韓慰，蔣莉，何蓉，宋曉潔，程莉

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014）

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口服補(bǔ)液鹽降低氯化鋰-匹羅卡品驚厥持續(xù)狀態(tài)大鼠死亡率的研究

韓慰，蔣莉*，何蓉，宋曉潔，程莉

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014）

【摘要】目的 探討通過(guò)胃管灌胃改良口服補(bǔ)液鹽（oral rehydration salts，ORS）降低氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)驚厥持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）模型的死亡率的方法。方法 選用成年組（60 d）SD大鼠30只和幼年組（20 d）SD大鼠45只，隨機(jī)分為成年SE+ORS組、成年SE組、幼年SE+ORS組、幼年SE組、幼年血糖組各15只。經(jīng)腹腔注射氯化鋰和匹羅卡品，誘發(fā)大鼠驚厥發(fā)作，驚厥60 min后，給予安定止驚。各ORS組于SE后1、12、24 h根據(jù)不同年齡予以不同劑量改良ORS灌胃。其余各組不給予處理。記錄實(shí)驗(yàn)大鼠驚厥發(fā)作情況，驚厥前后體重變化及死亡情況；血糖測(cè)定組于SE后8 h取血檢測(cè)血糖，探索降低該模型死亡率的方法。結(jié)果 （1）各組驚厥后體重均降低，約占體重的5% ～8%。（2）氯化鋰-匹羅卡品驚厥持續(xù)狀態(tài)模型死亡率較高，幼年組40.00%，成年組57.14%；死亡發(fā)生時(shí)間集中在驚厥后24 h內(nèi)，72 h后死亡數(shù)趨于平穩(wěn)。（3）SE后實(shí)驗(yàn)大鼠血糖明顯降低，給予ORS液灌胃后，血糖趨于正常水平。（4）以改良ORS灌胃后，幼年組和成年組72 h內(nèi)死亡率明顯降低。結(jié)論 SE后改良ORS液灌胃有效改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率，是有效提高其生存率的方法。

【關(guān)鍵詞】氯化鋰-匹羅卡品；驚厥持續(xù)狀態(tài)模型；大鼠；死亡率

氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)模型具有與人類顳葉癲癇相似的行為和腦電圖改變，是研究驚厥持續(xù)狀態(tài)較為理想的動(dòng)物模型。由于驚厥持續(xù)狀態(tài)要求足夠長(zhǎng)的發(fā)作時(shí)間，實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率高，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從匹羅卡品劑量的選擇、使用M膽堿能樣受體拮抗劑進(jìn)行預(yù)處理、采用不同止驚劑適時(shí)中止發(fā)作等方面對(duì)該模型進(jìn)行改良［1-4］，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性期死亡率仍可高達(dá)55%［5］。

目前的改良方法多集中在驚厥發(fā)作期如何止驚，而在驚厥后處理方面研究甚少。驚厥持續(xù)狀態(tài)可造成全身缺氧致代謝性酸中毒、糖代謝紊亂、脫水、窒息等病理生理改變。驚厥持續(xù)狀態(tài)大鼠予以止驚劑后處于昏睡狀態(tài)，而清醒后活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、精神欠佳，進(jìn)食能力減弱、體重明顯減少。我們認(rèn)為這可能是造成驚厥后急性期大鼠死亡的重要原因。因此，驚厥后處理對(duì)降低其死亡率有重要意義。

口服補(bǔ)液鹽（oral rehydration salts，ORS），簡(jiǎn)稱ORS液。本實(shí)驗(yàn)用改良的ORS液糾正大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)后水鹽代謝紊亂，補(bǔ)充血糖，探討能否降低急性期實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

20日齡SPF級(jí)雄性 SD大鼠75只，其中，體重在35～52 g的45只；體重在180～230 g的30只，均來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK（渝）2012-0001】，在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行【SYXK（渝）2012-0015】。

根據(jù)大鼠日齡和SE后是否用改良ORS處理采用隨機(jī)數(shù)字法分為以下5個(gè)組：成年 SE+ORS組、成年SE組、幼年SE+ORS組、幼年SE組、幼年血糖測(cè)定組各15只。其中血糖測(cè)定組又分3個(gè)亞組，分別是正常對(duì)照組、SE組、SE+0RS組各5只。

1.1.2 試劑

氯化鋰、匹羅卡品（美國(guó) Sigma-Aldrich公司）；硫酸阿托品、安定（天津金耀氨基酸有限公司）；口服補(bǔ)液鹽III（ORS）液（西安安健藥業(yè)有限公司），每袋成分：氯化鈉0.65 g、枸櫞酸納0.725 g、氯化鉀0.375 g、無(wú)水葡萄糖3.375 g。實(shí)驗(yàn)用改良配方：葡萄糖10 g+1袋ORS+250 mL蒸餾水。

1.2 模型建立方法

采用氯化鋰-匹羅卡品建立驚厥持續(xù)狀態(tài)模型，幼年組（20 d）、成年組均在腹腔注射氯化鋰 127 mg/kg，18～20 h后，分別采用腹腔注射匹羅卡品30、50 mg/kg。按照 Racine［6］分級(jí)法進(jìn)行驚厥分級(jí)，當(dāng)發(fā)作達(dá)到IV級(jí)或V級(jí)并持續(xù)60 min為驚厥持續(xù)狀態(tài)，驚厥發(fā)作15 min后腹腔注射硫酸阿托品（10 mg/kg）拮抗其M膽堿能樣作用，發(fā)作60 min后給予安定（10 mg/kg）止驚。腹腔注射匹羅卡品30 min后，未達(dá)到IV級(jí)發(fā)作者，等量追加1次，若仍未達(dá)到IV級(jí)發(fā)作者退出實(shí)驗(yàn)。血糖組的對(duì)照組，予以腹腔注射等量生理鹽水。

幼年和成年SE+ORS組的實(shí)驗(yàn)大鼠均于SE后1，12，24 h以改良ORS液灌胃，劑量分別以每只0.5、2.0 mL。血糖（SE+ORS）組于SE后1 h灌胃改良ORS液，劑量為每只0.5 mL。其余實(shí)驗(yàn)大鼠不給予該處理。SE前后各組均用普通飼料喂養(yǎng)。記錄各組實(shí)驗(yàn)大鼠驚厥前后體重及發(fā)作情況，分別以SE后1、12、24、48、72、96、120 h等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)。血糖組于SE后12 h采用眼底靜脈取血方法取血約1 mL，然后離心取血清送本院檢驗(yàn)科檢測(cè)血糖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SSPS17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率采用卡方檢驗(yàn)，驚厥前后體重均值比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

腹腔注射匹羅卡品后，各組實(shí)驗(yàn)大鼠均出現(xiàn)相似的表現(xiàn)，即不同程度的膽堿能反應(yīng)：流涎、稀便、結(jié)膜充血出血、全身濕潤(rùn)等；以及不同程度的癇性發(fā)作表現(xiàn)：早期出現(xiàn)豎毛、搔抓癥狀，后出現(xiàn)面部抽搐、節(jié)律性點(diǎn)頭和咀嚼，繼之出現(xiàn)雙側(cè)前肢抬起陣攣，全身強(qiáng)直陣攣伴站立和跌倒、翻滾甚至尖叫等。

2.1 驚厥發(fā)作情況

各組大鼠均在匹羅卡品注射后30 min左右達(dá)到Ⅴ級(jí)發(fā)作。幼年組注射安定后1～11 min完全止驚，成年組約在給藥后1～28 min終止發(fā)作。各組驚厥發(fā)作情況詳見(jiàn)表1。幼年SE+ORS組有1只實(shí)驗(yàn)大鼠在達(dá)到V級(jí)發(fā)作后持續(xù)20 min后死亡，成功建模14只。幼年SE組15只實(shí)驗(yàn)大鼠均造模成功。成年SE+ORS組成年造模13只，其中1只在達(dá)到V級(jí)發(fā)作后27 min后死亡，另1只實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射匹羅卡品后出現(xiàn)搔抓、點(diǎn)頭癥狀，但30 min后未達(dá)到IV級(jí)發(fā)作，等量追加1次，30 min后仍未達(dá)到IV級(jí)發(fā)作故退出實(shí)驗(yàn)。成年SE組有1只大鼠達(dá)到Ⅴ級(jí)發(fā)作后持續(xù)38 min后死亡，成功造模14只。血糖測(cè)定組10只幼年大鼠造模成功。

2.2 體重變化

各組實(shí)驗(yàn)大鼠驚厥前后體重均減輕（詳見(jiàn)表2），幼年組減輕占驚厥前體重的7% ～8%，成年組體重減輕驚厥前體重的5%左右。造模前后體重差異有顯著性（P＜0.001）。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作情況（±s）Tab.1 Status epilepticus in the experimental rats

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作情況（±s）Tab.1 Status epilepticus in the experimental rats

組別Groups動(dòng)物數(shù)Number of rats驚厥潛伏時(shí)間/min Seizure latency未成功誘發(fā)驚厥數(shù)Number of onset failure達(dá)到IV級(jí)發(fā)作未持續(xù)60 min Number of rats lasting ＜60 min安定控制驚厥發(fā)作時(shí)間/min Time of seizure controlled by diazepam成功建模數(shù)Number of successful models幼年SE+ORS組Young SE+ORS　15　30.08±9.42　0　1　5.84±2.84　14幼年SE組Young SE　15　30.65±8.43　0　0　5.74±2.35　15成年SE+ORS Adult SE+ORS　15　41.21±16.64　1　1　12.45±9.44　13成年SE組Adult SE　15　39.04±17.03　0　1　12.07±9.32　14血糖組Blood glucose　10　36.06±9.95　0　0　6.01±2.83　10

表2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驚厥前后體重變化情況（±s）Tab.2 Changes of body weight of the rats before and after status epilepticus

表2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驚厥前后體重變化情況（±s）Tab.2 Changes of body weight of the rats before and after status epilepticus

注：*驚厥前體重與驚厥后體重相比，P＜0.001。Note.*P＜0.001，comparison between the body weights before and after seizure.

組別Groups驚厥前體重/g Body weight before seizure驚厥后體重/g Body weight after seizure減少體重/g Body weight loss減少體重占驚厥前體重百分比/% Body weight loss/ b.w.before seizure幼年SE+ORS組Young SE+ORS　41.62±3.34　38.72±3.12*　2.96±0.94　7.11幼年SE組Young SE　41.60±4.46　38.23±4.31*　3.36±0.88　8.09成年SE+ORS組Adult SE+ORS　212.09±20.65　200.46±21.79*　10.38±6.74　4.94成年SE組Adult SE　221.70±21.87　210.11±21.43*　11.59±6.18　5.23

2.3 死亡情況

SE后1、12、24、48、72、96、120 h等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)、記錄死亡時(shí)間及死亡率。幼年組共死亡7只，成年組共死亡10只。幼年SE +ORS組和成年SE+ORS組死亡率分別為7.14%和15.38%，明顯低于幼年SE組、成年SE組。另外，幼年SE組與SE+ORS組、成年SE組與SE+ ORS組之間死亡率差異具有顯著性（P＜0.05），各組實(shí)驗(yàn)大鼠死亡情況及死亡率見(jiàn)表3。

表3 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況Tab.3 Mortality of the experimental animals

2.4 血糖水平

SE組血糖（4.69±0.59 mmol/L）較對(duì)照組（9.37±3.09 mmol/L）明顯降低，與對(duì)照組差異具有顯著性（P＜0.01）；SE+ORS組（7.12±2.13 mmol/L）血糖高于SE組、稍低于正常對(duì)照組，與對(duì)照組血糖差異無(wú)顯著性（P＞0.05），與SE組血糖差異具有顯著性（P＜0.05）。

3 討論

驚厥持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE），是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)危重癥，可導(dǎo)致驚厥性腦損傷，繼發(fā)癲癇、認(rèn)知障礙等后遺癥。目前臨床上尚沒(méi)有有效的觀察指標(biāo)和方法，主要借助于對(duì)動(dòng)物驚厥模型的研究。氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)模型是公認(rèn)的較理想的動(dòng)物模型。

本研究中，幼年組死亡率達(dá)到40%，成年組甚至達(dá)57.4%。這對(duì)需要觀察驚厥后遠(yuǎn)期實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的研究造成了較大的工作量、較高的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，且實(shí)驗(yàn)一致性較低。

目前的改良方法多集中在驚厥發(fā)作期如何止驚，而在驚厥后處理方面研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管應(yīng)用阿托品拮抗M膽堿能作用，成年組體重減輕量從胡越等［2］研究發(fā)現(xiàn)的每只30～50 g減少至10 ～20 g，但是體重仍然是明顯減少的，約占體重的5%，而幼年組減少量甚至占體重7% ～8%。從實(shí)驗(yàn)大鼠驚厥發(fā)作時(shí)腺體分泌增加，出現(xiàn)流涎、稀便、全身毛濕潤(rùn)等表現(xiàn)可見(jiàn)，驚厥持續(xù)狀態(tài)后大鼠體重減輕最可能是由于體液丟失造成。而機(jī)體處于脫水、電解質(zhì)紊亂的病理狀態(tài)，這可能是SE后急性期實(shí)驗(yàn)大鼠死亡的原因之一，因此SE后給予補(bǔ)液對(duì)提供大鼠生存率具有重要意義。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是幼年組還是成年組SE后死亡發(fā)生時(shí)間多集中在SE后72 h內(nèi)，尤其是SE 后24 h內(nèi)，與王東梅等［7］的報(bào)道一致。由于幼年較成年大鼠驚厥易感且耐受性更好，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)幼年大鼠SE后8 h血糖情況作了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SE后實(shí)驗(yàn)大鼠血糖水平較正常對(duì)照組明顯降低。我們認(rèn)為雖然SE后有效止驚，但是一方面實(shí)驗(yàn)大鼠精神尚未恢復(fù)，另一方面由于強(qiáng)直陣攣發(fā)作時(shí)間長(zhǎng)，有些實(shí)驗(yàn)大鼠自主活動(dòng)嚴(yán)重受損，在SE后24 h內(nèi)進(jìn)食能力減弱造成低血糖可能是死亡原因之一。

ORS液是臨床上較常用的口服補(bǔ)液鹽，對(duì)輕、中度脫水，補(bǔ)充鈉、鉀、氯、具有治療作用。改良的ORS液即加入葡萄糖，配置成5%葡萄糖-ORS液，在SE后1，12，24 h根據(jù)不同年齡大鼠的胃內(nèi)容量給予不同劑量灌胃后發(fā)現(xiàn)：（1）SE后以改良ORS液灌胃可以有效升高SE后血糖水平，甚至接近正常水平。（2）SE后給予改良ORS液補(bǔ)液可以降低實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率，幼年組降至7.14%，成年組降至15.38%，顯著低于 Goodman等［8］發(fā)現(xiàn)的通過(guò)改良該模型止驚方法后的死亡率45%。本改良方法并沒(méi)有改變?cè)撃Ｐ偷牟±砘A(chǔ)，Lemos等［9］認(rèn)為大劑量匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇狀態(tài)持續(xù)60 min者，100%產(chǎn)生反復(fù)自發(fā)性癲癇，盡管張小東等［4］通過(guò)重復(fù)低劑量注射匹羅卡品降低死亡率9.7%，接近本研究結(jié)果，但慢性癲癇的發(fā)生率卻低于該模型。（3）改良ORS液主要改善SE后實(shí)驗(yàn)大鼠急性期（72 h）死亡情況，尤其是48 h之內(nèi)，48 h之后，實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)食能力基本恢復(fù)。

因此，氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)模型中，除了重復(fù)低劑量注射匹羅卡品、聯(lián)用膽堿受體拮抗劑以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇適當(dāng)?shù)闹贵@劑來(lái)提高大鼠存活率以外，對(duì)SE后糾正水電解質(zhì)平衡的紊亂，預(yù)防低血糖對(duì)降低實(shí)驗(yàn)大鼠SE后急性期死亡率具有重要意義。SE后24 h內(nèi)用改良ORS液灌胃能有效改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率，是有效提高其生存率的方法。

參考文獻(xiàn)

［1］ Glien M，Brandt C，Potschka H，et al.Repeated low-dose treatment of rats with pilocarpine：low mortality but high proportion of rats developing epilepsy［J］.Epilepsy Res，2001，46（1）：111 -119.

［2］ 胡越，蔣莉.控制氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的實(shí)驗(yàn)研究［J］.兒科藥學(xué)雜志，2003，9（4）：5-8.

［3］ 陳子怡，陳樹達(dá)，周玨倩，等.匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的改良和鑒定［J］.解剖學(xué)研究，2011，33（2）：131-134.

［4］ 張小東，黃敏，許可，等.氯化鋰-重復(fù)低劑量匹羅卡品致大鼠癲癇模型制作［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，33（1）：63 -65.

［5］ Curia G，Longo D，Biagini G，et al.The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy［J］.Neurosci Methods，2008，172（2）：143-157.

［6］ Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure［J］.Electroenceph Clin Neurophysiol，1972，32（3）：281-294.

［7］ 王冬梅，孫藝平，徐靜，等.降低氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型死亡率的實(shí)驗(yàn)研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2010，32 （2）：177-178.

［8］ Goodman JH.Experimental models of status epilepticus［M］. CRC Press：Boca Raton，1998.95-102.

［9］ Lemos T，Cavalheiro EA.Suppression of pilocarpine induced status epilepticus and the late development of epilepsy in rats［J］. Exp Brain Res，1995，102（3）：423-428.

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）03-0243-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.005

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金（NO.81371452）；重慶市科委自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2013jjB0031）；教育部博士點(diǎn)基金課題（20125503110011）。

［作者簡(jiǎn)介］韓慰（1990-），女，研究生，研究方向：小兒神經(jīng)疾病Email：hanweitqx@126.com

［通訊作者］蔣莉（1964-），女，教授，研究方向：小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病Email：dr_jiangli@126.comcose level was significantly decreased in the SE rats，and ORS gavage made the blood glucose returning to normal in the SE rats.（4）ORS gavage apparently decreased the mortality rate of young and adult groups during the 72 hours after seizure onset.Conclusions ORS gavage effectively reduces the mortality of SE rats，and is an effective method to improve the survival of SE rats.

Corresponding author：Jiang Li，Email：dr_jiangli@126.com

［收稿日期］2015-12-29

Mortality of rat models of LiCl-pilocarpine-induced status epilepticus can be reduced by oral rehydration salt solution

HAN Wei，JIANG Li*，HE Rong，SONG Xiao-jie，CHENG Li
（Department of Neurology，Children Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China）

【Abstract】Objective To explore a new method of reducing the mortality of rat models of LiCl-pilocarpine-induced status epilepticus（SE）by oral gavage of rehydration salts（ORS）liquid.Methods Forty-five young SD rats（20-dayold）and 30 adult SD rats（60-day-old）were enrolled in this study.They were randomly divided into five groups：the adult SE rats received ORS gavage（adult SE+ORS），adult SE rats（adult SE）and young SE rats received ORS gavage（young SE+ORS），young SE rats（young SE）and young blood glucose group.Seizures were induced in both young and adult SE groups with i.p.LiCl-pilocarpine was injected i.p.to induce SE，which was interrupted by diazepam at 60 minutes after SE onset.ORS gavage was conducted in all the ORS groups in different doses according to their ages at 1 hour，12 hours or 24 hours after the onset of SE.The other groups were not given any treatment.The latency of seizure onset，changes in body weight，level of blood glucose at 8 hours after SE onset and finally the death rate of the rats were recorded.Results （1）The body weight of the rats with seizures was reduced by 5%-8%.（2）The mortality rate of the SE groups was high，especially at 24 hours after the SE onset，which was 40%in the young group and 57%in the adult group.（3）The blood glu-

【Key words】LiCl-pilocarpine；Statue epilepticus；Rat；Mortality