王 毅，王 炯

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鉤吻HPLC指紋圖譜研究及來(lái)源分析

王 毅1，王 炯2

（1.貴陽(yáng)市公安局，貴陽(yáng) 550007；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

ABATRACT： Objective To establish HPLC fi ngerprint of gelsemium for its different source analysis. Methods 9 batches of gelsemium collected from Guangxi， Hubei， Zhejiang and Fujian provinces were studied on their similarities. HPLC method was employed with Welchrom C18 column， and a mixture liquid of acetonitrile （A） and 0.025% trimethylamine （B） as mobile phase in a gradient elution （0 min， 0.5%A； 5 min， 1%A； 10 min， 3%A； 15 min， 8%A； 20 min， 15%A； 40 min， 30%A； 46 min，36%A； 60 min， 65%A）， at a fl ow rate of 1.0 mL/min， column temperature of 30℃ and detection wavelength of 272 nm. 1 g of gelsemium plant sample was boiled in 45 mL of water for 2 hours and was concentrated by vortex fi ltration through a 0.45 μm microporous membrane. The HPLC fi ngerprints were analyzed in cluster. The sample precision， repeatability and stability were tested for at least 6 times. Results The HPLC fi ngerprint method was established with good precision， repeatability and stability， effective for the principal component analysis and cluster analysis of different-origin samples of gelsemium. 9 groups of gelsemium from different origin could be broadly divided into four categories. Gelsemium of varied sources differs in its intrinsic chemical composition， showing a different classifi cation in SPSS. Conclusions The HPLC fi ngerprint technology could provide the basis for the source analysis of gelsemium plants in vitro. Further characteristic study of the indicators is required in order to establish a more comprehensive and accurate evaluation method when involvement in poisoning cases.

摘要：目的 運(yùn)用鉤吻HPLC指紋圖譜分析方法對(duì)其不同產(chǎn)地來(lái)源進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方法 取鉤吻藥材1 g，加45 mL水，煎煮2 h，搖勻過(guò)濾，進(jìn)樣量10 μL，色譜條件采用Welchrom C18 柱，洗脫流動(dòng)相：乙腈（A）-0.025%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫（0 min，0.5%A； 5 min，1%A；10 min，3%A；15 min，8%A；20 min，15%A；40 min，30%A；46 min，36%A；60 min，65%A），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm。分別測(cè)定9批鉤吻的樣本圖譜，對(duì)其進(jìn)行聚類分析和相似度分析。結(jié)果 建立了鉤吻的指紋圖譜測(cè)定方法，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。利用該方法對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源樣品進(jìn)行主成分和聚類分析，結(jié)果顯示9批不同產(chǎn)地的鉤吻藥材成分大致可分為四類，不同產(chǎn)地來(lái)源的鉤吻其內(nèi)在化學(xué)成分均有差異，呈現(xiàn)出不同的分類。結(jié)論 指紋圖譜技術(shù)可為判斷體外鉤吻不同產(chǎn)地來(lái)源提供分類依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鉤吻；HPLC指紋圖譜；來(lái)源分析

指紋圖譜是指樣本經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖，是一種綜合的，可量化的鑒定手段，其中在中藥材質(zhì)量控制運(yùn)用尤為廣泛。而現(xiàn)今法醫(yī)毒理學(xué)對(duì)司法鑒定結(jié)果解釋的進(jìn)一步要求，不僅僅是單一化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，還應(yīng)包括來(lái)源、因果關(guān)系等方面［1］。中藥指紋圖譜技術(shù)對(duì)于植物化學(xué)成分采取“整體的”、“模糊的”方法來(lái)進(jìn)行分析［2］，法醫(yī)毒物檢驗(yàn)擬在共性中通過(guò)聚類分析差異，又可對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的植物進(jìn)行甄別，從而判斷毒物來(lái)源，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行血清藥物化學(xué)的分析，更能對(duì)中毒人員吸收方式、時(shí)間、效果（即因果關(guān)系）進(jìn)行分析。鉤吻為馬錢科（Loganiaceae）植物斷腸草（Gelsemium elegans Benth）的全株植物，分布于江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東、海南、廣西、貴州、云南等省區(qū)，主要成分為生物堿，案件中常見(jiàn)因誤食或投放造成中毒乃至死亡［3，4］。劉鑄晉等［5］從鉤吻中分離出八種生物堿，以鉤吻素子和鉤吻堿甲含量最高。本文對(duì)鉤吻進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）植物指紋圖譜研究，在樣本共性基礎(chǔ)上尋求差異，摸索判斷毒物產(chǎn)地來(lái)源的方法，更進(jìn)一步為法醫(yī)毒理學(xué)毒物來(lái)源判斷提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200HPLC（Agilent，美國(guó)），MS-105DU（Mettler，瑞士），鉤吻堿甲標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99%），鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99%）。乙腈為色譜純（Merck，德國(guó)），去離子水（密理博）；其余均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.025%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫（0 min，0.5%A；5 min，1%A；10 min，3%A；15 min，8%A；20 min，15%A；40 min，30%A；46 min，36%A；60 min，65%A），流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣本

樣本：采集9批不同來(lái)源的鉤吻植物樣本（見(jiàn)表1），經(jīng)鑒定為馬錢科（Loganiaceae）植物斷腸草（Gelsemium elegans Benth）（胡蔓藤）的全株植物?；旌蠈?duì)照品溶液制備：取鉤吻堿甲4.721 mg，鉤吻素子5.383 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即得。供試品溶液制備： 水煎煮供試品溶液的制備方法如下：取鉤吻藥材（過(guò)60目篩）約1 g，精密稱定，置燒杯中，精密加入45 mL水，稱定重量，煎煮2 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻過(guò)濾，再過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2 結(jié) 果

2.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取10μL供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。以鉤吻素子為參照峰，考察共有峰相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和相對(duì)峰面積（RPA）的一致性，結(jié)果RSD均小于1.9%，精密度試驗(yàn)相關(guān)系數(shù)R均大于0.9，符合要求。

表 1 鉤吻植物采集信息表Table 1 Collection information of gelsemium plant

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（n=6），照“1.2”項(xiàng)下條件測(cè)定。以鉤吻素子為參照峰，考察共有峰RRT、RPA的一致性，結(jié)果RSD均小于3%，重復(fù)性試驗(yàn)相關(guān)系數(shù)R均大于0.9，結(jié)果表明重復(fù)性良好，符合要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下條件在0、2、4、8、12、16、24 h 7個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測(cè)定。以鉤吻素子為參照峰，考察共有峰的RRT、RPA穩(wěn)定性，結(jié)果RSD均小于3%，穩(wěn)定性試驗(yàn)相關(guān)系數(shù)R均大于0.9，結(jié)果表明溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 鉤吻藥材HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果

采用藥典中《指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，9批樣本匹配圖結(jié)果如圖1所示，相似度結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，1、2、3、4和8號(hào)鉤吻藥材相似度大于0.9，5和6號(hào)鉤吻藥材相似度大于0.9，7號(hào)、9號(hào)鉤吻藥材與其他產(chǎn)地藥材相似度均較低。

2.5 主成分分析與聚類分析

研究中，以主成分峰面積為變量，研究鉤吻的聚類情況，主成分分析的結(jié)果如圖2左所示。7號(hào)、9號(hào)遠(yuǎn)離其它鉤吻藥材，說(shuō)明二者的化學(xué)成分與其它藥材有很大不同，這與上述相似度分析結(jié)果相近。從圖1峰面積比較中可看出，7號(hào)樣品特征峰中除1號(hào)色譜峰外，其余色譜峰峰面積均較其他樣品峰面積小，且由圖1可知，7號(hào)樣品在18～25 min時(shí)間段出現(xiàn)了一些特有的色譜峰。同樣，9號(hào)樣品1～3號(hào)色譜峰峰面積與其他樣品相差不多，4～8號(hào)色譜峰峰面積均較其他樣品的小，所以7號(hào)和9號(hào)樣品與其他樣品有明顯差別，且7號(hào)和9號(hào)差異也較大。其他樣品又可大致分為三類：1、2號(hào)樣品距離近；3、4、5號(hào)樣品距離近；6、8號(hào)樣品距離接近。

圖 1 9批樣本指紋圖譜重疊圖。S1：廣西玉林；S2：廣西河池；S3：廣西玉林；S4：湖北武漢；S5：浙江杭州；S6：福建福州；S7：貴州興義；S8：貴州凱里； S9：貴州都勻；R：共有模式。Fig.1 HPLC fi ngerprints of 9 batches of plant samples. S1： Yulin， Guangxi； S2： Hechi， Guangxi； S3： Yulin， Guangxi； S4： Wuhan， Hubei；S5： Hangzhou， Zhejiang； S6： Fuzhou， Fujian； S7： Xingyi， Guizhou； S8： Kaili， Guizhou； S9： Duyun， Guizhou； R： common mode.

表 2 9批樣本的相似度結(jié)果Table 2 The similarity analysis of 9 batches of plant samples

圖 2 9批鉤吻藥材主成分分析結(jié)果（左）和聚類分析樹狀圖（右）Fig.2 Principal component analysis of 9 batches of plant samples （left） and their cluster analysis tree （right）

SPSS數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)9批鉤吻樣本進(jìn)行聚類分析，以樣本的共有峰面積為主要特征，用離差平方和法，按歐氏距離對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析（見(jiàn)圖2右）。結(jié)果顯示，9批不同產(chǎn)地的鉤吻藥材成分大致可分為四類：5和6為一類，7號(hào)、9號(hào)各為一類，其余樣品為一類。由聚類分析結(jié)果可知：不同產(chǎn)地來(lái)源的鉤吻其內(nèi)在化學(xué)成分均有差異，因此呈現(xiàn)出不同的分類，可用于案件中毒物不同產(chǎn)地來(lái)源類別分析。

3 討 論

3.1 色譜方法優(yōu)選

試驗(yàn)考察在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在272 nm下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜信息豐富，且各色譜峰峰面積較大；甲醇-水、乙腈-水和乙腈- 0.025%三乙胺水溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng)相比較，乙腈-水系統(tǒng)得到的色譜圖色譜峰形、數(shù)目?jī)?yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，且主要成分是生物堿［6-8］，故在水相中加入適量三乙胺調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示，峰形有明顯的改善，最終選擇乙腈- 0.025%三乙胺系統(tǒng)作為流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)；試驗(yàn)比較了25℃、30℃、35℃、40 ℃的色譜圖，結(jié)果表明當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，所得色譜峰峰形對(duì)稱性、峰分離度均較好，且基線平穩(wěn)；通過(guò)反復(fù)調(diào)整乙腈和0.025%三乙胺水溶液的洗脫比例，最終洗脫程序如“1.2”項(xiàng)下所示，該條件下各共有峰均能與相鄰峰達(dá)到基線分離，且峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適中。試驗(yàn)分別使用Diamonsil C18、Agilent C18、Welchrom C18（規(guī)格均為4.6 × 250 mm，5 μ m）三種不同的色譜柱進(jìn)樣，結(jié)果表明采用Welchrom C18柱所得到的色譜信息豐富，各峰的保留值適宜，分離度、峰形及柱效較好，故選擇Welchrom C18柱進(jìn)行測(cè)定。

3.2 聚類分析

聚類分析目標(biāo)是在相似的基礎(chǔ)上收集數(shù)據(jù)來(lái)分類，與普通分類不同在于要求劃分的類是未知的，本次研究樣本真實(shí)情況未知，應(yīng)采用此法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，研究結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的鉤吻其內(nèi)在化學(xué)成分均有差異，因此呈現(xiàn)出不同的分類。分類結(jié)果與主成分分析分類結(jié)果相似，即7號(hào)、9號(hào)藥材各自為一類。這是由于7號(hào)、9號(hào)樣本多數(shù)峰峰面積較其他樣品峰面積小，而7號(hào)藥材在18～25 min時(shí)間段有一些特有的色譜峰，故有上述分類結(jié)果。但通過(guò)聚類分析和通過(guò)主成分分析所得分類結(jié)果也存在一定差異，主成分分析8號(hào)樣品距離1～6號(hào)較遠(yuǎn)，而聚類分析中8號(hào)樣品卻和1～4號(hào)歸為了一類，這提示對(duì)實(shí)際樣本的來(lái)源判斷應(yīng)綜合考慮主成分和峰面積因素，尤其是在混合樣本中對(duì)雜峰分離問(wèn)題對(duì)測(cè)定的影響，或考慮采用專屬性更高的檢測(cè)器。

3.3 不同產(chǎn)地的變化

根據(jù)“2.5”項(xiàng)下對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源鉤吻的主要成分及聚類分析結(jié)果顯示，同省份（如貴州）鉤吻在主成分方面就有著較大差異，大致相同的氣候不同的地貌可能是影響其主要成分形成的因素，而不同省份樣本（湖北與浙江）卻在主成分分析中基本一致，雖然植物每年在生長(zhǎng)過(guò)程中一定程度上會(huì)受環(huán)境變化影響，但是其主要成分變化相對(duì)恒定，可以作為初步判斷毒物來(lái)源的聚類分析依據(jù)，如能準(zhǔn)確定位差異性、指標(biāo)性成分，且對(duì)吸收入血后的移行成分進(jìn)行篩查，更能對(duì)毒物進(jìn)入體內(nèi)前的產(chǎn)地來(lái)源判斷提供依據(jù)，從而對(duì)實(shí)際法醫(yī)毒理學(xué)工作提供幫助。

3.4 樣本批次代表性對(duì)數(shù)據(jù)分析影響

由于試驗(yàn)對(duì)象非規(guī)?；N植或生產(chǎn)植物，僅收集到5個(gè)省份9批次樣本，未達(dá)到中藥指紋圖譜對(duì)批次的要求，測(cè)定數(shù)據(jù)由此應(yīng)會(huì)出現(xiàn)一些“極端”情況，采取中位數(shù)法計(jì)算相似度，以扣除偏大或偏小數(shù)據(jù)的影響，同時(shí)在“共性”之外對(duì)數(shù)據(jù)“差異”的個(gè)體甄別達(dá)到來(lái)源區(qū)分才是試驗(yàn)最終目的。

4 結(jié) 論

通過(guò)HPLC指紋圖譜研究方法，建立鉤吻的HPLC測(cè)定條件，可用于對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源鉤吻樣本進(jìn)行聚類分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同產(chǎn)地來(lái)源樣本具有一定的差異性，對(duì)類似于劇毒動(dòng)植物這樣的具有復(fù)雜成分或基質(zhì)的樣本，由于不同“因素”造成的差異性可以用于反向追查，進(jìn)一步對(duì)經(jīng)過(guò)體內(nèi)過(guò)程后的變化研究，可以發(fā)現(xiàn)更多如吸收途徑、攝入方式等不同類別的差異性。另一方面，本實(shí)驗(yàn)一定程度上反映不同產(chǎn)地來(lái)源的不同，但進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷仍需通過(guò)進(jìn)一步研究尋找到特征指標(biāo)（如不同成分、含量），并建立一套更為全面準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法［9］，從而對(duì)中毒案件中所涉及樣本進(jìn)行準(zhǔn)確來(lái)源推斷。

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中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-3650（2016）01-0050-04

收稿日期：2015-10-13

基金項(xiàng)目：公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（201301ZDYJ007）

作者簡(jiǎn)介：王 毅，工程師，碩士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)。 E-mail： 18712664@qq.com

HPLC Fingerprint of Gelsemium and Its Source Analysis

WANG Yi1， WANG Jiong2（1. Guiyang Public Security Bureau， Guiyang 550001， China； 2.Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security， Beijing 100038， China）

KEY WORDS：gelsemium； HPLC fi ngerprint； analysis of source