王謙，安雪，劉敏（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

?

茯苓-香菇柄-山楂葉固態(tài)發(fā)酵物的抗氧化作用

王謙，安雪，劉敏
（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

摘要：以香菇柄、山楂葉為主料，按照一定比例制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將茯苓轉(zhuǎn)接到固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中培養(yǎng)，將滿管8 d后的固態(tài)發(fā)酵物烘干；通過超聲波提取方法對茯苓-香菇柄-山楂葉固態(tài)發(fā)酵物和原料基質(zhì)中總黃酮進行提取，經(jīng)對比可知，固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮含量要高于原料基質(zhì)中的含量；固態(tài)發(fā)酵物中含有多糖、總黃酮等功能因子，具有抗氧化、延緩衰老的作用，通過加壓提取的方式獲得固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液后，取適量提取液添加到玉米油、卵黃中，發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵提取液的抗脂質(zhì)過氧化作用要顯著優(yōu)于原料基質(zhì)組；因此將固態(tài)發(fā)酵提取液開發(fā)成功能食品，具有很廣闊的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：茯苓；香菇柄-山楂葉；總黃酮；脂質(zhì)過氧化

香菇柄和山楂葉均屬于農(nóng)林廢棄物，但其含有多種功能物質(zhì)。香菇柄與菌蓋一樣富含多糖、蛋白質(zhì)、嘌呤等成分，具有提高免疫力［1］、抗病毒、抗血脂的作用，目前已有將香菇柄開發(fā)成食品［2-3］，如香菇脯、香辣香菇醬［4］；山楂葉具有活血散結(jié)、抗氧化、溫補開胃等作用［5］。我國廣西、江西等地的藥材規(guī)則中都存在山楂葉藥用的記載，并且山楂葉于2005年正式收錄于《中國藥典》［6］。山楂葉含有多種生物活性物質(zhì)，如總黃酮類物質(zhì)［7］可調(diào)節(jié)血脂、多酚類成分，是抗氧化作用的重要活性物質(zhì)［8］。將茯苓菌在以香菇柄-山楂葉為主料固態(tài)發(fā)酵的方式，不僅使固態(tài)發(fā)酵物中富含多種功能因子，更重要的是符合經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。在前面報道的文章中可知，固態(tài)發(fā)酵物中多糖、氨基酸含量顯著高于原料基質(zhì)組［9］，本研究中將對兩種復合物中總黃酮含量進行對比，通過功能學試驗對固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液進行研究，證明通過固態(tài)發(fā)酵的方式制備的固態(tài)發(fā)酵物，是否具有優(yōu)越性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

香菇柄、山楂葉：由河北大學食藥用真菌研究生提供；蘆?。兌萓V≥98%）：天津市光復科技發(fā)展有限公司；玉米油、雞蛋：市售。

蛋白/核酸分析儀（CECIL9560）：英國Cecil；超聲波細胞粉碎機：寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；722型分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蘆丁標準曲線的繪制

將蘆丁標品烘干至恒重后，精密稱取10 mg蘆丁標品于裝有25 mL 50%無水乙醇的燒杯中，超聲處理45 min使其溶解，將蘆丁溶液置于50 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度，搖勻備用。通過蛋白/核酸分析儀對蘆丁溶液進行全波長掃描，確定蘆丁的最大吸收波長。

精密量取蘆丁標準品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別裝于10 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度，震蕩搖勻，以50%無水乙醇為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度值，繪制標準曲線［10］。

1.3.2兩種培養(yǎng)物中總黃酮含量的測定

（2）鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作人員的專業(yè)性不強。2008年獸醫(yī)體制改革后，鄉(xiāng)鎮(zhèn)級獸醫(yī)站實現(xiàn)人、財、物三權(quán)規(guī)鄉(xiāng)鎮(zhèn)。鄉(xiāng)鎮(zhèn)級獸醫(yī)站工作人員承擔了過多的業(yè)務工作以外的工作。另外，鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站經(jīng)費短缺。

將兩種培養(yǎng)物烘干后，各稱取0.2 g溶于20 mL 50%無水乙醇中，超聲處理45 min后，6 000 r/min離心6 min，合并上清液，加50%無水乙醇至20 mL。精密量取1 mL于10 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度。以50%無水乙醇為空白對照，在最大吸收波長處測兩種培養(yǎng)物的吸光度值，計算總黃酮含量。

1.3.3碘標準曲線的制作

取一系列10 mL比色管，加入40∶60（體積比）異辛烷-冰乙酸［11］5 mL，再分別加入碘標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，搖勻后，各加入1.0 mL的淀粉指示劑，加水至刻度后，搖勻，靜置5 min，以蒸餾水為空白對照，于535 nm處測吸光度值。

1.3.4固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液抗玉米油過氧化作用

精確量取0.5 mL玉米油于干燥的10.0 mL試管中后，加入40∶60（體積比）的異辛烷-冰乙酸5 mL，之后再加入飽和KI溶液0.5 mL，輕輕搖勻后，加入固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液各1mL，對照組加入1.0 mL蒸餾水，搖勻后反應3 min，取出后加入10 g/L淀粉溶液1.0 mL，之后加水稀釋至刻度，搖勻后靜置5 min，取分層后的上清液，于535 nm處測吸光度值［12-13］，統(tǒng)稱為OD1。由于固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液有一定的顏色，為了避免顏色的干擾，取兩種提取液各1 mL 于10mL比色管中，加蒸餾水至刻度后，搖勻，于535nm處測吸光度值，統(tǒng)稱為OD2，則最終OD值為OD1減去OD2。

1.3.5卵黃懸液的制備

將新鮮雞蛋的蛋殼輕輕敲碎，分離蛋黃，用濾紙輕輕吸取殘余蛋清，將卵膜劃破收集卵黃，用0.1 mol/L pH 7.4的PBS按1∶1（體積比）配成懸液后并稀釋成1∶25（體積比），混勻備用［14］。

1.3.6卵黃固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液的抗卵黃脂質(zhì)過氧化作用

向比色管中加入上述卵黃懸液0.3 mL，然后分別加入固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液1 mL，對照組加入1 mLPBS，再加入25 mmol/L的硫酸亞鐵0.2 mL，用0.1 mol/L pH 7.4 PBS補至5 mL，置于37℃水浴震蕩50 min，取出后加入20%的三氯醋酸0.5 mL，靜置10 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.8%硫代巴比妥酸1.0 mL，532 nm［15-16］處測光度值，統(tǒng)稱為OD1；重復以上操作，加入硫代巴比妥酸后，擰緊管口，100℃下水浴15 min，對照組以PBS代替上清液，532 nm處測光度值，統(tǒng)稱為OD2；最終OD值為OD1減去OD2。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁最大吸收波長如圖1所示。

圖1　蘆丁最大吸收波長Fig.1　The maximum absorption wavelength of rutin

根據(jù)掃描結(jié)果可知，在257 nm和364 nm處有最大吸收峰，選取364 nm為蘆丁的最大吸收波長。

以50%無水乙醇為對照，在364 nm處測定不同濃度的蘆丁溶液的吸光度值，并繪制蘆丁標準曲線，如圖2所示。

2.2未經(jīng)茯苓菌發(fā)酵的原料基質(zhì)和固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮含量比較

未經(jīng)茯苓菌發(fā)酵的原料基質(zhì)和固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮含量比較如表1所示。

由表1可知，相同質(zhì)量的兩種培養(yǎng)物中，固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮含量明顯高于未經(jīng)茯苓菌發(fā)酵的原料基質(zhì)中總黃酮含量。

圖2　 蘆丁標準曲線Fig.2　Standard curve of rutin

表1　兩種復合物中的總黃酮含量Table 1　Total flavonoids concentration of extract two complex

2.3碘標準曲線的繪制

碘標準曲線如圖3所示。

圖3　碘標準曲線Fig.3　Standard curve of iodine

2.4添加兩種提取液后玉米油過氧化值的測定

通過碘標準曲線，分別計算出加入蒸餾水、原料基質(zhì)提取液、固態(tài)發(fā)酵提取液后產(chǎn)生的碘的質(zhì)量；通過下列公式計算出玉米油的過氧化值。

式中：X1為樣品的過氧化值，g/100 g；X2為樣品過氧化值，meq/kg；m為樣品的吸光度值對應的碘質(zhì)量，mg；m1為樣品質(zhì)量，g。

玉米油中的過氧化值如表2所示。

表2　玉米油中的過氧化值Table 2　The peroxide value of corn oil

由表2可知，與空白對照組相比，向玉米油中加入固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液后，對玉米油的過氧化作用均有抑制效果，其中加入固態(tài)發(fā)酵提取液后，玉米油的過氧化值最低，說明固態(tài)發(fā)酵提取液的抗油脂過氧化能力高于原料基質(zhì)提取液的能力。

2.5固態(tài)發(fā)酵提取液抗卵黃的脂質(zhì)過氧化研究作用

抑制率/%=（OD對照－OD樣品）/OD對照×100，式中：OD對照為對照組的吸光度值；OD樣品為樣品的吸光度值本試驗中，添加固態(tài)發(fā)酵提取液和未發(fā)酵提取液后的抑制情況如表3所示。

表3　固態(tài)發(fā)酵提取液對卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用Table 3　Solid-state fermentation extract of yolk inhibition of lipid peroxidation

由表3可知，在卵黃體系中，加入一定濃度的固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液后，對卵黃的脂質(zhì)過氧化均有抑制作用，說明這兩種提取液均具有抗氧化的能力；試驗結(jié)果中固態(tài)發(fā)酵提取液的抑制率更高，說明通過茯苓菌的固態(tài)發(fā)酵后，使固態(tài)發(fā)酵物中合成了新的功能因子或者增多了原有的功能因子，也進一步說明了固態(tài)發(fā)酵過程是有很大必要的。

3　結(jié)論

在玉米油脂質(zhì)過氧化試驗、卵黃脂質(zhì)過氧化試驗中，加入固態(tài)發(fā)酵提取液和原料基質(zhì)提取液后，均抑制了玉米油和卵黃的脂質(zhì)過氧化反應，說明了原料基質(zhì)具有抗氧化的功能物質(zhì)，如多糖、總黃酮類等，在前面的試驗中也確實證實了這一點；兩個功能學試驗中，添加固態(tài)發(fā)酵提取液后，對油脂和卵黃的過氧化的抑制情況均優(yōu)于添加原料基質(zhì)提取液組，說明經(jīng)過茯苓菌固態(tài)發(fā)酵得到的固態(tài)發(fā)酵物中確實產(chǎn)生了新的功能因子，或者增多了原來的功能物質(zhì)，才使得其抗氧化作用增強。

參考文獻：

［1］呂國英，范雷法，張作法，等.香菇多糖研究進展［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2009，21（2）：183-188

［2］劉存芳，田光輝，賴普輝.香菇柄中營養(yǎng)成分的開發(fā)與利用綜述［J］.科技信息（科學教研），2008（1）：14-15

［3］陶佳喜，肖全福，陳年友，等.食用菌香菇柄的幾種深加工技術(shù)［J］.資源開發(fā)與市場，2003，19（6）：359-360

［4］翟眾貴，李宏梁，張婷.香辣香菇醬加工工藝的研究［J］.中國調(diào)味品，2014，39（2）：62-66

［5］陳新悅.銀杏類制劑的不良反應［J］.中國藥業(yè)，2007（22）：59-60

［6］郭琦麗，呂武清.山楂葉的研究進展［J］.中國藥業(yè)，2007（22）：60-62

［7］ Ernesto Dalli，Javier Milara，Julio Cortijo，et al.Hawthorn extract inhibits human isolated neutrophil functions［J］.Pharmacological Research，2008，57（6）：445-450

［8］卞云云，李萍.蒙古黃芪中黃酮類成分抗超氧陰離子活性研究及構(gòu)效關(guān)系分析［J］.中國藥學雜志，2008（4）：256-259

［9］王謙，安雪，劉敏.以香菇柄為主料固態(tài)發(fā)酵茯苓菌［J］.食品科技，2014（6）：40-42

［10］李永杰，馬秀琴，冷愛晶.不同采收期山楂葉中總黃酮含量測定［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報2011，13（1）：54-55

［11］楊昕，郭超，李豪，等.基于可見分光光度法的食用油過氧化值檢測［J］.糧油加工，2016（6）：34-39

［12］趙梅，趙立慧，程瑞.分光光度法測定油脂氧化物的過氧化值［J］.中國皮革，2006，35（11）：39-40

［13］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法［S］.北京：中國標準出版社，2003

［14］梁俊，李建科，趙偉，等.石榴皮多酚體外抗脂質(zhì)過氧化作用究［J］.食品與生物技術(shù)學報，2012，31（2）：159-165

［15］張俊會.葛根基質(zhì)下食藥用真菌深層液體發(fā)酵及其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性測定［D］.保定：河北大學，2003

［16］張可煒，徐譽泰，張舉仁，等.銀杏葉和柘樹提取物的抗氧化作用［J］.山東大學學報，2000，35（4）：469-472

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.007

基金項目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團隊（冀農(nóng)科發(fā)［2013］23號）

作者簡介：王謙（1962—），男（漢），研究員，本科，從事食藥用真菌研究與開發(fā)工作。

*通信作者

收稿日期：2015-05-20

Antioxidation of Solid Yeast of Poria Cocos-Roots of Lentinus Edodes-Hawthorn Leaf

WANG Qian，AN Xue，LIU Min

（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

Abstract：According to certain proportion to prepare solid state fermentation medium of root of lentinus edodes and hawthorn leaf as main ingredient，cultivated solid-state fermentation substrates switching tuckahoe，and dryed solid yeast of the full 8 days.By ultrasonic extraction method of poria cocos-roots of lentinus edodeshawthorn leaf solid fermentationcompoungs and medium to extract total flavonoids in raw materials，the total content of flavonoids in the solid state yeast was higner than raw material content of the matrix in contrast.Functional factors such as polysaccharides，flavonoids contained in solid yeast had antioxidant，anti-aging effect. Added adequate amount of solid-state fermentation extract and raw material after matrix obtained by means of pressurized extraction to the corn oil and egg yolk，founded that solid-state fermentation extract of lipid peroxide oxidation resistance was significantly better than the raw material base.So that developed solid-state fermentation to be funtied food will have the very broad development prospects.

Key words：poria cocos；root of lentinus edodes and hawthorn leaf；total flavonoids；lipid peroxidation