祝　強(qiáng)，　董　雋，　王春揚(yáng)，　單立松，　孫　幀，　朱大慶，　洪寶發(fā)

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科,　北京　海淀區(qū)　100853)

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基礎(chǔ)研究

SD大鼠睪丸中PELP1表達(dá)的激素相關(guān)性研究

祝強(qiáng)，董雋，王春揚(yáng)，單立松，孫幀，朱大慶，洪寶發(fā)

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科,北京海淀區(qū)100853)

【摘要】目的：探討PELP1在睪丸組織中的表達(dá)。方法：將21只8周齡SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、去勢(shì)并補(bǔ)充雌激素組。通過(guò)RT-PCR與免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)雌激素水平不同時(shí)，PELP1在睪丸組織中的表達(dá)如下。結(jié)果：PELP1在大鼠睪丸組織中表達(dá)，并且隨著雌激素水平的增高而增高。結(jié)論：PELP1在大鼠睪丸組織中的表達(dá)與雌激素水平正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】雌激素;PELP1;SD去勢(shì)大鼠;睪丸

雌激素具有生物調(diào)節(jié)作用，主要通過(guò)調(diào)節(jié)因子和雌激素受體作用于靶器官，如骨、腦、心及乳腺等。雌激素受體表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，與雌激素結(jié)合，調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成與釋放，影響生殖細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育。雄性動(dòng)物體內(nèi)的雌激素1/3來(lái)源于睪丸。雖然雄性動(dòng)物血液中的內(nèi)源性雌激素濃度較低，但是其在精液中的濃度卻極高，睪丸網(wǎng)液中濃度達(dá)到250ng/L，與雌性動(dòng)物血清中雌二醇相比，濃度明顯偏高。PELP1具有重要調(diào)節(jié)作用，主要用于調(diào)節(jié)雌激素受體和雌激素，參與雌激素的非基因和基因兩種信號(hào)的介導(dǎo)。在子宮、乳腺及腦等多種雌激素靶器官中均可發(fā)現(xiàn)PELP1表達(dá)，其表達(dá)與細(xì)胞生物學(xué)功能相一致，且具有明顯差異性[1]。參與基因信號(hào)通路的PELP1主要于胞核中表達(dá)，PELP1與非基因通路相關(guān)，主要位于胞漿中。非基因通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化及增殖相關(guān)聯(lián)[2]。作為雌激素作用的重要靶點(diǎn)，雌激素調(diào)節(jié)因子PELP1與睪丸組織存在必然聯(lián)系。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步研究，證實(shí)睪丸組織中是否存在PELP1表達(dá)，其表達(dá)與雌激素水平是否相關(guān)，與年齡是否存在差異。

1材料與方法

1.1主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(有康恒業(yè)生物科技(北京)有限公司)、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液(福州邁新)、cDNA合成第一鏈試劑盒(日本Toyobo公司)、胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)、總RNA提取試劑(北京博邁斯科技發(fā)展有限術(shù)公司)、HRP標(biāo)記的羊抗-兔二抗(美國(guó)SouthernBiotech公司)、兔抗-PELP1抗體(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)、免疫組化試劑盒(上海佳和生物科技有限公司)、2×Trans Taq HIFI PCR SuperMixⅡ(北京全式金生物技術(shù)公司)。

1.2組織處理與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:切除實(shí)驗(yàn)大鼠兩側(cè)睪丸，模擬雄性體內(nèi)雌激素水平變化，建立動(dòng)物模型。選取周齡為8的SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只，既為對(duì)照組(A組)、去勢(shì)組(B組)，去勢(shì)后補(bǔ)充雌激素組(C組)。麻醉大鼠，空腹注射3%戊巴比妥鈉1.5mL/kg，對(duì)三組大鼠行開(kāi)腹手術(shù)，僅摘除B、C兩組大鼠的睪丸。對(duì)C組大鼠進(jìn)行皮下注射17β-雌二醇20μg·kg-1·d-1，給予B組大鼠生理鹽水作對(duì)照。術(shù)后對(duì)所有參與實(shí)驗(yàn)的大鼠行常規(guī)飼養(yǎng)16周后，實(shí)施麻醉，摘取新鮮睪丸組織，于4%多聚甲醛液中固定，制作5μm蠟塊切片。所有參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物均來(lái)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)規(guī)范。

1.3睪丸組織細(xì)胞的分離與培養(yǎng):消化法獲得SD大鼠睪丸細(xì)胞。剪取新鮮SD大鼠睪丸組織，浸于含有0.1U/mL膠原酶和1U/mL胰酶的消化液中，孵箱37℃孵育45min。將消化后的組織接種于35mm含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，37℃孵育過(guò)夜。培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)液，去除懸浮組織與細(xì)胞。每3d換液一次，當(dāng)細(xì)胞占瓶底≥80%時(shí)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將睪丸細(xì)胞分為不同雌激素濃度處理組、不同雌激素作用時(shí)間組，并以雌激素抑制劑ICI-182-780為對(duì)照，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中PELP1的表達(dá)。

1.4免疫組織化學(xué):將睪丸組織切片PBS沖洗后，孵育于0.1%胰酶中，37℃孵箱孵育30min。將睪丸細(xì)胞以1×104個(gè)/cm2密度接種于蓋玻片，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，取出蓋玻片，冷丙酮固定20min。免疫染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片或細(xì)胞3%雙氧水沖洗10min，1% TritonX-100預(yù)處理10min，充分沖洗后，一抗孵育(兔抗鼠PELP1,1:1000)，放入濕盒，4℃過(guò)夜。取出細(xì)胞或切片，室溫下復(fù)溫20min，二抗37℃孵育20min(羊抗兔IgG)，PBS沖洗后，DAB染色。顯微鏡觀察。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR:使用總RNA提取試劑盒提取大鼠睪丸細(xì)胞RNA，實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)睪丸細(xì)胞中PELP1的表達(dá)。行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，檢驗(yàn)體系中加入即將得到的cDNA模板，使用實(shí)時(shí)定量?jī)x行Real-time PCR反應(yīng)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)按照SYBR Premix Ex TaqTM II操作說(shuō)明書(shū)。設(shè)計(jì)引物：β-actin：5’- CCTGGATAGCAACGTACATGG-3；5’- ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’。PELP1：5’- TCACTGCCGAGAGACCCCCG-3’；5’- GGAAGATGGCGGCAGCCGTT-3’、

1.6Western-blot:胰酶消化法收集睪丸細(xì)胞，PBS沖洗后，置于RIPA裂解液中，冰上孵育10min，使細(xì)胞充分裂解，按照Beyotime細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明，提取細(xì)胞全蛋白，并測(cè)定其濃度，所選用的試劑盒為Bradford試劑盒。在100℃的術(shù)中加入5×loading buffer，煮5min使變性。由于蛋白上樣量為40μg，所以用1×loading buffer按照40～30 μL進(jìn)行蛋白調(diào)整，保證其相同體積，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。按預(yù)染的Marker切取所需目的條帶，切割范圍包含目的蛋白。轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，ECL顯影，放入培清JS-860A自動(dòng)凝膠成像儀曝光。

1.7PELP1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):光學(xué)顯微鏡視野下，選取PELP1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，數(shù)碼相機(jī)拍照，導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，使用LUCIA G圖像分析軟件，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。保證每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次。通過(guò)SPSS 12.0軟件的使用對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用“Tukey檢驗(yàn)”進(jìn)行多組間兩兩比較；采用“一維方差分析”進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1檢測(cè)血清雌激素水平:手術(shù)前和接受雌激素治療18周后，OVX大鼠接受雌激素水平如下表。A組與C組之間無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)；與A和C組相比，B組血清雌激素水平明顯偏低(P<0.05)，(見(jiàn)表1)。

2.2PELP1在大鼠睪丸中的表達(dá):陽(yáng)性對(duì)照組為大鼠子宮(圖1)，在大鼠睪丸組織中可見(jiàn)PELP1表達(dá)，PELP1為棕色顆粒，在胞核胞漿中可見(jiàn)均(圖2)，胞漿表達(dá)最多(圖3)。

圖1

圖2

圖3

行免疫組化染色，記錄每組組織切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(平均陽(yáng)性細(xì)胞率±標(biāo)準(zhǔn)差)。本文研究結(jié)果顯示，雌激素水平不同時(shí)，PELP1陽(yáng)性細(xì)胞率亦存在區(qū)別，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OVX組

2.3雌激素上調(diào)PELP1在大鼠睪丸細(xì)胞中的表達(dá):與對(duì)照組相比，睪丸細(xì)胞中PELP1在雌激素刺激下的表達(dá)升高(Fig.3A3B)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，睪丸細(xì)胞中PELP1的表達(dá)隨著雌激素作用濃度的提高而表達(dá)增加(Fig.3D)，隨著雌激素作用時(shí)間的增加而表達(dá)增加(Fig.3C)，與雌激素的濃度、時(shí)間刺激呈正相關(guān)。

3討論

內(nèi)源性雌激素是雄性生殖細(xì)胞存活因子的一種，在雄性動(dòng)物體內(nèi)，內(nèi)源性雌激素主要來(lái)自局部細(xì)胞的自分泌和旁分泌[3]。內(nèi)源性雌激素主要存在于雄性動(dòng)物的精液中，且濃度較高，在睪丸網(wǎng)液中達(dá)250ng/L，與雌性動(dòng)物血清中雌二醇的濃度相比，明顯偏高。睪丸內(nèi)的雌激素主要由芳香化酶催化產(chǎn)生，而芳香化酶的基因突變會(huì)使男性睪丸小或隱睪、生精細(xì)胞缺如、無(wú)精子或精子密度顯著降低、死精等癥狀。

研究表明，睪丸中雌激素受體高表達(dá)，雌激素與雌激素受體形成復(fù)合體，間接影響生殖器的發(fā)育和發(fā)生，直接參與睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的釋放與合成，調(diào)節(jié)睪丸的生殖功能[4]。雌激素受體具有調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)途徑主要有兩種：非基因通路和基因通路，參與細(xì)胞的凋亡、增殖和生長(zhǎng)，以及雌激素相關(guān)的組織保護(hù)功能相關(guān)。實(shí)驗(yàn)已證明雌激素受體基因敲除的小鼠，出生后睪丸正常，但青春期睪丸開(kāi)始變性，成年后睪丸萎縮，精子發(fā)生障礙和精子密度顯著降低并不育。

PELP1在雌激素靶器官中廣泛存在與表達(dá)[5]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)PELP1的不同表達(dá)與定位，使PELP1發(fā)揮不同的雌激素受體調(diào)節(jié)作用。PELP1在在胞膜與胞漿中少量存在，在腦組織中與ER共表達(dá)胞核。在肌細(xì)胞和表皮細(xì)胞中，ER僅與PELP1共同定位于胞核，胞漿中無(wú)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PELP1主要表達(dá)于睪丸細(xì)胞胞漿中，提示PELP1的表達(dá)具有細(xì)胞特異性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)睪丸中PELP1蛋白與雌激素的相關(guān)性：①PELP1蛋白的表達(dá)與雌激素直接相關(guān)；②雌激素在基因與蛋白水平上調(diào)PELP1的表達(dá)；③PELP1的表達(dá)與雌激素的作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)，由此可知PELP1可能與睪丸細(xì)胞凋亡、增殖及生長(zhǎng)有關(guān)，對(duì)睪丸組織可能具有保護(hù)作用。

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【基金項(xiàng)目】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院苗圃基金面上項(xiàng)目，(編號(hào)：15MM39)

【文章編號(hào)】1006-6233(2016)06-0986-03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.040