出0.2 mL涂布于平板上培養(yǎng)，各制備3個(gè)平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。觀察并記錄各平板的菌落個(gè)數(shù)，取平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1CS/PE最佳質(zhì)量比的測(cè)定

溶液吸光度與CS/PE質(zhì)量比的關(guān)系如圖1所示。

圖1　CS/PE質(zhì)量比對(duì)溶液吸光度的影響Fig.1　Effect of CS/PE ratio on absorbance of solution

兩種聚電解質(zhì)在溶液中發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)，形成復(fù)合物分散液，其吸光度升高，因此可根據(jù)溶液吸光度的變化來確定復(fù)合反應(yīng)的進(jìn)行程度。當(dāng)CS/PE的質(zhì)量比在0～0.6之間變化時(shí)，隨著殼聚糖含量增加，吸光度上升，這是由于果膠分子鏈上的帶負(fù)電的羧基與殼聚糖帶正電的氨基基團(tuán)相互作用，生成疏水性的聚電解質(zhì)復(fù)合物，0.6是這個(gè)曲線變化的拐點(diǎn)也是曲線最高點(diǎn)，表明溶液中所含的離子量最少，反應(yīng)最充分，是最佳的質(zhì)量比。當(dāng)超過0.6后，由于溶液被稀釋，吸光度逐漸降低。

2.2pH值對(duì)復(fù)合過程的影響

當(dāng)CS/PE質(zhì)量比為0.6時(shí)，復(fù)合產(chǎn)率隨pH值的變化如表1所示。

表1　pH值對(duì)CS/PE復(fù)合物產(chǎn)率的影響Table 1　Effect of pH on the yield of CS/PE complex

由表1可知，pH為5～6時(shí)，凝聚產(chǎn)率最高，達(dá)92.1%，說明殼聚糖中氨基和果膠上羧酸之間的靜電作用最強(qiáng)。當(dāng)pH值降低時(shí)，由于果膠中羧酸離解程度變?nèi)?，電荷密度降低，產(chǎn)率逐漸降低，當(dāng)pH值增大呈堿性時(shí)，殼聚糖中氨基不能被質(zhì)子化，與果膠不能形成復(fù)合粒子。

2.3CS/PE和Nisin/CS/PE復(fù)合物的紅外光譜分析

圖2為殼聚糖、果膠和CS/PE的紅外光譜圖，圖3 為CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的紅外光譜圖。

圖2　CS、PE和CS/PE的紅外光譜圖Fig.2　FTIR of CS、PE、CS/PE

由圖2可見，殼聚糖在1 647 cm-1附近的吸收峰是氨基N-H鍵的彎曲振動(dòng)，果膠在1 745 cm-1處的吸收峰為半乳糖醛酸羧基形成的酯鍵中羰基的伸縮振動(dòng)；1 620 cm-1處的吸收峰為游離的羧酸中羰基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在CS/PE中，殼聚糖氨基峰向低波數(shù)移動(dòng)至1 640 cm-1，果膠中酯鍵羰基吸收峰減弱，1 628 cm-1處離子化的羧基峰消失，表明殼聚糖和果膠通過離子鍵進(jìn)行反應(yīng)。

圖3中Nisin的主要吸收峰1630cm-1和1539cm-1相應(yīng)于Nisin中酰胺I和II鍵，在Nisin/CS/PE中也有出現(xiàn)，表明Nisin包裹在復(fù)合物中。

2.4Nisin濃度對(duì)復(fù)合物包封率的影響

不同Nisin濃度對(duì)包封率的影響見表2。

圖3　CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的紅外光譜圖Fig.3　FTIR of CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE

表2　不同Nisin濃度對(duì)包封率的影響Table 2　The effect of Nisin concentration on encapsulated efficiency

由表2可知，在Nisin濃度為1.5%時(shí)，Nisin/CS/PE復(fù)合物中Nisin的包封率最高，達(dá)87.3%，在Nisin濃度很低的情況下，由于溶液中Nisin分子數(shù)少，增加了聚電解質(zhì)在形成過程中對(duì)Nisin分子的“捕捉”難度，造成對(duì)目標(biāo)物分子的包封率小。當(dāng)Nisin濃度超過1.5%時(shí)，包封率又有所下降。

2.5Nisin/CS/PE復(fù)合物的形態(tài)

Nisin/CS/PE復(fù)合物的透射電鏡圖如圖4所示。

圖4　Nisin/CS/PE復(fù)合物的透射電鏡圖Fig.4　TEM image of Nisin/CS/PE complex

圖4為透射電鏡下觀察到的Nisin/CS/PE復(fù)合物的形態(tài)，由圖中可見，復(fù)合物顆粒的形狀基本成球形，大小不是很均一，顆粒之間無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，表明體系較穩(wěn)定，大小大約在100 nm～800 nm。

2.6溫度對(duì)Nisin抗菌能力的影響

溫度對(duì)Nisin抗菌能力的影響如圖5所示。

圖5　溫度對(duì)Nisin抗菌能力的影響Fig.5　Effect of temperature on the antibacterial activity of Nisin

由圖5可知，隨著處理的溫度升高，Nisin的抗菌率逐漸降低，經(jīng)60℃處理20 min，包封Nisin和游離Nisin的抗菌性基本相同，溫度升高對(duì)包封Nisin的抗菌率影響不大，經(jīng)120℃處理20 min，仍有65%，而游離Nisin的抗菌率顯著降低到15%。說明CS/PE壁材對(duì)Nisin的抗菌性起到很大的保護(hù)作用。

2.7胰蛋白酶對(duì)Nisin抗菌率的影響

胰蛋白酶對(duì)Nisin抗菌率的影響如圖6所示。

圖6　胰蛋白酶對(duì)Nisin抗菌率的影響Fig.6　Effect of trypsin on the antibacterial activity of Nisin

由圖6可知，當(dāng)胰蛋白酶與Nisin反應(yīng)10 min后，游離的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，包封Nisin抗菌率逐漸降低，在60 min時(shí)，抗菌率剩下29%。由于Nisin是多肽，對(duì)蛋白酶很敏感，游離的Nisin與胰蛋白酶反應(yīng)后很快失去抗菌性，而包封Nisin由于受到CS/PE壁材的保護(hù)，所以能保持一定的抗菌活性，但在反應(yīng)60 min后，抗菌性也大大降低。

3　結(jié)論

帶負(fù)電荷果膠與帶正電荷殼聚糖在進(jìn)行復(fù)合反應(yīng)能對(duì)Nisin進(jìn)行有效的包埋，提高了Nisin的抗菌穩(wěn)定性，復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)率受反應(yīng)條件的影響，在pH 6、CS/ PE質(zhì)量比0.6、溶液中Nisin濃度1.5%時(shí)，生成的復(fù)合物對(duì)Nisin的包封率為87.3%，果膠的羧酸和殼聚糖的氨基通過靜電相互作用，包埋Nisin顆?；境汕蛐?，大小約在100 nm～800 nm之間。溫度和蛋白酶能降低Nisin的活性，包封的Nisin穩(wěn)定性大于游離的Nisin，經(jīng)高溫和胰蛋白酶的處理，游離Nisin的抗菌率損失很大，而包封Nisin仍具有較強(qiáng)的抗菌性。說明CS/PE壁材對(duì)Nisin的抗菌性起到很大的保護(hù)作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51363018）

作者簡(jiǎn)介：王卉（1968—），女（漢），教授，博士，研究方向：天然大分子和食品保鮮。

收稿日期：2015-05-13

Studies on Preparation of Nisin Complex Particles and Antibacterial Stability

WANG Hui，SHAO Dong-xu，HE Jie-yu，SUN Hong-yuan

（Department of Food Science and Technology，Qiongzhou University，Sanya 572022，Hainan，China）

Abstract：The biological activities of Nisin are affected by many chemical and physical factors.Nisin was encapsulated in the complex of chitosan（CS）and pectin（PE）.The reaction conditions，structure and morphology of the complex were studied.The antibacterial stabilities of encapsulated Nisin were measured after high temperature and trypsin treatment.The results showed that the encapsulation effect of Nisin was 87.3%in pH6 with 0.6 of the CS/PE ratio and 1.5%of Nisin concentration.Carboxyl groups on pectin and amino groups on chitosan react by electrostatic interactionsand particle sizesof Nisin/CS/PE complex range from 100 nm to 800 nm with spherical shape.The antibacterial rate of the encapsulated Nisin was four times that of free Nisin after treatment for 20 min at 120℃.After reaction with trypsin for 10 min，the antibacterial rate of free Nisin only left 5%，while that of encapsulated Nisin was 73%，and remained 29%after 60 min.The results demonstrated that wall material CS/PE had great protective effect on the antibacterial rate of encapsulated Nisin.

Key words：Nisin；pectin；chitosan；antibacterial stability