楊 陽，劉光澤，李秀梅，孔祥平，顧為望

（1.南方醫(yī)科大學比較醫(yī)學研究所暨實驗動物中心，廣州 510515；2.解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602）

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HBV轉基因小鼠尿液中乙肝病毒相關指標的分析

楊 陽1，2，劉光澤2，李秀梅2，孔祥平2，顧為望1

（1.南方醫(yī)科大學比較醫(yī)學研究所暨實驗動物中心，廣州 510515；2.解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602）

【摘要】目的 檢測分析HBV轉基因小鼠尿液中HBV相關指標表達情況，進一步認識轉基因小鼠的生物學特性；并通過多種實驗方法確定尿液中HBV相關指標的組織來源。方法 使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和熒光定量PCR（real-time PCR）檢測轉基因小鼠尿液中HBV相關指標；并通過水動力轉染的小鼠實驗、RNA干擾方法抑制HBV表達轉基因鼠實驗、乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實驗等多種實驗方法確定其復制表達組織來源。結果 HBV轉基因小鼠尿液中存在HBsAg、HBeAg、及HBV-DNA表達，其中HBsAg的表達水平較高（6674± 619.8 IU/mL），但低于血清中HBsAg的表達水平（16470±2704 IU/mL），尿液HBsAg雄性小鼠的表達水平高于雌性小鼠；而尿液HBeAg表達水平較低，且尿液中HBeAg的陽性率高于血液，HBeAg的表達水平個體間和性別間有明顯差異；尿液中存在HBV-DNA含量達到103～105copy/mL；未檢測到相關抗體表達。通過水動力轉染等實驗表明轉基因鼠尿液中的HBV相關指標來源于腎臟的復制表達，而不是由肝臟分泌進入血液循環(huán)以尿液排出，腎臟是HBV獨立的表達場所。結論 轉基因小鼠尿液中存在HBV相關指標的表達，并隨月齡長期表達，其中HBsAg及HBV-DNA表達水平較高且比較穩(wěn)定，雄性小鼠尿液HBsAg的滴度高于雌性小鼠；HBeAg雄性鼠表達水平相對雌性鼠較高且比較穩(wěn)定；尿液中無各類抗體表達；腎臟也是HBV獨立的復制表達場所。

【關鍵詞】肝炎病毒，乙型；轉基因小鼠；模型，動物；尿液；生物學特性

目前轉基因小鼠在乙型肝炎的研究中得到了廣泛地應用，綜合國內外相關文獻表明［1-5］，HBV轉基因小鼠體內表達的組織特異性及與病毒元件和細胞內轉錄活性子的相互作用有關。此外，其它還有許多因素影響轉錄，包括激素、組織特異性轉錄子及各種修飾細胞在轉錄及轉錄后水平相互作用均影響轉基因表達。轉基因小鼠出生前就能在內源性HBV啟動子的控制下，主要在肝臟內持續(xù)轉基因表達?？祼劬龋?］觀察血清HBsAg為陽性的15只小鼠，肝組織有HBsAg的存在，且HBsAg的分布呈胞質型，但不存在于脾、肺、心等組織中。Burk RD也有報道只有在肝和腎有 HBV基因表達［7］。Chisari實驗室［8］和我們實驗室建立1.3拷貝全基因HBV轉基因鼠模型［9］，只有在肝和腎組織有HBsAg/HBcAg表達，免疫組化陽性，但對腎組織進行HBV基因表達特性及與肝、外周血乙肝病毒指標關系等缺少相關研究報道。本實驗室的HBV轉基因小鼠，已廣泛應用于HBV的復制、表達及小型實驗動物中的免疫發(fā)病機制研究，同時也是篩選和評價抗HBV藥物理想工具［9，10］。對該轉基因小鼠進行更深入生物學特性研究時，我們發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠的尿液也有HBV相關指標的表達復制，為此展開了對轉基因小鼠泌尿系統(tǒng)的研究。本研究對進一步深入了解HBV轉基因小鼠的生物學特性有重要意義，豐富了轉基因小鼠生物學特性研究的內容，為1.3copyD基因型HBV轉基因小鼠實際應用于臨床前藥物評價時提供更多的理論依據(jù)，而且目前國內外未見相關方面的研究報道。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級血清HBsAg檢測陽性的1.3copyD基因型HBV轉基因小鼠【SCXK（軍）2012-0018】，由本科研室提供。

SPF級C57BL/6小鼠12只（18～20）g，均為雄性鼠【SCXK（粵）2013-0002】，BAL B/c小鼠6只（18～20）g，雌雄各半【SCXK（粵）2013-0002】購于廣東省實驗動物中心，分別用于1.3.2水動力轉染的小鼠實驗和1.3.4乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實驗。

SPF級 1.3copyD基因型 HBV轉基因小鼠（HBsAg測定值吸光度相近）10只（18～20）g，均為雄性，用于1.3.3 RNA干擾方法抑制HBV表達轉基因鼠實驗。

以上實驗動物均飼養(yǎng)于解放458醫(yī)院實驗動物中心SPF飼養(yǎng)設施【SYXK（軍）2012-0059】。動物自由進食進水，室內溫度：（23～25）℃，相對濕度：（55±10）%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)奏。購買的實驗小鼠適應環(huán)境1周進行實驗。

1.2 實驗試劑

HBsAg、HBeAg、抗HBeAg、抗HBsAg、抗HBcAgELISA檢測試劑盒購自上海科華生物公司，HBsAg、HBcAg免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，Omega組織DNA抽提試劑盒購自廣州飛揚生物工程有限公司。

目的質粒PCDNA3.1（+）-1.3 HBVC，由302醫(yī)院徐東平教授惠贈。目的質粒 pU6-siHBVll （HBV特異性的shRNA表達載體），由本科研室提供。乙肝患者HBV陽性血清，于本院采集。

1.3 動物實驗

1.3.1 轉基因小鼠尿液、血清ELISA酶聯(lián)檢測及HBV-DNA定量檢測：用玻璃采血管通過眼眶后靜脈叢采血，5 000 r/min離心10 min。將分離血清收集于0.5 mL無菌EP管內，置于-20℃凍存。行按壓膀胱法采集尿液，5 000 r/min離心5 min，置于4℃保存（尿液 4℃存放時間不超過 48 h）。按ELISA試劑盒說明分別進行 HBsAg、HBeAg、抗HBeAg、抗HBsAg、抗HBcAg檢測（其中HBsAg血清和尿液樣本取原液和1/5 000稀釋兩種），并進行結果判定。

取保存的尿液和血清樣本進行real-time PCR檢測HBV-DNA的表達。

1.3.2 水動力轉染的小鼠實驗：取實驗C57BL/6小鼠隨機分為實驗組（10只）和對照組（2只），將目的質粒PCDNA3.1（+）-1.3HBVC溶于生理鹽水中，生理鹽水的體積為小鼠體重的10%，通過水動力轉染方法初步建立HBV轉染C57BL/6小鼠模型［11-17］。在注射結束后7 d采集實驗小鼠血清和尿液進行 HBsAg、HBeAg、HBV-DNA檢測，方法同前。

1.3.3 RNA干擾方法［18-22］抑制HBV表達轉基因鼠實驗：取實驗1.3copyD基因型HBV轉基因小鼠隨機分為實驗組和對照組（各5只），將目的質粒pU6-siHBVll溶于生理鹽水中，生理鹽水的體積為小鼠體重的10%，采用水動力轉染方法進行質粒注射［11-17］。在注射結束后5 d采集實驗小鼠血清和尿液進行HBsAg檢測（樣本進行1/1 600稀釋），方法同前。

1.3.4 乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實驗：取實驗BAL B/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射人HBV陽性血清［11-17］。在注射結束后2 d采集實驗小鼠血清和尿液進行HBsAg、HBeAg、HBV-DNA定量檢測，由本院檢驗中心完成。

1.3.5 轉基因小鼠腎臟、膀胱免疫組化特性及病理觀察：斷頸處死血清HBsAg陽性的轉基因小鼠8只（雌性4只，雄性4只）和正常小鼠2只（雌性1只，雄性1只）取腎臟、膀胱。以10% 中性甲醛固定48 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。按免疫組化試劑盒操作說明檢測轉基因小鼠腎臟、膀胱中HBsAg、HBcAg的表達情況。

1.3.6 轉基因小鼠腎臟、肝臟 HBV-DNA定量檢測：斷頸處死血清HBsAg陽性的轉基因小鼠26只取腎臟、肝臟。按組織DNA抽提試劑盒操作說明進行肝臟、腎臟組織DNA提取，并進行real-time PCR檢測HBV-DNA，分析腎臟和肝臟HBV-DNA的陽性率及復制水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HBV相關指標檢測結果

ELISA檢測結果顯示轉基因小鼠尿液中可檢測到HBsAg、HBeAg，以血清HBsAg陽性為基數(shù)尿液HBsAg陽性率達100%、HBeAg達66.99%，未檢測到相關抗體（HBsAb、HBeAb、HBcAb）；血液中可檢測到HBcAb，且陽性率達100%。Real-time PCR結果顯示尿液和血液中存在HBV-DNA的復制，拷貝數(shù)可達103～105（表1）。

2.2 轉基因小鼠尿液中HBsAg滴度特點

對血清HBsAg陽性的轉基因小鼠120只（雌性60只，雄性60只）尿樣進行ELISA分析，樣本做1/ 5 000稀釋，檢測尿液和血清中HBsAg的陽性率的關系及表達水平的高低。結果發(fā)現(xiàn)，尿液和血清中HBsAg的陽性率均為100%，但血清比尿液滴度高（表1），具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），且主要由于雌鼠尿液HBsAg滴度過低導致（圖1）。雌性轉基因鼠尿液HBsAg滴度低于血液，具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.0001），雄性轉基因鼠尿液與血液滴度相當（圖1），不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。尿液雄性小鼠比雌性小鼠滴度高（圖1），具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001），血清雄性小鼠比雌性小鼠滴度略高（圖1），但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明，轉基因小鼠尿液中HBsAg的含量與性別有關，雄性高于雌性。

2.3 轉基因小鼠尿液中HBeAg表達特點

2.3.1 轉基因小鼠尿液中HBeAg陽性率及與性別關系：對血清HBsAg陽性的轉基因小鼠541只（雌性291只，雄性250只）進行ELISA分析檢測尿液和血清中HBeAg的陽性率及與性別關系。結果發(fā)現(xiàn)，尿液 HBeAg陽性率為 66.99%，血清為9.17%。雌鼠尿液和血清陽性率分別為48.17%、8.66%，雄鼠尿液和血清陽性率分別為87.84%、9.8%。（表2）統(tǒng)計學分析表明，尿液和血液陽性率的差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；雌性小鼠和雄性小鼠血清HBeAg陽性率的差別不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但雌性小鼠和雄性小鼠尿液HBeAg陽性率的差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。

2.3.2 轉基因小鼠尿液中HBeAg表達滴度水平及性別的影響：對尿液HBeAg陽性的轉基因小鼠209只（雌性79只，雄性130只）進行A值比較分析，結果發(fā)現(xiàn)雄性小鼠比雌性小鼠滴度高（圖2），具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。這表明，轉基因小鼠血清中HBeAg的含量與性別有關，雄性鼠HBeAg滴度高于雌性鼠，且可長期穩(wěn)定表達，隨月齡變化滴度水平變化不顯著。

2.4 轉基因小鼠尿液中HBV-DNA的復制水平

對血清HBsAg陽性的轉基因小鼠30只進行real-time PCR檢測分析尿液和血清中HBV-DNA的陽性率及復制水平。結果發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性率尿液和血清陽均為100%，拷貝數(shù)達103～105。統(tǒng)計學分析表明，轉基因小鼠尿液和血清HBV-DNA復制水平的差別不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

為確定HBV轉基因鼠尿液中乙肝病毒指標組織來源，我們又進一步進行了下面項目的實驗研究。

2.5 水動力轉染HBV的小鼠實驗結果

對所有實驗小鼠進行ELISA分析和real-time PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠血清、尿液未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA。實驗組的小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中則有檢測到，且處于高水平。表明HBV質粒經(jīng)水動力可以轉染到正常鼠肝細胞內進行復制表達，并且相關蛋白可以釋放進入血液，但血液中的HBV相關指標正常情況下不能通過腎小球濾過進入尿液中。

2.6 RNA干擾方法抑制HBV表達轉基因鼠實驗結果

對所有實驗轉基因小鼠于實驗前和試驗后5 d進行ELISA分析檢測血清和尿液HBsAg的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，RNAi組血清HBsAg的表達水平變化明顯，HBsAg平均A值同對照組相比大幅降低（圖3），具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）；但尿液中RNAi組和對照組HBsAg的滴度沒有明顯改變，差別不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。表明 RNAi在hydrodynamic肝臟靶向性的作用下能夠抑制轉基因小鼠肝細胞內HBV的表達，進而影響血液中HBV相關指標的滴度，但影響不了轉基因鼠尿液中HBV相關指標的滴度。這表明HBV轉基因鼠血液中HBV相關指標的顯著變化并沒有影響其尿液中HBV相關指標。

2.7 乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實驗結果

表1 HBV相關指標檢測結果Tab.1 Detection of HBV-related indexes in the blood and urine

表2 轉基因小鼠血液和尿樣中HBeAg陽性率比較Tab.2 Comparison of HBeAg positive rates in the blood and urine of transgenic mice

對所有實驗小鼠進行ELISA分析和 real-time PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射人HBV陽性血清的小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中則有檢測到，且處于較高水平。表明血液中的HBV相關指標不能通過腎小球濾過進入尿液中，進一步表明HBV轉基因鼠血液和尿液中HBV相關指標來源于兩個獨立的復制表達體系。

A：雌性鼠尿液和血清中HBsAg滴度，B：雄性鼠尿液和血清中HBsAg滴度，C：雌雄性轉基因小鼠尿液HBsAg表達水平，D：雌雄性轉基因小鼠血清HBsAg表達水平圖1 轉基因小鼠尿液和血清中HBsAg的陽性率和滴度水平比較（均以1/5 000稀釋樣本）Figure A shows HBsAg titer in urine and serum of female mice；Figure B shows HBsAg titer in urine and serum of male mice；Fig.C shows HBsAg expression level in the urine of female transgenic mice；Fig.D shows HBsAg expression level in the serum of female transgenic mice.Fig.1 Comparison of HBsAg positive rate and titer level in the urine and serum of transgenic mice（1/5 000 diluted samples）

A：不同性別轉基因小鼠尿液HBeAg，B：不同性別轉基因小鼠尿液HBeAg滴度隨月齡的變化。圖2 轉基因小鼠尿液中HBeAg陽性A值與各月齡HBeAg陽性結果A值Figure A shows the urine HBeAg in the male and female transgenic mice；Figure B shows changes along with age in month of urine HBeAg titer in the male and female transgenic mice.Fig.2 HBeAg positive A value in the urine of transgenic mice at each age in months.

（A：對照組和RNAi組血清HBsAg的A值，B：對照組和RNAi組尿液HBsAg的A值）圖3 對照組和RNAi組血清和尿液HBsAg中的A值比較（均以1/1 600稀釋樣本）Figure A shows HBsAg A values in the urine of control and RNAi groups.Figure B shows HBsAg A values in the urine of control and RNAi groups.Fig.3 Comparison of A values of HBsAg in the serum and urine between control group and RNAi group（1/5 000 diluted samples）.

A、B：腎臟HBsAg免疫組化，C、D；腎臟HBcAg免疫組化圖4 轉基因小鼠腎臟HBsAg、HBcAg免疫組化A，B：Kidney，HBsAg staining.C，D：Kidney，HBcAg staining.Fig.4 The expression of HBsAg and HBcAg in kidney tissues of the transgenic mice.Immunohistochemical staining.

2.8 轉基因小鼠腎臟、膀胱組織HE染色及免疫組化結果

血清HBsAg陽性的轉基因小鼠和正常小鼠進行腎臟、膀胱組織經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其腎臟和膀胱組織的形態(tài)、結構無明顯的病理改變。轉基因小鼠腎臟、膀胱組織HBsAg、HBcAg免疫組化檢測結果顯示腎臟有HBsAg、HBcAg的表達（圖4），其中HBsAg的以胞漿型為主分布于靠近腎髓質區(qū)的腎皮質區(qū)；HBcAg多呈核型分布于腎臟髓質區(qū)。膀胱中均未檢測到 HBsAg、HBcAg的表達。

2.9 轉基因小鼠腎臟中HBV-DNA的復制表達水平

血清HBsAg陽性的轉基因小鼠腎臟、肝臟組織HBV-DNA定量PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性率尿液和血清陽均為100%，拷貝數(shù)達105～107。統(tǒng)計學分析表明，轉基因小鼠腎臟和肝臟組織HBV-DNA復制水平的差別不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究對該轉基因小鼠尿液中HBV相關指標進行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠尿液中存在HBsAg、HBeAg、及 HBV-DNA，未檢測到 HBsAb、HBeAb、HBcAb的存在。其中HBsAg的表達水平較高，血清中HBsAg的表達水平高于尿液中HBsAg的表達水平，尿液HBsAg雄性小鼠的表達水平高于雌性小鼠；而血液HBeAg表達水平低與尿液且尿液中HBeAg的陽性率高于血液，HBeAg的表達水平個體間和性別間有明顯差異，雄性小鼠HBeAg的表達水平高于雌性小鼠；尿液中存在HBV-DNA含量達到103～105copy/mL。轉基因小鼠年尿液中 HBsAg、HBeAg的含量與性別有關，雄性高于雌性，主要是由于HBV基因的表達受到雌激素和雄激素的共同作用，雌激素能抑制 HBV轉錄和 HBV-DNA復制［23］。A1omg等［24］發(fā)現(xiàn)，雌激素能抑制雄性鼠HBV-DNA的表達，還能抑制HBsAg的合成，補充雌激素可抑制雄性鼠HBeAg的產(chǎn)生，對雌性鼠HBVDNA表達的作用甚微。

腎小球濾過膜具有一定的“有選擇性”的通透性，分子半徑小于14 nm通過濾過膜不受限制；半徑大于20 nm濾過則受到一定限制，半徑大42 nm則不能通過。而且濾過膜所帶電荷對其通透性有很大影響，帶負電荷的分子不易通過。HBsAg的分子大于42 nm且?guī)ж撾姾?，因此不能通過腎小球濾出；HBeAg及其所形成的復合物分子小于14 nm但因其是帶負電荷，所以也不能夠通過腎小球濾出［25］。本研究通過不同實驗方法表明血液中HBV相關指標不能通過腎小球的濾過進入尿液，尿液中HBV相關指標的表達情況不受血液變化的影響，腎臟是HBV的獨立的表達復制場所。

本研究使用正常小鼠通過水動力轉染方法建立HBV急性轉染模型，使目的質粒在肝臟獲得高水平的復制表達，分泌HBV相關指標入血，在造模小鼠尿液中未檢測到HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，而血清中能檢測到，且處于高水平表達，表明血液中的HBV相關指標正常情況下不能通過腎小球濾過進入尿液中。接著，選取HBV轉基因小鼠采用水動力轉染方法將肝臟作為靶器官，使shRNA表達質粒被肝細胞攝取從而對HBV轉基因小鼠HBV產(chǎn)生抑制作用，導致血清中HBsAg減少，而不影響尿液中HBsAg，反過來表明血液中HBV相關指標的表達對尿液中的沒有影響。最后，我們進行了乙肝患者HBV陽性血清感染正常小鼠實驗，也進一步表明血液中的HBV相關指標不能通過腎小球濾過進入尿液中。上述實驗結果表明，血液和尿液中HBV相關指標來源于兩個獨立的復制表達體系。

而且HBV并非嚴格的嗜肝病毒，目前已有研究證實HBV可以在包括腎臟在內的多種肝外組織復制［26］。在對本研究HBV轉基因小鼠前期的生物學特性研究中也表明乙肝病毒基因在HBV轉基因小鼠腎臟具有較高水平轉錄［9］。同時，HBV轉基因小鼠的腎組織形態(tài)、結構無明顯的病理改變，表明轉基因小鼠尿液中的出現(xiàn)HBV相關指標并非由于腎臟病變所致；腎組織檢測到 HBsAg、HBcAg （HBsAg的以胞漿型為主分布于靠近腎髓質區(qū)的腎皮質區(qū)，HBcAg多呈核型分布于腎臟髓質區(qū)）表明腎臟本身存在HBV相關指標的復制表達，這進一步加深我們對乙型肝炎病毒的認識。

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〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0053-08

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.011

［基金項目］國家科技重大專項課題—艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治—HBV細胞和動物模型的建立和應用（課題編號：2012ZX10004503010）.

［作者簡介］楊陽（1987-），女，碩士，實驗動物技術研究。E-mail：yangya726@qq.com。

［通訊作者］顧為望（1656-），男，教授，研究方向：從事比較醫(yī)學研究。E-mail：guww@163.com；劉光澤（1962-），男，主任技師，研究方向：疾病基因工程動物模型的制備和應用研究，E-mail：lgze68@163.com。lower than that in the serum（16470±2704 IU/mL）.The level of HBsAg expression in the urine of male mice was higher than that in female mice.The level of HBeAg expression in the urine was lower and the HBeAg positive rate of urine was higher than that of blood，and the levels of HBeAg expression showed significant inter-individual and inter-sexual differences.HBV-DNA level reached 103-105copy/mL in the urine，but no related antibody expression was detected.The experiments such as hydrodynamic infection test indicated that the HBV-related indexes in the urine are derived from replication in the kidneys rather than secreted from the liver，entered into the blood circulation，and discharged from the urine.The kidneys are an independent expression site of HBV.Conclusions The expression of HBV-related indexes is present in the urine of transgenic mice and it is a long-term expression along with the age in months，of which the expression levels of HBsAg and HBV-DNA are rather high and stable.HBsAg titer in the urine of the male mice is higher than that of female mice.HBeAg expression level in the male mice is more stable compared with that in female mice.No expressions of various kinds of antibodies have been found in the urine.The kidneys are an independent expression site of HBV.

Analysis of hepatitis B virus-related indexes in the urine of HBV transgenic mice

YANG Yang1，2，LIU Guang-ze1，LI Xiu-mei2，KONG Xiang-ping2，GU Wei-wang1
（1.Institute of Comparative Medicine&Center of Experimental Animals，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Liver Disease Center of PLA，No.458 Hospital of PLA，Guangzhou 510602）

【Abstract】Objective To detect and analyze the HBV-related indexes in the urine of HBV transgenic mice and further understand the biological characteristics of transgenic mice，and to clarify the tissue sources of HBV-related indexes.Methods HBV-related indexes in the urine of transgenic mice were tested using enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）and fluorescence quantitative PCR（real-time RCR）.The tissue sources were confirmed by several experiments，i.e.hydrodynamic transfection of mice，RNA interference to inhibit HBV-expression in the transgenic mice，and to infect normal mice with HBV-positive serum from patients.Results Expression of HBsAg，HBeAg and HBV-DNA was present in the urine of transgenic mice，of which the HBsAg expression level was high（6674±619.8 IU/mL），but

【Key words】Hepatitis B virus；Transgenic mice；Model，animal；Urine；Biological indexes